一種提高動物瘦肉率的新型幹擾載體及其應用的製作方法

2023-05-31 16:32:16

專利名稱：一種提高動物瘦肉率的新型幹擾載體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型載體的構建。具體而言，本發明針對綿羊肌肉生長抑制素基因MSTN的核苷酸序列設計合成miRNA單鏈寡核苷酸，構建了 miRNA慢病毒幹擾載體，得到了具有良好應用前景的新型載體。
背景技術：
人們對畜禽肉用性狀的研究，主要集中在瘦肉率和肉質方面，其中對瘦肉率的追求一直是科學家和生產者努力的重點。肌肉的產量是肉用畜禽的重要經濟性狀，對畜牧業的經濟效益起著決定性作用。近年來，隨著分子遺傳學的發展及分子生物技術的革新，育種工作者培育出許多生長速度快、瘦肉率高、節省飼料的畜禽品種，並且研究了主宰這些優良經濟性狀的主效基因。其中，最使人感興趣的是造成牛肌肉異常發達「雙肌」性狀的基因。1997年McPherron等發現了一種分泌型生長、分化因子，將其命名為 ⑶F-8 (growth differentiation factor-8)，其特徵是在骨骼肌中特異性表達，對肌肉生長有負調控作用，該基因突變可導致骨骼肌肥大，因此也稱為肌肉生長抑制素(mystatin， MSTN)。2001年，由Michel Georges領導的研究小組，歷經十餘年的研究發現比利時藍牛 (Belginm Blue)的雙肌性狀是由於肌肉生長抑制素基因突變造成的[Hughes SM. Running without regulators. Nature, 1992, 360 :536_537.]。與此同時，由美國農業部的 Tim Smith 領導的研究小組和由霍普金斯大學的SejinLee領導的研究小組也發現比利時藍牛及皮爾蒙特牛(Piedmontese)的雙肌性狀是肌肉生長抑制素基因突變造成的[Jeanplong F， Sharma M，Somers W G，et a. IGenomic organization and neonatal expression of the bovine myostatin gene. Molecular and Cellular Biochemistry，2001，200 :31_37.]。通過基因敲除，反義核酸及體內表達肌肉生長抑制素基因拮抗因子的實驗，證明肌肉生長抑制素基因是限制肌肉超常發育的負調控基因。MSTN的活性降低或喪失，使得肌肉與其他組織的比例大大提高，因此在畜牧生產上有很好的應用前景。這在脂肪比例較大的家畜中應用潛力很大。RNAi (RNA interference)是 21_23 個核苷酸的小分子幹擾 RNA(small interfering RNA, si RNA)誘導細胞同源基因mRNA降解、從而特異性抑制基因表達的過程。 其作為一項可以高效、特異地降解靶基因mRNA的實驗技術已被廣泛應用於基因功能的研究[Arziman Z, Horn Τ, Boutros Μ. E-RNAi :a web application to design optimized RNAi constructs. Nucleic Acids Res 2005 ;33 :W582_W588]。microRNAs (miRNAs，即微小 RNA)是19-23個鹼基小分子單鏈RNA，位於基因組非編碼區，進化上高度保守，可在翻譯水平對基因表達進行調控。哺乳動物中就可能存在有200-500個miRNA，參與至少10%基因的表達調控[Bartel D (2004). Keystone miRNA and si RNA Symposium·]。人們開始認識到這些普遍存在的小RNA分子在真核基因表達調控中有著廣泛的作用。目前已經發現的 miRNA中的多數具有和其他參與調控基因表達的分子一樣的特徵在不同組織、不同發育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNAs表達模式具有分化的位相性和時序性，提示miRNAs有可能作為參與調控基因表達的分子，具有重要意義。轉基因技術中的重要環節是如何將目的基因高效、安全的導入靶細胞並得到理想的表達。為此，多種基因導入系統被廣泛用於轉基因動物製備的試驗性研究中。非病毒載體如脂質體、納米粒、微乳、聚合物膠團等具有安全、無免疫原性等優點，但其轉染效率相對較低，難以使攜帶的目的基因得到高效穩定的表達，而慢病毒(Ieniivirus)載體是以HIV-I(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發展起來的基因治療載體。