一種量子點標記蛋白的方法

2023-06-21 19:11:16 1

專利名稱：一種量子點標記蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及納米生物技術領域，具體涉及一種量子點標記蛋白的新方法。
背景技術：
量子點(QDs)是一種零維半導體納米晶體，近似球形，直徑f 12nm，可分散於水或者有機溶劑中形成膠。與傳統的有機染料相比，QDs具有更優異的光譜性質，如激發光譜寬且連續分布，而發射光譜呈對稱分布且寬度窄，顏色可調，並且光化學穩定性高，不易光解(Marcel BJ, Mario M, Peter G, et al. Science 1998，281，2013-2016)。這些優越的性能使QDs在體內細胞成像和生物特定標記等方面都得到了廣泛應用，它正在並將日益成為分子細胞成像研究中非常重要的一種探針工具。目前，在生物標記中應用最廣泛的是金屬有機溶劑法合成的脂溶性CdSe/ZnS量子點。因此，必須將脂溶性的QDs轉化成水溶性的QDs才能進行生物標記。而將脂溶性的QDs轉化成水溶性的QDs最常用的方法是先用巰基小分子(如巰基乙酸、巰基丙酸、穀胱甘肽、巰基丁二酸等)取代脂溶性QDs表面的配體，然後通過偶聯劑與生物分子偶聯；另一種常用的QDs標記生物分子的方法是與含有組氨酸標籤的多肽或蛋白結合。QDs表面的Zn原子和多組氨酸殘基的金屬親和協調作用，含有組氨酸殘基的蛋白質和多肽能夠直接接到QDs表面的Zn原子，這種方法具有很好的穩定性，已逐漸成為生物標記中一種常用的方法。Sapsford等(Sapsford K. E. , Pons T. , Medintz I. L. , et al. J. Phys. Chem. <^2007,111，11528-11538)系統地研究了含組氨酸多肽與QDs之間的相互作用及結合常數等，6個組氨酸序列與QDs的結合速率是約100秒，KtT1約為I nM。因此，我們考慮在鏈球菌致熱性外毒素A蛋白(SpeA)上表達一個Histag，再通過蛋白的二聚使蛋白二聚體上形成兩個Histag,使更多的組氨酸與QDs結合，以此提高結合的穩定性，從而大大提高QDs在生物標記領域中的應用。

發明內容
本發明要解決的技術問題是為了克服現有蛋白與QDs穩定性差的問題，限制其在生物領域中的普及使用，為解決上述技術問題，本發明提供一種量子點標記蛋白的新方法，利用SpeA蛋白容易發生二聚的性質，使得到的二聚體產生兩個Histag，從而提高量子點與蛋白結合的穩定性。本發明解決其技術問題所採用的技術方案是一種量子點標記蛋白的方法，是蛋白上表達一個組氨酸標籤序列(Histag)，然後將帶組氨酸標籤的蛋白與量子點混合，得到量子點標記的複合物。所述的蛋白為容易發生二聚的蛋白，例如SpeA蛋白。所述的蛋白與量子點之間的摩爾比為4:1-16:1。由於蛋白容易發生二聚，因此有兩個Histag同時與量子點結合，從而提高結合的穩定性。所述的蛋白為各易發生_■聚的SpeA蛋白。·
本發明所述的量子點為含有Zn的量子點，如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。採用上述的技術方案後，本發明取得的有益效果是，本發明提供的一種量子點標記蛋白的新方法，操作方法簡單，可重複性高，與量子點結合速度快，穩定性高，解決了現有量子點蛋白結合的穩定性不足而導致其在生物體內的不穩定，進一步拓展了量子點一蛋白作為納米螢光探針在生物中的應用。


