一種GAImRNA分子在梨屬砧穗間傳遞的分子鑑定方法
2024-02-25 17:16:15
專利名稱：一種GAI mRNA分子在梨屬砧穗間傳遞的分子鑑定方法
技術領域：
本發明涉及植物分子生物學領域，具體涉及的是GAI基因mRNA分子在梨屬植物砧 木和接穗間長距離傳遞的分子鑑定方法。
背景技術：
園藝作物生產過程中，廣泛應用嫁接技術，獲得抗性、矮化等性狀，以增加產量並 提高產品品質，其中果樹栽培中對嫁接的應用更為普遍。生產過程中發現，同樣的接穗嫁接 至不同砧木後性狀表現不同，如果實色澤、可溶性固形物含量、開花期等變化，許多性狀的 改變會影響到果品的形成、生長及發育，進而影響後期的經濟效益。一系列的研究表明，植物體中一些RNA分子在細胞間與一些韌皮部蛋白以蛋白 質-RNA複合體的形式在韌皮部中轉移，並可通過嫁接口由砧木傳遞至接穗的頂端分生組 織，影響接穗的生長發育。因此，通過對果樹嫁接過程中RNA的韌皮部長距離系統運輸的鑑 定及研究，可以為今後我們搞清果樹中砧木與接穗間RNA分子的傳遞機制，以及利用可傳 遞RNA轉基因有目的的改良砧木，使接穗獲得優良性狀以利於果品生產及經濟效益的提高 奠定基礎，也為果樹生產提供積極的指導作用。赤黴素(GA)是在植物生長發育過程中起重要作用的植物激素。對GA信號調控 方面的研究中發現，GRAS家族中的GAI擬南芥中GA信號起負調控作用，其胺基酸序列N 端包括一個保守的區域被稱為DELLA(Alvey等，2005)，DELLA區缺失植物會表現半矮化 (Olszewski等，2003)。目前擬南芥中編碼DELLA蛋白的基因有5個，分別為GAI、RGL、RGL1、 RGL2 和 RGL3(Dill et al. ,2001 ；Lee et al.，2002)。蘋果『嘎拉，品種在 NCBI 中登錄的 編碼 DELLA 蛋白的基因有三組共 6 個 MdRGLla/b、MdRGL2a/b 和 MdRGL2a/b(Foster et al.， 2007)，湖北海棠中有2個MhGAIl和MhGAI2，小金海棠中有2個MxGAIl和MxGAI2，蘋果『富 士，有2個MhGAIl和MhGAI2(徐海燕等，2009)，其他植物如水稻(Su et al.，2005)、大麥 (Ikeda et al. ,2001)中也克隆到了編碼DELLA蛋白的GRAS家族基因。至今為止，研究發現能夠在植物韌皮部進行長距離傳遞的基因mRNA及其編碼的 蛋白有很多，如KNl、BEL5、NACP、FT蛋白、SUT1等，關於這些基因的RNA及蛋白是否能夠 傳遞的驗證也僅是使用轉基因檢測載體攜帶特異性標籤(Haywood et al.，2005)，及巢式 RT-PCR(Harada et al. , 2009) ,Northern blot等技術，雖然這些技術檢測基因的傳遞性比 較準確，但是其過程繁瑣，要求高，耗時長，明顯存在工作量大，工作周期長，效率低等不足 之處，特別是因為果樹轉基因及再生較困難，我們在研究RNA在砧穗間傳遞的過程中，轉基 因的方法驗證基因RNA的傳遞很困難，這樣就為我們進行果樹內源mRNA嫁接傳遞的研究更 增加了難度。
發明內容
本發明的目的是提供杜梨和『鴨梨』GAI的核苷酸序列和由該核苷酸編碼的蛋白的 胺基酸序列，如SEQ ID NOl 4所示。