它的轉染效率高， 可使目的基因持續、穩定地表達，被較早的應用於轉基因動物的製備技術中。Grew等將報告基因LacZ及GFP同時構建到慢病毒載體Pony-GFP-Lacz，並注射到新生雞蛋的囊胚腔中，在子一代、子二代各組織中均檢測到目的基因的表達。慢病毒載體也可與精子介導基因轉移(SMGT)技術相結合，將攜帶外源基因的重組載體注射曲細精管感染動物的精原幹細胞，使外源DNA整合到動物精原幹細胞上，通過自然受精產生轉基因動物。Hamra等 [Hamra F,Gatlin J, Chapman K,et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germline stem cells. Proc Natl Acad Sci,2002,99 (23) 14931-14936.]用LV-EGFP轉染體外培養的精原幹細胞，然後將整合有LV-EGFP的精原幹細胞移植到經化學方法去除精原細胞的野生型雄性大鼠睪丸，移植60天後，與雌鼠交配，獲得44隻子代大鼠中，13隻子代檢測到報告基因，證明LV可整合到精原細胞DNA上經自然交配製備轉基因動物。慢病毒載體通過結合RNA幹擾(RNAi)等有效的技術手段對許多遺傳性疾病及腫瘤的基因治療都已取得了很大的進步。為提高脂肪比例較大的家畜的瘦肉率和使瘦肉率高的優良性狀得到穩定遺傳，本發明構建了針對綿羊MSTN基因的microRNAs (miRNAs，即微小RNA)慢病毒載體，轉入綿羊的基因組，抑制MSTN的表達，使其獲得雙肌性狀，為培育瘦肉率高的雙肌性狀的綿羊新品種奠定了基礎
發明內容
本發明根據GenBank資料庫中綿羊MSTN基因的mRNA序列，構建了 4對針對 MSTN 基因的 miRNA oligo，其序列為 Sequnence N0. 1、Sequnence NO. 2、Sequnence NO. 3、 Sequnence Ν0· 4、Sequnence Ν0· 5、Sequnence NO. 6、Sequnence NO. 7、Sequnence NO. 8,另外還設計了一對陰性對照的miRNA oligo其序列為Sequnence N0. 9、Sequnence NO. 10。並將幹擾效果最好的包含Sequnence NO. USequnence NO. 2的幹擾序列克隆到慢病毒幹擾載體上，得到慢病毒幹擾載體pLENTi6. 3-MR085_l。本發明通過對所述的5對oligo退火得到雙鏈，並將雙鏈插入到miRNA表達載體 pcDNA 6. 2-Gff/EmGFPmiR 中，構建 5 個 miRNA 質粒。本發明全合成了MSTN基因並構建了所述基因的高表達載體pcDNA3. I-Ovis aries MSTN。本發明將上述的5個miRNA質粒與MSTN高表達載體共轉染293T細胞。24小時後檢測螢光的表達，並通過qPCR的方法檢測幹擾載體對靶基因的幹擾效果。結果顯示上述構建的pcDNA 6. 2-Gff/EmGFPmi-MR085-l幹擾質粒的幹擾效果最好，其對MSTN基因的沉默效率達92%。本發明將幹擾效果最好的pcDNA 6. 2-GW/EmGFPmi-MR085_l幹擾質粒，用Eag I酶切，純化酶切產物，再經BP重組和LR重組得到包含Sequnence NO. 1、Sequnence NO. 2的慢病毒幹擾載體pLENTi6. 3-MR085_l。本發明將上述慢病毒幹擾載體轉染293T細胞，製備病毒原液並且滴定所得病毒的滴度。包裝所得的攜帶MSTN-miRNA的慢病毒滴度達9. 3 X 109TU/ml。將所述miRNA慢病毒幹擾表達載體pLENTi6. 3_MR085_1與脂質體和臺酚藍混合， 製備成轉染液。然後採用微創手術，將上述轉染液分多點注射入綿羊兩側的睪丸中再與雌性交配，得到陽性的轉基因子代綿羊。


圖IMSTN基因用XhoI和EcoRI雙酶切電泳照片。1 :MSTN基因用XhoI和EcoRI雙酶切；2 =DNA Marker。圖2pCDNA3. 1⑴載體用XhoI和EcoRI雙酶切電泳照片。1 :pCDNA3. 1⑴載體的 XhoI 和 EcoRI 雙酶切；2 :DNA Marker。圖3幹擾質粒對MSTN基因的沉默效率。將含有所設計的5對幹擾序列(陰性對照、MR085-l、MR085-2、MR085-3、MR085-4)的 miRNA 表達載體 pcDNA 6. 2-Gff/EmGFPmi 與高表達MSTN基因的pcDNA3. I-Ovis aries MSTN質粒，共轉染293T細胞，幹擾序列對MSTN基因的沉默效率。圖4內參基因擴增曲線。