番茄種傳病原多重pcr檢測試劑盒及其檢測方法

2024-02-25 23:35:15

番茄種傳病原多重pcr檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明屬於生物【技術領域】，涉及一種番茄病害的檢測方法，主要針對番茄的三種重要種傳病原馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒和菸草環斑病毒的同時檢測。一種番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒，番茄種傳病原為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或菸草環斑病毒，其主要特點在於包括以下組分：RT-PCR?buffer；馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上下遊引物，鳳果花葉病毒PepMV上下遊引物，菸草環斑病毒TRSV上下遊引物；反轉錄酶及DNA聚合酶Mix；無RNA酶的去離子水；馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒和菸草環斑病毒無侵染活性的陽性對照。本發明的優點是能同時檢測番茄3種重要種傳病原，快速準確，避免了常規PCR檢測的重複操作。
【專利說明】番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】[0001]本發明屬於生物【技術領域】，涉及一種番茄病害的檢測方法，主要針對番茄的3種重要種傳病原馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒和菸草環斑病毒的同時檢測。
【背景技術】[0002]番茄病毒病是由多種病毒引起的重要病害，是番茄上發生最普遍、最難防治的病害之一，分布於世界各番茄產地。馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒和菸草環斑病毒均可引起番爺病毒病。馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potato spindle tuber viroid, PSTVd)是我國進境植物檢疫性有害生物，在中國局部分布於黑龍江、江蘇、河北和青海，主要寄主為馬鈴薯、番茄和鱷梨，還能感染其它植物，包括辣椒、甘薯、茄、茄屬觀賞植物、龍葵、曼陀羅屬、素馨茄、燈籠果、人參果、矮牽牛屬植物等。類病毒是無蛋白質外殼保護的游離的共價閉合環狀單鏈RNA分子，侵入宿主細胞後自我複製，具有高度的侵染活性，50~100分子的類病毒可以引起成功的侵染,並使宿主致病或死亡。鳳果花葉病毒(Pepino mosaic virus,PepMV)為馬鈴薯X病毒(Potexvirus)屬病毒,最初發現於鳳果(又稱人參果、香瓜爺)上，可侵染番茄、茄子、菸草和馬鈴薯等茄科作物及莧屬雜草、小花錦葵、粉藍菸草、龍葵、羅勒和苦苣菜。番茄受侵染後葉部出現黃斑，葉脈輕微枯萎，有時畸形，果實表面通常有斑點，植物矮小並扭曲。PepMV主要分布在秘魯、荷蘭和英國，對歐洲及美洲的番茄生產造成了毀滅性影響，被歐洲及地中海植物保護組織(EPPO)列於警戒目錄，我國尚無分布情況的報導。菸草環斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)為βΧ?花葉病毒科(Comoviridae)線蟲傳多面體病毒屬(Nepovirus)的成員，可侵染番爺等54科246種草本和木本植物,在植物上引起環斑等症狀，是我國進境植物檢疫性有害生物。該病毒通過線蟲、機械接種和種子等途徑傳播，在多種多年生植物及種子上越冬，成為來年的初侵染來源，種子傳播是TRSV遠距離傳播的主要途徑。PSTVd、PepMV和TRSV均可侵染番茄，具有寄主範圍廣泛、可通過種子傳播、傳播途徑多樣的特點，一旦隨生產性引種傳入、擴散和蔓延，將對番爺生產構成嚴重障礙，對我國的生態安全、農業生產的正常發展造成嚴重影響。
[0003]目前番茄病毒病和類病毒病的主要檢測方法有生物學測定、血清學測定、電子顯微鏡技術和分子生物學技術。生物學測定方法的鑑別寄主法簡單易行，反應靈敏，但工作量比較大，常常受溫室條件和時間的限制，加之症狀反應常受環境、土壤和氣候條件的影響，在一定程度上制約了鑑別寄主方法的應用。採用ELISA方法檢測植物病毒，操作過程簡便、快捷，但由於交叉反應等問題，可能出現假陽性。利用電子顯微鏡檢測病毒，可直接觀察病毒的大小、形態，但存在設備昂貴，技術要求高，準確性和靈敏度較低的弱點。對PSTVd而言，其侵染植物隱症現象比較普遍，症狀表現受環境溫度的影響較大，有的鑑別植物對不同類病毒的反應症狀相似，所以難於應用生物學方法進行診斷；類病毒不產生蛋白質，無法使用血清學方法檢測。分子生物學技術與血清學方法相比較，不需要製備抗體，檢測所需的病毒量少，具有靈敏、快速、特異性強等優點，已成功地用於各種病毒的快速檢測。由於常規PCR技術一次只能擴增一個模板，如果反應體系中含有兩種以上的病原物，則需進行多次PCR，不但操作複雜，而且費用高，耽誤時間。多重PCR方法使用多對引物，可在一個反應中擴增多種靶序列，其優點是可以在一種樣品中同時鑑別多種病毒，並將PCR的敏感性和快速性結合起來，避免了逐一擴增待測樣品中每種病原的麻煩，可提高診斷的敏感性，同時降低檢測費用。