本發明的另一個目的是提供一種GAI基因mRNA在梨屬砧穗間運輸的分子鑑定方 法，包括如下步驟(1)根據擬南芥、南瓜、蘋果等植物GAI基因保守區設計引物，分離和克隆杜梨 (Pyrus betulaefolia)、『鴨梨，(Pyrus bretschneideri)中編碼 DELLA 蛋白的 GAI 基因全 長，利用生物信息學方法進行序列分析，並對所得基因進行了比對及分析，證實所得基因屬 於GRAS家族；(2) 『鴨梨』為接穗，杜梨為砧木進行試管苗微嫁接；(3)分析『鴨梨』和『杜梨』的GAI基因序列，尋找各自特異的酶切位點，在此酶切 位點的上下遊分別設計引物；(4)分別提取『鴨梨』、杜梨以及嫁接後的砧木和接穗的總RNA，反轉錄成cDNA，PCR 擴增GAI的基因片段；(5)用限制性內切酶對PCR產物進行酶切，比較嫁接前後的酶切譜圖，如果在嫁接 體系中存在RNA的傳遞，則在砧木杜梨的擴增產物酶切後會出現接穗『鴨梨』特異性的條 帶，同樣在接穗『鴨梨』的擴增產物酶切後也會出現砧木杜梨特異性的條帶；如果不發生傳 遞，那麼擴增產物的酶切電泳圖中就會顯示出各自相應樣品的條帶而無其他雜帶。所述用於擴增杜梨和『鴨梨，GAI同源基因的引物為TTGATTTCCGAGCCCTACCC和 AACTCGGTCATCGCTCACTGA。所述的限制性內切酶為Hap II。其中，用於提取接穗『鴨梨』總RNA的樣品選擇嫁接3 4d的『鴨梨』的葉片、莖 尖、莖段韌皮部或嫁接口。本發明的另一個目的是提供所述的鑑定方法在梨屬其他植物砧穗間GAI mRNA分 子傳遞鑑定中的應用。本發明提供的方法解決了同源性高的基因在砧木和接穗間無法通過設計特異性 引物進行RT-PCR鑑定的問題，同時也解決了果樹轉基因技術較難，耗時長而不方便鑑定的 問題。本發明提供的方法快速、靈敏，準確性高，簡便，能夠應用於其他梨屬植物。
圖1所示為『鴨梨』和杜梨GAI基因PCR擴增電泳圖。圖中M DNA分子量標準；1 『鴨梨』 ；2 杜梨。圖2所示為GAI胺基酸序列同源性比較。圖中YL-GAI 『鴨梨，；DL-GAI 杜梨； MfGAI 蘋果『富士，；MxGAI 小金海棠；MdRGLla 蘋果『嘎啦，。圖3所示為GAI胺基酸序列系統進化樹分析圖4所示為『鴨梨』和杜梨GAI RT-PCR產物限制性酶切電泳檢測結果。圖中M DNA分子量標準；1 『鴨梨，RT-PCR產物酶切結果；2 杜梨RT-PCR產物酶切結果；3 『鴨梨， 和杜梨等量混合物RT-PCR產物酶切結果；4 『鴨梨，RT-PCR產物；5 杜梨RT-PCR產物。圖5所示為嫁接後砧木和接穗RT-PCR結果。圖中1 : 『鴨梨』莖尖；2 『鴨梨』葉片； 3 『鴨梨』莖段韌皮部；4 嫁接口 ；5 杜梨莖段韌皮部；6 杜梨莖段木質部；CK 對照組；Y 未嫁接的『鴨梨』 ；D 未嫁接的杜梨；M 未嫁接的『鴨梨』和杜梨等量混合物。圖6所示為微嫁接接穗與砧木GAI RT-PCR產物限制性酶切電泳檢測結果。M =DNA分子量標準；1 『鴨梨』莖尖；2 鴨梨』葉片；3 鴨梨』莖段韌皮部；4 嫁接口 ；5 杜梨砧木 莖段韌皮部；6 杜梨莖段木質部；Y 未嫁接的『鴨梨』 ；D 未嫁接的杜梨；M'未嫁接的『鴨 梨』和杜梨等量混合物。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。在不背離本發明精神 和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1試管微嫁接選取砧木杜梨(Pyrusbetulaefolia Bunge)和接穗『鴨梨，(Pyrus bretschneideri iYali')組培苗幼葉，恆定光源，光強15001x，光照14h，室溫23 25°C, 相對溼度85%，30 40d繼代一次。_植物材料培養基