下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。圖I是二聚的蛋白SpeA與量子點結合的結構示意圖。圖2是聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)證實SpeA蛋白發生了二聚。
圖3是用毛細管電泳檢測SpeA 二聚體與QDs結合的穩定性。電泳條件25 mM硼酸緩衝液(pH 9. 3)，電壓為18 kV。SpeA:QD=8:l，[QD] =0. 5 μΜ。其中a是對照試驗，沒有加取代分子咪唑。b加入咪唑取代小分子(咪唑最終濃度為250 mM)。檢測波長為612nm0
具體實施方式
實施例本發明將就以下實施例作進一步說明，但應了解的是，這些實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發明實施的限制。實施例I
帶有Histag的SpeA蛋白表達
SpeA基因購自Genscript公司，並通過大腸桿菌(E . coli)表達。該基因被克隆到pET28a載體的Nde I和EcoR I位點，得到高產表達質粒pJX2，它包含全長SPEA蛋白和N-末端的Histag。通過電穿孔將質粒pJX2導入大腸桿菌。在重組基因轉化入E . coli菌株以後，通過溫度的控制，誘導其在宿主菌內表達目的蛋白質，將表達樣品進行SDS-PAGE以檢測表達蛋白質，SpeA在溶液中會形成二聚的結構(圖2)。將SpeA與CdSe/Zns量子點按照摩爾比為8:1的比例混合後，震蕩30分鐘，SpeA二聚體通過組氨酸與量子點結合，得到SpeA-QD的複合物(圖I)。為了檢測SpeA與QDs結合的穩定性,將QDs與SpeA混合後，加入咪唑取代SpeA(咪唑終濃度為250 mM)。咪唑能與Zn離子螯合，因此可與Histag產生競爭，有可能把結合到QDs上的SpeA取代下來，因此通過加入高濃度的咪唑來判斷SpeA與QDs結合的穩定性。實驗結果表明，加入大量取代分子後，電泳譜圖幾乎沒有發生變化，說明QDs與SpeA的結合非常穩定，很難被咪唑分子取代(圖3)。實施例2
所用量子點為CdTe/ZnS，蛋白與量子點的摩爾比為4:1，其他步驟同實施例I。實施例3
所用量子點為CdSe/ZnSe，蛋白與量子點的摩爾比為16:1，其他步驟同實施例I。
通過上述三個實施例可以看出，本發明可以實現量子點與SpeA蛋白二聚體的快速結合，並且穩定性高，操作方便。以上述依據本發明的理想實施例為啟示，通過上述的說明內容，相關工作人員完 全可以在不偏離本項發明技術思想的範圍內，進行多樣的變更以及修改。本項發明的技術性範圍並不局限於說明書上的內容，必須要根據權利要求範圍來確定其技術性範圍。
權利要求
1.一種量子點標記蛋白的方法，其特徵在於，是在蛋白上表達一個組氨酸標籤序列，然後將帶組氨酸標籤的蛋白與量子點混合，得到量子點標記的複合物。
2.根據權利要求I所述的一種量子點標記蛋白的方法，其特徵在於所述的蛋白為容易發生二聚的蛋白。
3.根據權利要求2所述的一種量子點標記蛋白的方法，其特徵在於所述的蛋白是SpeA 蛋白。
4.根據權利要求I所述的一種量子點標記蛋白的方法，其特徵在於所述的蛋白與量子點之間的摩爾比為4:1-16:1。
5.根據權利要求I所述的一種量子點標記蛋白的方法，其特徵在於所述的量子點為含有Zn的量子點。
6.根據權利要求I所述的一種量子點標記蛋白的方法，其特徵在於含有Zn的量子點是 CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe 或者 CdTe/ZnSe。
全文摘要
本發明公開了一種量子點標記蛋白的新方法，屬於納米生物技術領域。其特徵在於首先在蛋白上表達一個組氨酸標籤序列(Histag)，通過蛋白二聚，得到含有兩個Histag的蛋白二聚體。將蛋白與量子點按照一定的比例混合，震蕩，使兩個Histag同時與量子點結合，從而提高結合的穩定性。該方法操作簡單，可以作為納米螢光探針廣泛應用於生物標記。
文檔編號C07K1/13GK102924564SQ201210431798
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月2日 優先權日2012年11月2日
發明者王建浩, 王車禮, 蔣鵬舉, 邱琳, 夏江 申請人:常州大學