[0004]目前PSTVd、PepMV和TRSV已建立單一 RT-PCR分子檢測技術，但尚未見這3種重要種傳病原的多重PCR檢測方法的報導。建立穩定靈敏的多重PCR技術，可實現在同一反應管中同時對PSTVd、PepMV和TRSV三種病原進行鑑別檢測，提高檢測準確性，縮短檢測周期，降低檢測成本，降低病原物種傳的危險性，為農業生產安全和制種業發展提供技術保障。

【發明內容】

[0005]本發明的目的提供一種番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒，番茄種傳病原為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或菸草環斑病毒。
[0006]本發明的又一目的提供一種番茄種傳病原多重PCR檢測方法。番茄3種重要種傳病原的多重PCR檢測方法，它是在PSTVd、TRSV和P印MV單一 RT-PCR檢測體系的基礎上，建立能同時檢測這三種病原的多重PCR檢測方法，適合田間樣品和種子的測定。
[0007]為實現上述目的，本發明的技術方案是一種番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒，番茄種傳病原為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或菸草環斑病毒，其主要特點在於包括以下組分:
[0008]RT-PCR buffer, 2 X RT-PCR buffer, 100-250 μ L ；RT-PCR 擴增引物為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上遊引物，濃度為10 μ mol/L，10-30 μ L ;馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd下遊引物，濃度為10 μ mol/L，10-30 yL;鳳果花葉病毒P印MV上遊引物，濃度為10 μ mol/L，10-30 μ L ;鳳果花葉病毒P印MV下遊引物，濃度為10 μ mol/L，10-30 μ L ;菸草環斑病毒TRSV上遊引物，濃度為10 μ mol/L, 10-30 μ L ;菸草環斑病毒TRSV下遊引物，濃度為10 μ mol/L, 10-30 μ L ;反轉錄酶及DNA聚合酶Mix，20 μ L ;無RNA酶的去離子水，100 μ L-1mL ;陽性對照，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd、鳳果花葉病毒PepMV和菸草環斑病毒TRSV無侵染活性的陽性對照各20-60 μ L0
[0009]所述的番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒，所述的RT-PCR擴增引物為:
[0010]馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上遊引物為:5' -ATTCCCGCCGAAACAGG-3'；
[0011]PSTVd 下遊引物為:5' -CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3'；
[0012]鳳果花葉病毒P印MV 上遊引物為:5' -ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3'；
[0013]P印MV 下遊引物為:5' -AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3'；
[0014]菸草環斑病毒TRSV 上遊引物為:5' -CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3'；
[0015]TRSV 下遊引物為:5' -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3'。
[0016]一種番爺種傳病原多重PCR檢測方法,其主要特點在於包括有:
[0017]I)總核酸提取:
[0018]2) RT-PCR 反應體系為 50 μ L，其中 2 X RT-PCR buffer25 μ L，RT/TaqMixl.0-2.0 μ L，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上下遊引物10 μ mol/L各0.6-1.6 μ L，鳳果花葉病毒P印MV上下遊引物10 μ mol/L各0.2-1.0 μ L，菸草環斑病毒TRSV上下遊引物10 μ mol/L各0.2-1.0yL,總RNA模板2.5-8 μ L,滅菌去離子水補足反應總體積；[0019]3) RT-PCR反應條件為:
[0020]cDNA 合成:50°C 30min, I 個循環；
[0021]PCR 擴增:94°C預變性 3min ;94°C變性 30s，50°C退火 45s，72°C延伸 lmin，35 個循環；最後72°C延伸IOmin ；
[0022]4 ) RT-PCR擴增產物電泳檢測:
[0023]用TAE電泳緩衝液製備1.5%瓊脂糖凝膠，在室溫下進行水平電泳。加10 μ LPCR擴增產物，以健康番茄總核酸的反轉錄PCR產物為陰性對照，以DLlOOOMarker為標準分子量；100V/80mA下電泳30min，用SYBR Safe代替EB染色，用凝膠成像系統觀察並拍照，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒擴增產物為一條163bp的條帶，鳳果花葉病毒擴增產物為一條625bp的條帶，菸草環斑病毒擴增產物為一條348bp的條帶。
[0024]所述的番茄種傳病原多重PCR檢測方法，所述的核酸提取包括有如下步驟:
[0025](I)取感染馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或菸草環斑病毒的番茄葉片；稱取0.1g感染病毒樣品組織倒在潔淨的研缽內，加液氮研磨成粉末狀；
[0026](2)移入1.5mL離心管中，然後加入ImL的TRIzol，劇烈振蕩3min以上；
[0027](3)在4°C下，12000rpm離心IOmin以除去不溶成分,將上清液轉入另一新的1.5mL離心管中；
[0028](4)在室溫下靜置5min，加0.2mL氯仿/mL TRIzol，劇烈振蕩15s，然後在室溫下靜置15min,再於4°C、12000rpm的條件下離心15min ；
[0029](5)將上層水相轉移到新的1.5mL離心管中，加0.5mL異丙醇/mLTRIzol，上下顛倒混勻，室溫靜置15min ；
[0030](6) 4?、12000rpm 離心 IOmin ;
[0031](7)棄上清，加入75%的乙醇洗滌沉澱，然後4°C、7500rpm離心2min，棄乙醇；
[0032](8)沉澱在室溫下乾燥IOmin或在冷凍離心濃縮機上濃縮5min，加入30 μ L無RNase水溶解，_70°C保存備用。
[0033]本發明根據PSTVd和P印MV的保守序列區設計了檢測引物，選用一對已報導的TRSV引物，建立並優化了多重RT-PCR反應體系和反應程序。
[0034]有益效果:本發明能同時檢測番茄3種重要種傳病原，快速準確，避免了常規PCR檢測的重複操作。利用該檢測方法能特異擴增出馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒和菸草環斑病毒的基因片段，且最低能檢測到Iyg的總核酸模板，檢測的穩定性好，特異性強，一致性高，可用於PSTVd、PepMV和TRSV的同時早期診斷和田間病原調查，實現了番茄多種病毒病和類病毒病的高效快速檢測，有利於摸清田間3種病害發生狀況，可為健康番茄種子的調運等提供有效的監控手段，確保番茄生產安全，還對番茄其它病原的檢測具有一定的參考價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為一步法多重PCR電泳圖譜。M:100bp DNA分子量標準；1:3種病原核酸抽提混合液；2:鳳果花葉病毒；3:菸草環斑病毒；4:馬鈴薯紡錘塊莖類病毒；5:陰性對照。
[0036]圖2為多重PCR靈敏度測試分析的電泳圖譜。MilOObp DNA分子量標準；1:3種病原核酸抽提混合液；2:1O1倍梯度稀釋；3:1O2倍梯度稀釋；4:1O3倍梯度稀釋；5:1O4倍梯度稀釋；6:陰性對照。
[0037]圖3感病樣品進行多重PCR電泳圖譜。M: IOObp DNA分子量標準；1:3種病原核酸抽提混合液；2，4:感染馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的番茄樣品；3，5:感染菸草環斑病毒的番茄樣品；6:感染鳳果花葉病毒的番茄樣品；7:陰性對照。
【具體實施方式】
[0038]以下對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。所述【技術領域】的普通技術人員依據以上本發明公開的內容和各參數所取範圍，均可實現本發明的目的。
[0039]實施例1:一種番爺種傳病原多重PCR檢測試劑盒,番爺種傳病原為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或菸草環斑病毒，其包括以下組分:
[0040]RT-PCR buffer, 2 X RT-PCR buffer，250 μ L ;RT_PCR 擴增引物為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上遊引物，濃度為10 μ mol/L, 30 μ L ;馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd下遊引物，濃度為10 μ mol/L，30 μ L ;鳳果花葉病毒P印MV上遊引物，濃度為10 μ mol/L，30 μ L ;鳳果花葉病毒P印MV下遊引物，濃度為10μπιΟ1/1，30μ L ;菸草環斑病毒TRSV上遊引物，濃度為ΙΟμπιοΙ/L,30μ L ;菸草環斑病毒TRSV下遊引物，濃度為ΙΟμπιοΙ/L,30μ L ;反轉錄酶及DNA聚合酶Mix，20 μ L ;無RNA酶的去離子水，ImL ；陽性對照，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd、鳳果花葉病毒PepMV和菸草環斑病毒TRSV無侵染活性的陽性對照各60 μ L。
[0041]所述的RT-PCR擴增引物為:
[0042]馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上遊引物為:5' -ATTCCCGCCGAAACAGG-3'；