『鴨梨，MS+1. Omg · L_16-BA+0. Img · L-1IBA
杜梨MS+0. 5mg · L_16-BA+0. Img · L-1IBA
液氮處理後-80°C冰箱保存用於基因克隆。在無菌條件下，將擴繁30d後 的杜梨組培苗去頭，留約1.5cm長莖段，沿頂部縱切；取苗高Icm的『鴨梨』組培苗， 頂端留2-3片葉，基部削成「V」型，插入砧木切口，用錫箔紙固定，嫁接苗在培養基 MS+0. 5mg · L_16-BA+0. Img · L-1IBA 中生長。實施例2基因組DNA提取(1)18葉片液氮研磨，轉入一個2.0!1^離心管中，加入80(^12\07^(2% CTAB, IOmM Tris-HCl，1. 4M NaCl, 1% PVP)，稍振蕩混勻，放於65°C水浴中20_40min，期間輕搖幾次。(2)降至室溫後，加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比24 1)，室溫12000rpm離 心10分鐘。(3)取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比24 1)，12000rpm離心10分鐘。(4)上清中加入2倍體積無水乙醇，-20°C沉澱30min。(5) 12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉澱用75%乙醇洗兩次，晾乾沉澱，溶於適量 雙蒸水中。(6)若需要，按100 μ 1力Π 1 μ 1 RNA酶比例進行去RNA處理，37°C 30分鐘。用CI 抽提一遍再用乙醇沉澱，沉澱溶於適量雙蒸水中。(7) 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，紫外分光光度計測260nm處吸光度計算DNA 濃度。實施例3 GAI基因組全長克隆
根據GenBank中公布的擬南芥、南瓜、蘋果『富士』等植物GAI的基因保守區設計 引物。擴增GAI基因使用引物如下上遊引物5『 -TTGATTTCCGAGCCCTACCC-3，，下遊引物5，-AACTCGGTCATCGCTCACTGA-3，。上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 反應體系Prime STAR HS DNA 聚合酶(Takara 公司，DR010S)，Takara LA PCR invitro Cloning Kit (Takara 公司，DRR015)_5 X Prime STAR 緩衝液10 μ 1dNTP mixture (2. 5mM each)4 μ 1Primer F/R(10 μ mol/L)1 μ 1Templete1 μ 1Prime STAR HS DNA 聚合(2. 5U/ μ 1) 0. 5 μ 1雙蒸水32. 5 μ 1_總計50 μ 1 _PCR反應程序如下94°C 預變性 3min;94°C 40s ；61°C 30s ；72 °C Imin ；30個循環。72°C最後延伸 2min。PCR產物檢測根據目標片段大小製作瓊脂糖凝膠，0. TAE電泳緩衝液， 70-110V電壓電泳約15min，溴化乙啶染色，紫外燈下檢測PCR產物片段大小，可得兩條大小 相同的條帶(圖1)。實施例4目的片段瓊脂糖凝膠回收使用中科瑞泰生物技術有限公司回收試劑盒，方法參照其公司說明書①切取含有目的DNA片斷的瓊脂糖，儘量切除多餘凝膠，加入350μ1的溶膠液PN。②50°C水浴放置lOmin，不斷溫和上下翻轉離心管，確保膠塊完全溶解。若仍然有 未溶解的膠塊，可補充一些溶膠液或放置幾分鐘，直至完全溶解。③將溶好的膠冷卻至室溫，加到回收柱中，13000rpm離心60s，倒掉收集管中的廢