共轉染幹擾質粒和高表達MSTN基因質粒的293T細胞其內參基因的擴增情況。圖5內參基因溶解曲線。共轉染幹擾質粒和高表達MSTN基因質粒的293T細胞其內參基因的檢測引物的溶解曲線。圖6MSTN基因擴增曲線。共轉染幹擾質粒和高表達MSTN基因質粒的293T細胞其 MSTN基因的擴增情況，包含所有的樣品轉染幹擾質粒、對照質粒和空白對照。圖7MSTN基因溶解曲線。共轉染幹擾質粒和高表達MSTN基因質粒的293T細胞其 MSTN基因檢測引物的溶解曲線，其只有一個峰，證明該對引物擴增特異性很好。圖8慢病毒幹擾質粒病毒包裝後24h細胞情況(A 螢光視野；B 可見光視野)。圖9病毒濃縮液稀釋IO3時螢光表達情況(螢光視野)。圖10病毒濃縮液稀釋IO4時螢光表達情況(螢光視野)。圖11病毒濃縮液稀釋IO5時螢光表達情況(螢光視野)。圖12病毒濃縮液稀釋IO6時螢光表達情況(螢光視野)。圖13病毒濃縮液稀釋IO7時螢光表達情況(螢光視野)。實施例1慢病毒幹擾載體的構建1.材料和方法1. 1 材料DH5 alpha感受態細胞；T4 DNA ligase (1U/μ 1) (Invitrogen) ；pCDNA3. 1 (+)載體 (invitrogen 公司)；EcoR I,Xho I (NEB 公司)；Ligase (NEB 公司)。HEK293 細胞(Shanghai Invitrogen) ；DMEM+10 % 胎牛血清(Invitrogen) ；lipofectamine2000(Invitrogen)； OptiMEM 培養液(Invitrogen) ；0.05 % Trypsin (Invitrogen) ；Trizol(Invitrogen)； EagI (NEB) ； ；LR clonase II(Invitrogen) ；pD0NR221(Invitrogen) ；pLenti6. 3/V5-DEST(Invitrogen)；包裝質粒(Invitrogen) ；293FT 細胞(Shanghai Invitrogen)； 0.05 % Trypsin(Invitrogen) ；DMEM+10 % FBS(Invitrogen) ；Opti-MEM J^ # it (Invitrogen)。1· 2 方法(1)幹擾載體的構建檢索 GenBank 資料庫(http //www, ncbi. nlm. nih. gov/nucleotide)，獲取 she印myostatin 基因的 mRNA 序列，其序列號為 NM_001009428。根據 Invitrogen miRNA 設計系統，針對靶基因設計併合成4對miRNAoligo，和一對陰性miRNA0lig0，0lig0序列見
表一表一 miRNA oligo序列(含陰性對照序列)
權利要求
1.一種提高動物瘦肉率的新型幹擾載體pLentie. 3_MR085_1，其特徵在於，所述載體包含基因序列 Sequnence NO. 1 以及 Sequnence NO. 2。
2.一種 miRNA 表達載體 pcDNA 6. 2-Gff/EmGFPmiR,其特徵在於，所述 pcDNA 6. 2-GW/ EmGFPmiR 載體包含基因序列 Sequnence NO. 1 和 Sequnence NO. 2。
3.根據權利要求1所述的提高動物瘦肉率的新型幹擾載體，其特徵在於，所述載體可以降低綿羊組織細胞MSTN基因mRNA的水平。
4.根據權利要求1所述的提高動物瘦肉率的新型幹擾載體，其特徵在於，所述載體可以應用於培養高瘦肉率的綿羊新品種。
全文摘要
本發明公開了一種提高動物瘦肉率的新型慢病毒幹擾載體pLenti6.3-MR085_1，其序列包含基因序列Sequnence NO.1和Sequnence NO.2。本發明針對綿羊MSTN基因的核苷酸序列設計合成多對miRNA單鏈寡核苷酸，構建了miRNA表達載體，通過功能性實驗篩選，得到了抑制效果較強的pcDNATM6.2-GW/EmGFPmi-MR085-1載體，該載體包含基因序列Sequnence NO.1和Sequnence NO.2，進一步將基因序列Sequnence NO.1和Sequnence NO.2構建到miRNA慢病毒幹擾載體。本發明還公開了上述新型載體的應用。
文檔編號C12N15/867GK102220377SQ20111009218
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月13日 優先權日2011年4月13日
發明者苗向陽 申請人:中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所