[0043]PSTVd 下遊引物為:5' -CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3'；
[0044]鳳果花葉病毒P印MV 上遊引物為:5' -ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3'；
[0045]P印MV 下遊引物為:5' -AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3'；
[0046]菸草環斑病毒TRSV 上遊引物為:5' -CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3'；
[0047]TRSV 下遊引物為:5' -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3'。
[0048]實施例2:—種番爺種傳病原多重PCR檢測試劑盒,番爺種傳病原為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或菸草環斑病毒，其包括以下組分:
[0049]RT-PCR buffer, 2 X RT-PCR buffer, 100 μ L ；RT-PCR 擴增引物為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上遊引物，濃度為10 μ mol/L, 10 μ L ;馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd下遊引物，濃度為10 μ mol/L，10 μ L ;鳳果花葉病毒P印MV上遊引物，濃度為10 μ mol/L, 10 μ L ；Μ果花葉病毒P印MV下遊引物，濃度為ΙΟμπιοΙ/L，10 μ L ;菸草環斑病毒TRSV上遊引物，濃度為10 μ mol/L, 10 μ L ;菸草環斑病毒TRSV下遊引物，濃度為10 μ mol/L, 10 μ L ;反轉錄酶及DNA聚合酶Mix，20 μ L ;無RNA酶的去離子水，100 μ L ;陽性對照，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd、鳳果花葉病毒P印MV和菸草環斑病毒TRSV無侵染活性的陽性對照各20 μ L。
[0050]所述的RT-PCR擴增引物為:
[0051]馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上遊引物為:5' -ATTCCCGCCGAAACAGG-3'；
[0052]PSTVd 下遊引物為:5' -CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3'；
[0053]鳳果花葉病毒P印MV 上遊引物為:5' -ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3'；
[0054]P印MV 下遊引物為:5' -AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3'；[0055]菸草環斑病毒TRSV 上遊引物為:5' -CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3'；
[0056]TRSV 下遊引物為:5' -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3'。
[0057]實施例3:—種番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒，番茄種傳病原為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或菸草環斑病毒，其包括以下組分:
[0058]RT-PCR buffer, 2 X RT-PCR buffer, 150 μ L ；RT-PCR 擴增引物為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上遊引物，濃度為10 μ mol/L, 20 μ L ;馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd下遊引物，濃度為10 μ mol/L，20 μ L ;鳳果花葉病毒P印MV上遊引物，濃度為10 μ mol/L，20 μ L ;鳳果花葉病毒P印MV下遊引物，濃度為10 μ mol/L, 20 μ L ;菸草環斑病毒TRSV上遊引物，濃度為10 μ mol/L, 20 μ L ;菸草環斑病毒TRSV下遊引物，濃度為10 μ mol/L, 20 μ L ;反轉錄酶及DNA聚合酶Mix，20 μ L ;無RNA酶的去離子水，50 μ L ;陽性對照，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd、鳳果花葉病毒P印MV和菸草環斑病毒TRSV無侵染活性的陽性對照各40 μ L。
[0059]所述的RT-PCR擴增引物為:
[0060]馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上遊引物為:5' -ATTCCCGCCGAAACAGG-3'；