液，重複操作一次。④重複③中的操作一次。⑤加入700 μ 1漂洗液PW(已加無水乙醇)，13000rpm離心60s，倒掉收集管中的廢液。⑥加入500 μ 1漂洗液PW(已加無水乙醇)，13000rpm離心60s，倒掉收集管中的廢
6液。⑦將吸附柱放回收集管內，13000rpm離心2min，儘量去除漂洗液。⑧取出吸附柱，放入一個乾淨的離心管中，在超淨臺上吹乾，在吸附柱膜中央加入 30 μ 1已加熱至68°C的洗脫液，室溫下放置2min，13000rpm離心lmin。⑨取5 μ 1回收產物電泳檢測回收效果，放入_20°C保存備用。實施例5製備大腸桿菌感受態①從-70°C冰箱中取出菌種，未完全解凍前用已經滅菌的牙籤輕輕點一下後在備 好的90mm培養基上劃線，37°C過夜培養16h左右，培養至可見單菌落時封口於4°C冰箱中保 存備用；②配製LB液體培養基300ml，分裝於6個200ml的三角瓶(50ml/瓶)，高溫高壓 滅菌20min，冷卻至55°C左右，每個三角瓶中取LB液體培養基50 μ 1都裝於同一個已經滅 菌的玻璃試管中。三角瓶中培養基封口於4°C冰箱備用；③用已滅菌的槍頭於90mm培養好的菌板上挑取單菌落，將槍頭推入裝有LB液體 培養基的玻璃試管中，封口，於37°C恆溫震蕩床中228rpm過夜培養16h以上；④從培養好的液體菌液中分別取50 μ 1於備用的6個裝有液體培養基的三角瓶 中，以1 100比例接種，225rpm培養至0D600為0. 6，大約為3h左右；⑤將菌液分裝到12個50ml無菌聚丙烯離心管中，冰上放置lOmin，然後4000rpm， 4°C離心IOmin收菌；⑥棄上清，倒置離心管Imin以徹底去除上清。每管加入25ml預冷的0. IM CaCl2, 輕輕混勻，冰上置30min ；⑦ 4000rpm，4°C離心 IOmin ；⑧棄上清，倒置離心管Imin以徹底去除上清。每管加入25ml預冷的0. IM CaCl2, 輕輕混勻；⑨此時感受態可以直接使用，若需長時間保存，可加入濃度為80 %的甘油，並使甘 油終濃度為20%，於-70°C保存。實施例6目的片段T-載體連接和轉化取純化的PCR產物加入pMD18-T載體及緩衝液(Takara公司，D101A, Japan)(參 照PMD18-T載體連接說明書)連接體系_連接液I5 μ 1PCR 產物4. 5 μ 1pMD18-T0. 5 μ 1_總體積10 μ 1_混勻，稍離心，16°C水浴12h以上。載體與基因片段的摩爾比1 4。①取50 μ 1感受態細胞，置於冰上，完全溶解後輕輕將細胞懸浮。②加入5 μ 1連接液，輕輕混勻，冰上放置30min。
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③42°C熱激90s，冰上放置2min。④加入500 μ 1 LB培養基，於37°C 200rpm振蕩培養lh。⑤室溫下4000rpm離心lmin，用槍頭吸掉400 μ 1上清液，用剩餘的培養基將細胞懸浮。⑥將細菌塗布在加有氨苄抗生素的固體LB培養基上。⑦將平板於37°C倒置培養過夜。挑取單菌落白斑及藍斑接入50 μ 1 LB+Amp液體培養基中混勻，以此為模板進行 PCR鑑定。同時設置陽性(PCR回收純化後的產物為模板)和陰性(藍斑菌液為模板)及 單引物作對照；瓊脂糖凝膠電泳檢測插入片段大小。選擇陽性克隆菌液，由北京諾塞基因測 序。測序結果顯示兩條目的片段均為1987bp，編碼634個胺基酸，無內含子。實施例7杜梨和『鴨梨』 GAI基因生物信息學分析將所得序列在http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov等網站上提供的軟體中進行同源 性比較、分子量的預測；用DNAMAN(Lyrmon BioSoft)和BioEdit等軟體進行多序列比對分 析、進化樹繪製分析。在NCBI上Blast比對結果顯示『鴨梨』和杜梨GAI基因胺基酸序列與其他植物 的具有較高的相似性，其中與『嘎拉』 MdRGL(Ia)和蘋果『富士』的相似性最高(97% )，其次 依次為小金海棠、湖北海棠和『嘎拉』 MdRGL(Ib)。『鴨梨』和杜梨GAI基因編碼的胺基酸序 列包含有5個結構域(圖2)，與已知的其他植物中的GAI基因的結構域LHR I ,VHIID,LHR II、PFYRE和SAW—致，證明克隆得到的序列為編碼DELLA蛋白基因。因此，將其分別命名 為 YL-GAI 禾口 DL-GAI。通過DNAMAN構建YL-GAI、DL-GAI等14種植物GAI基因胺基酸序列的系統進化 樹。該進化樹顯示，所獲得的胺基酸序列與『嘎拉』 MdRGL(Ia)、蘋果『富士』 MfGAI和小金海 棠MxGAI親緣關係最近，與湖北海棠MhGAI 1、『嘎拉，MdRGL(Ib)關係較近，與南瓜CmGAIP、 CmGAIPB及葡萄VvGAIl親緣關係較遠。而與擬南芥AtGAI、AtRGAl與蕓薹屬植物BoGAI、 BrGAI親緣關係最遠(圖3)。本研究獲得的系統進化樹在一定程度上與植物學分類結果一 致。表明胺基酸的序列進化與植物的進化保持一致，同科植物在進化樹上處於同一分支，而 親緣關係較遠的處於不同分支，且胺基酸的同源百分率也隨物種親緣關係的變遠而變小。實施例8總RNA的提取植物材料總RNA的提取採用CTAB法(張玉剛等，2005)，從接穗、砧木葉片和莖段 中提取總RNA，用30 μ 1 DEPC水溶解，電泳檢測後置_80°C冰箱保存備用。RNA 中 DNA 的去除①在500 μ L薄壁PCR管中加入_RNA2ug
無RNA酶的DNA酶緩衝液5 μ d
RNA酶抑制劑(40U/ μ 1)2μ 1
無RNA酶的DNA酶2μ 1
DEPC 水補足至50 μ 1
②37°C處理30min ；加入100 μ L無RNA酶的水(0. 1 % DEPC處理)；加入等體積氯 仿/異戊醇(24 1)混勻，冰浴IOmin ；③4°C IOOOOrpm離心IOmin ；取上清，加入等體積氯仿/異戊醇(24 1)混勻， IOmin 冰浴；4°C IOOOOrpm 離心 IOmin ；④取上清，加入10 μ 1 IOM NH4AC,同時加入2. 5倍體積的無水乙醇，_20°C，30min ； 40C，12000rpm離心20min ；棄上清，沉澱加入適量75%乙醇彈起，7500rpm離心lOmin，洗滌 2次；真空吸淨乙醇；⑤沉澱於低溫下吹風機吹乾，溶於50 μ L無RNA酶的水中，_70°C保存備用。實施例9 cDNA合成反轉錄體系(25 μ 1)及過程在無RNA酶的200ul薄壁管中加入如下試劑總RNA 2 μ 1，Oligo dT 1 μ 1，DEPC 水 12 μ 1，共 15ul 的混合物 5000rpm 混勻，放置 70°C 5min,馬 上拿出放置於冰上，再加入以下部分=M-MLV 1 μ 1,5XM-MLV緩衝液2. 