[0061]PSTVd 下遊引物為:5' -CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3'；
[0062]鳳果花葉病毒P印MV 上遊引物為:5' -ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3'；
[0063]P印MV 下遊引物為:5' -AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3'；
[0064]菸草環斑病毒TRSV 上遊引物為:5' -CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3'；
[0065]TRSV 下遊引物為:5' -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3'。
[0066]實施例4:一種番爺種傳病原多重PCR檢測方法,其主要特點在於包括有:
[0067]I)總核酸提取:
[0068]2) RT-PCR 反應體系為 50 μ L，其中 2Χ RT-PCR buffer25 μ L, RT/Taq Mix2 μ L,10 μ mol/L PSTVd 上下遊引物各 1.5 μ L, 10 μ mol/L PepMV 上下遊引物各 0.5 μ L，10 μ mol/L TRSV上下遊引物各0.25 μ L，總RNA模板3 μ L，滅菌去離子水補足反應總體積；
[0069]3) RT-PCR反應條件為:
[0070]cDNA 合成:50°C 30min, I 個循環；
[0071]PCR 擴增:94°C預變性 3min ;94°C變性 30s，50°C退火 45s，72°C延伸 lmin，35 個循環；最後72°C延伸IOmin ；
[0072]4) RT-PCR擴增產物電泳檢測:
[0073]用TAE電泳緩衝液製備1.5%瓊脂糖凝膠，在室溫下進行水平電泳。加10 μ LPCR擴增產物，以健康番茄總核酸的反轉錄PCR產物為陰性對照，以DLlOOOMarker為標準分子量；100V/80mA下電泳30min，用SYBR Safe代替EB染色，用凝膠成像系統觀察並拍照，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒擴增產物為一條163bp的條帶，鳳果花葉病毒擴增產物為一條625bp的條帶，菸草環斑病毒擴增產物為一條348bp的條帶。
[0074]所述的核酸提取包括有如下步驟:
[0075](I)取感染馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或菸草環斑病毒的番茄葉片；稱取0.1g感染病毒樣品組織倒在潔淨的研缽內，加液氮研磨成粉末狀；
[0076](2)移入1.5mL離心管中，然後加入ImL的TRIzol，劇烈振蕩3min以上；
[0077](3)在4°C下，12000rpm離心IOmin以除去不溶成分,將上清液轉入另一新的1.5mL離心管中；[0078](4)在室溫下靜置5min，加0.2mL氯仿/mL TRIzol，劇烈振蕩15s，然後在室溫下靜置15min,再於4°C、12000rpm的條件下離心15min ；
[0079](5)將上層水相轉移到新的1.5mL離心管中，加0.5mL異丙醇/mLTRIzol，上下顛倒混勻，室溫靜置15min ；
[0080](6) 4?、12000rpm 離心 IOmin ;
[0081](7)棄上清，加入75%的乙醇洗滌沉澱，然後4°C、7500rpm離心2min，棄乙醇；
[0082](8)沉澱在室溫下乾燥IOmin或在冷凍離心濃縮機上濃縮5min，加入30 μ L無RNase水溶解，_70°C保存備用。
[0083]所述的RT-PCR擴增引物有:
[0084]馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上遊引物為:5' -ATTCCCGCCGAAACAGG-3'；
[0085]PSTVd 下遊引物為:5' -CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3'；
[0086]鳳果花葉病毒P印MV 上遊引物為:5' -ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3'；
[0087]P印MV 下遊引物為:5' -AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3'；
[0088]菸草環斑病毒TRSV 上遊引物為:5' -CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3'；
[0089]TRSV 下遊引物為:5' -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3'。
[0090]實施例5:一種番 爺種傳病原多重PCR同時檢測方法,其主要特點在於步驟為:
[0091](I)總核酸提取:利用TRIzol提取番茄總RNA。
[0092]I)稱取0.1g感病樣品組織倒在潔淨的研缽內，加液氮研磨成粉末狀；
[0093]2)移入1.5mL離心管中，然後加入ImL的TRIzol，劇烈振蕩3min以上；
[0094]3)4°C下，12000rpm離心IOmin以除去不溶成分,將上清轉入另一新的1.5mL離心管中；
[0095]4)在室溫下靜置5min,加0.2mL氯仿/mL TRIzol,劇烈振蕩15s,然後在室溫下靜置15min,再於。C、1000rpm的條件下離心15min ；
[0096]5)將上層水相轉移到新的1.5mL離心管中，加0.5mL異丙醇/mLTRIzol，上下顛倒混勻，室溫靜置15min ；
[0097]6) 4?、12000rpm 離心 IOmin ;
[0098]7)棄上清，加入75%的乙醇洗滌沉澱，然後4°C、7500rpm離心2min，棄乙醇；
[0099]8)沉澱在室溫下乾燥IOmin或在冷凍離心濃縮機上濃縮5min，加入30 μ L無RNase水溶解，_70°C保存備用。
[0100](2) RT-PCR 擴增:
[0101]RT-PCR 反應體系為 50yL，其中 2XRT-PCR buffer25 μ L, RT/TaqMix2yL, 10ymol/L PSTVd 上下遊弓丨物各 1.5 μ L，10 μ mol/L PepMV ± 下遊弓丨物各0.5 μ L，10 μ mol/L TRSV上下遊引物各0.25 μ L，總RNA模板3 μ L，滅菌去離子水補足反應總體積。其中，PSTVd上遊引物為:5 ' -ATTCCCGCCGAAACAGG-3 '，下遊引物為:5 ' -CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3 ' ；PepMV 上遊引物為:5 ' -ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3 '，下遊引物為:5 ' -AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3 '；TRSV 上遊引物為:5 ' -CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3 '，下遊引物為:5' -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3'。
[0102]RT-PCR反應條件為:[0103]cDNA 合成:50°C 30min, I 個循環；
[0104]PCR 擴增:94°C預變性 3min ;94°C變性 30s，50°C退火 45s，72°C延伸 lmin，35 個循環；最後72°C延伸IOmin0
[0105](3) PCR擴增產物電泳檢測:
[0106]用TAE電泳緩衝液製備1.5%瓊脂糖凝膠，在室溫下進行水平電泳。加10 μ LPCR擴增產物，以健康番茄總核酸的反轉錄PCR產物為陰性對照，以DLlOOOMarker為標準分子量；100V/80mA下電泳30min，用SYBR Safe代替EB染色，用凝膠成像系統觀察並拍照，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒擴增產物為一條163bp的條帶，鳳果花葉病毒擴增產物為一條625bp的條帶，菸草環斑病毒擴增產物為一條348bp的條帶。
[0107]實驗例1:一種番茄種傳病原的多重PCR的同時檢測方法，其步驟為:
[0108]1.核酸提取:
[0109](I)取感染馬鈴薯紡錘塊莖類病毒，鳳果花葉病毒或菸草環斑病毒的番茄葉片。稱取0.1g感病樣品組織倒在潔淨的研缽內，加液氮研磨成粉末狀；
[0110](2)移入1.5mL離心管中，然後加入ImL的TRIzol,劇烈振蕩3min以上；
[0111](3) 4°C下，12000rpm離心IOmin以除去不溶成分,將上清轉入另一新的1.5mL離心管中；
[0112](4)在室溫下靜置5min，加0.2mL氯仿/mL TRIzol，劇烈振蕩15s，然後在室溫下靜置15min,再於4°C、12000rpm的條件下離心15min ；
[0113](5)將上層水相轉移到新的1.5mL離心管中，加0.5mL異丙醇/mLTRIzol，上下顛倒混勻，室溫靜置15min ；
[0114](6)4°C、12000rpm 離心 IOmin ;
[0115](7)棄上清，加入75%的乙醇洗滌沉澱，然後4°C、7500rpm離心2min，棄乙醇；
[0116](8)沉澱在室溫下乾燥IOmin或在冷凍離心濃縮機上濃縮5min，加入30 μ L無RNase水溶解，_70°C保存備用。
[0117]2.RT-PCR 擴增:
[0118]RT-PCR擴增所需體系如下:在50 μ L反應體系中進行RT-PCR擴增，其中2 X RT-PCR buffer25 μ L, RT/Taq Mix2 μ L，10 μ mol/L PSTVd 上下遊引物各 1.5yL，10 μ mol/L PepMV上下遊引物各0.5 μ L, 10 μ mol/L TRSV上下遊引物各0.25 μ L，總RNA模板3μ L，滅菌去離子水補足反應總體積。上述各條引物在反應體系中的終濃度如下:PSTVd上下遊引物終濃度為0.3 μ mol/L, PepMV上下遊引物終濃度為0.1 μ mol/L, TRSV上下遊引物終濃度為0.05 μ mol/L。
[0119]RT-PCR反應條件為:
[0120]cDNA 合成:50°C 30min, I 個循環；
[0121]PCR 擴增:94°C預變性 3min ;94°C變性 30s，50°C退火 45s，72°C延伸 lmin，35 個循環；最後72°C延伸IOmin0
[0122]3.PCR擴增產物電泳檢測:
[0123]用TAE電泳緩衝液製備1.5%瓊脂糖凝膠，在室溫下進行水平電泳。加10 μ LPCR擴增產物，以健康番茄總核酸的反轉錄PCR產物為陰性對照，以DLlOOOMarker為標準分子量；100V/80mA下電泳30min，用SYBR Safe代替EB染色，用凝膠成像系統觀察並拍照。若在163bp處出現擴增條帶說明PSTVd為陽性；若在625bp處出現擴增條帶說明PepMV為陽性；若在348bp處出現擴增條帶說明TRSV為陽性；陽性對照成立，無擴增條帶說明PSTVd、TRSV和P印MV均為陰性。
[0124]4.電泳結果分析:
[0125]馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒和菸草環斑病毒分別擴增出163bp，625bp和348bp的片段，與分別用單一引物擴增的片段大小相符合，見附圖1。
[0126]對PCR產物用純化試劑盒切膠回收，送基因公司測序。測序結果通過NCB1-BLAST與GenBank中核苷酸序列進行同源性比對。進行序列同源性比對後，發現PSTVd擴增產物核苷酸序列與GenBank中登錄的PSTVd基因序列(登錄號為JQ889841.1，HQ639700.1，EU879918.1，DQ308651.1)存在99%的一致性；PepMV擴增產物核苷酸序列與GenBank中登錄的 P印MV RdRp 基因序列(登錄號為:AJ438767.1,FJ940223.1,FJ457098.1,AJ606360.1)存在99%的一致性；TRSV擴增產物核苷酸序列與GenBank中登錄的TRSV CP基因序列(登錄號為:HQ446461.1，AF461164.1，L09205.1，HQ446458.1)存在 99% 的一致性。
[0127]5.多重RT-PCR靈敏度的測試:
[0128]分別用超純水10倍梯度稀釋總核酸模板，各取3 μ L作模板檢測多重RT-PCR的靈敏度，結果顯示:可以從稀釋IO3倍的總核酸中擴增出PepMV，可以從稀釋IO3倍的總核酸中擴增出PSTVd，可以從稀釋IO4倍的總核酸中擴增出TRSV，多重PCR與單一 PCR具有相同的檢測靈敏度，見附圖2。
[0129]實驗例2:番茄種傳病原多重PCR的同時檢測，
[0130]1.核酸提取:
[0131](I)取感染馬鈴薯紡錘塊莖類病毒，鳳果花葉病毒或菸草環斑病毒的番茄葉片。稱取0.1g感病樣品組織倒在潔淨的研缽內，加液氮研磨成粉末狀；
[0132](2)移入1.5mL離心管中，然後加入ImL的TRIzol，劇烈振蕩3min以上；
[0133](3) 4°C下，12000rpm離心IOmin以除去不溶成分,將上清轉入另一新的1.5mL離心管中；
[0134](4)在室溫下靜置5min，加0.2mL氯仿/mL TRIzol，劇烈振蕩15s，然後在室溫下靜置15min,再於4°C、12000rpm的條件下離心15min ；
[0135](5)將上層水相轉移到新的1.5mL離心管中，加0.5mL異丙醇/mLTRIzol，上下顛倒混勻，室溫靜置15min ；
[0136](6) 4°C、12000rpm 離心 IOmin ;
[0137](7)棄上清，加入75%的乙醇洗滌沉澱，然後4°C、7500rpm離心2min，棄乙醇；
[0138](8)沉澱在室溫下乾燥IOmin或在冷凍離心濃縮機上濃縮5min，加入30 μ L無RNase水溶解，_70°C保存備用。
[0139]2.RT-PCR 擴增:
[0140]RT-PCR 反應體系為 50 μ L，其中 2XRT-PCR buffer25 μ L, RT/Taq Mix2 μ L,10 μ mol/L PSTVd上下遊引物各 1.5 μ L，10 μ mol/L P印MV上下遊引物各0.5 μ L，10 μ mol/LTRSV上下遊引物各0.25 μ L，總RNA模板3 μ L，滅菌去離子水補足反應總體積；RT_PCR反應條件為:cDNA合成:50°C 30min, I個循環；PCR擴增:94°C預變性3min ;94°C變性30s, 50°C退火45s, 72°C延伸lmin, 35個循環；最後72°C延伸IOmin0[0141 ] 3.PCR擴增產物電泳檢測:
[0142]用TAE電泳緩衝液製備1.5%瓊脂糖凝膠，在室溫下進行水平電泳。加10 μ LPCR擴增產物，以健康番茄總核酸的反轉錄PCR產物為陰性對照，以DLlOOOMarker為標準分子量；100V/80mA下電泳30min，用SYBR Safe代替EB染色，用凝膠成像系統觀察並拍照，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒擴增產物為一條163bp的條帶，鳳果花葉病毒擴增產物為一條625bp的條帶，菸草環斑病毒擴增產物為一條348bp的條帶，如附圖3所示。
[0143]測序結果表明，擴增條帶均為預期的目的條帶。