5 μ 1，RNA酶抑制劑 0. 6μ 1，dNTP (IOmM) 1. 25 μ 1，DEPC 水 4. 65 μ 1。加入以上共25ul體系的混合物，5000rpm混勻，42°C lh, 70°C IOmin,中止反應。所得到的cDNA作為下述PCR擴增的模板。實施例10杜梨和梨cDNA的GAI PCR擴增YL-GAI與DL-GAI基因核苷酸序列相似性高達99%，特異性引物很難設計，利用 RT-PCR的方法鑑定不可行。所以發明人根據已經獲得的核苷酸序列，利用DNAMAN分析砧木 與接穗核苷酸序列間酶切位點，比較酶切位點之間的差異，選擇砧木對接穗特異的酶切位 點，用Primer5. O與DNAMAN在其兩端設計引物。即通過對兩個基因酶切位點的分析，我們 篩選出一個特異的限制性內切酶HaplKTakara公司，D1053A)，即將『鴨梨』與杜梨切成不 同大小的片段。採用酶切鑑定的方法驗證GAI基因mRNA的傳遞。
基因內_弓丨物
大小(bp) 大小(bp)
上遊引物5』-GGGATGC
24 24
AGTGGCCCGCTCT -3' GAI Hapll …認二丨 &36144 44
下遊引物5』-GCTCCACCA
權利要求
一種杜梨GAI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.由權利要求1所述的基因編碼的蛋白，其胺基酸序列如SEQID NO 2所示。
3.一種『鴨梨，GAI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
4.由權利要求3所述的基因編碼的蛋白，其胺基酸序列如SEQID NO 4所示。
5.一種GAI mRNA分子在梨屬砧穗間傳遞的分子鑑定方法，包括如下步驟(1)『鴨梨』為接穗，杜梨為砧木進行試管苗微嫁接；(2)分析權利要求1和權利要求3所述基因的核苷酸序列，選擇各自特異的酶切位點， 在此酶切位點的上下遊分別設計引物；(3)分別提取杜梨、『鴨梨』以及嫁接後砧木與接穗的總RNA，反轉錄成cDNA，PCR擴增 GAI的基因片段；(4)用所選的限制性內切酶對PCR產物進行酶切，比較嫁接前後的酶切譜圖。
6.根據權利要求5所述的分子鑑定方法，其特徵在於，所述限制性內切酶為HapII。
7.根據權利要求5所述的分子鑑定方法，其特徵在於，所述的用於提取接穗總RNA的樣 品選自嫁接3 4天的葉片、莖尖、莖段韌皮部或嫁接口。
8.如根據權利要求5 7任一項所述的分子鑑定方法在其他梨屬植物砧穗間GAImRNA 分子傳遞的鑑定上的應用。
全文摘要
本發明公開了杜梨和「鴨梨」GAI蛋白的胺基酸序列和編碼該蛋白的核苷酸序列，如序列表SEQ ID NO1～4所示。本發明同時公開了GAI mRNA在杜梨和梨砧穗間傳遞的分子鑑定方法，包括如下步驟1)、「鴨梨」為接穗，杜梨為砧木進行試管苗微嫁接；2)、尋找「鴨梨」和杜梨的GAI基因各自特異的酶切位點，在此酶切位點的上下遊分別設計引物；3)、限制性酶切杜梨、「鴨梨」以及嫁接後的杜梨、「鴨梨」的RT-PCR產物，比較嫁接前後的酶切譜圖鑑定傳遞情況。本發明提供的方法快速、靈敏，準確性高，簡便，能夠應用於其他梨屬植物。
文檔編號C12N15/29GK101942453SQ20101026934
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月31日 優先權日2010年8月31日
發明者張文娜, 李天忠 申請人:中國農業大學