[0144]以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒，番茄種傳病原為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或菸草環斑病毒，其特徵在於包括以下組分: RT-PCR buffer, 2XRT-PCR buffer, 100-250 μ L ;RT_PCR 擴增引物為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上遊引物，濃度為10 μ mol/L, 10-30 μ L ;馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd下遊引物，濃度為10 μ mol/L，10-30 μ L ;鳳果花葉病毒P印MV上遊引物，濃度為IOymol/L，10-30yL ;鳳果花葉病毒P印MV下遊引物，濃度為10 μ mol/L，10-30 μ L ;菸草環斑病毒TRSV上遊引物，濃度為10 μ mol/L, 10-30 yL;菸草環斑病毒TRSV下遊引物，濃度為10ymol/L，10-30yL ;反轉錄酶及DNA聚合酶Mix，20yL;無RNA酶的去離子水，100 μ L-1mL ;陽性對照，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd、鳳果花葉病毒PepMV和菸草環斑病毒TRSV無侵染活性的陽性對照各20-60 μ L0
2.如權利要求1所述的番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒，其特徵在於所述的RT-PCR擴增引物為: 馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上遊引物為:5' -ATTCCCGCCGAAACAGG-3'； PSTVd 下遊引物為:5' -CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3'； 鳳果花葉病毒P印MV上遊引物為:5' -ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3'； P印MV 下遊引物為:5' -AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3'； 菸草環斑病毒TRSV上遊引物為:5' -CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3'；` TRSV 下遊引物為:5' -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3'。
3.一種番爺種傳病原多重PCR檢測方法,其特徵在於包括有: O總核酸提取:
2)RT-PCR 反應體系為 50 μ L，其中 2 X RT-PCR buffer25 μ L, RT/Taq Mixl.0-2.0 μ L，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上下遊引物10 μ mol/L各0.6-1.6 μ L，鳳果花葉病毒P印MV上下遊引物ΙΟμπιοΙ/L各0.2-1.0yL，菸草環斑病毒TRSV上下遊引物ΙΟμπιοΙ/L各0.2-1.0yL,總RNA模板2.5-8 μ L,滅菌去離子水補足反應總體積； 3)RT-PCR反應條件為: cDNA 合成:50°C 30min, I 個循環； PCR擴增:94°C預變性3min ;94°C變性30s，50°C退火45s，72。。延伸lmin，35個循環；最後72°C延伸IOmin ； 4)RT-PCR擴增產物電泳檢測: 用TAE電泳緩衝液製備1.5%瓊脂糖凝膠，在室溫下進行水平電泳。加10 μ LPCR擴增產物，以健康番茄總核酸的反轉錄PCR產物為陰性對照，以DLlOOOMarker為標準分子量；100V/80mA下電泳30min，用SYBR Safe代替EB染色，用凝膠成像系統觀察並拍照，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒擴增產物為一條163bp的條帶，鳳果花葉病毒擴增產物為一條625bp的條帶，菸草環斑病毒擴增產物為一條348bp的條帶。
4.如權利要求3所述的番茄種傳病原多重PCR檢測方法，其特徵在於所述的核酸提取包括有如下步驟: (O取感染馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或菸草環斑病毒的番茄葉片；稱取`0.1g感染病毒樣品組織倒在潔淨的研缽內，加液氮研磨成粉末狀； (2)移入1.5mL離心管中，然後加入ImL的TRIzol，劇烈振蕩3min以上；(3)在4°C下，12000rpm離心IOmin以除去不溶成分,將上清液轉入另一新的1.5mL離心管中； (4)在室溫下靜置5min，加0.2mL氯仿/mL TRIzol，劇烈振蕩15s，然後在室溫下靜置15min,再於4°C、12000rpm的條件下離心15min ； (5)將上層水相轉移到新的1.5mL離心管中，加0.5mL異丙醇/mLTRIzol,上下顛倒混勻，室溫靜置15min ；
(6)4°C、12000rpm 離心 IOmin ； (7)棄上清，加入75%的乙醇洗滌沉澱，然後4°C、7500rpm離心2min，棄乙醇； (8)沉澱在室溫下乾燥IOmin或在冷凍離心濃縮機上濃縮5min,加入30μ L無RNase水溶解，_70°C保存 備用。
【文檔編號】C12Q1/70GK103484570SQ201310453155
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月28日 優先權日:2013年9月28日
【發明者】文朝慧, 劉雯, 王軍平 申請人:甘肅出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心