GeXP多重PCR技術用於人乳頭瘤病毒HPV檢測和分型的研究的製作方法

2023-06-01 03:19:11 1

專利名稱：GeXP多重PCR技術用於人乳頭瘤病毒HPV檢測和分型的研究的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術應用領域，涉及各級疾病預防控制機構，哨點醫院等用於對宮頸分泌物等標本的多種人乳頭瘤病毒HPV亞型(包括HPV6，HPVl 1, HPV31，HPV33和 HPV52)感染的同時檢測和分型。具體通過計算機軟體分析人乳頭瘤病毒HPV各亞型基因的保守序列，分別設計出針對各亞型的型特異性引物，進行單管多重(6重)PCR(包括內參基因foiasep-DNA)，整個反應不到2個小時。本專利既克服了常規單管多重螢光定性PCR檢測不能分型的缺點，也克服了常規晶片檢測方法的操作繁瑣，時間較長，成本較高等缺點，為 HPV的分型技術提供了新的思路，其高特異、高靈敏、快速的特點為實現HPV亞型感染的快速準確篩查鑑別提供了有力的技術支撐，對研究患者HPV感染型別分布特點和提高由HPV 各亞型引起的癌症病變的防治水平具有重要意義。
背景技術：
宮頸癌是一種嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤，發病率在女性惡性腫瘤中居第二位，在一些發展中國家和地區仍居第一位。據全球範圍統計，在所有婦科惡性腫瘤中宮頸癌佔10%，每年有471，000例新發病例以及215，000例死亡病例。人乳頭瘤病毒(HPV)與宮頸癌密切相關，它是一種雙鏈環狀DNA病毒，由早期基因、晚期基因(晚期基因Ll和L2分別編碼主要衣殼蛋白與次要衣殼蛋白)和一個不翻譯的上遊調節區三部分組成，研究發現 99%以上的宮頸癌有HPV感染，HPV是宮頸癌的主要致病因子。依據與宮頸癌的關係，將 HPV 分為高危型和低危型，高危型包括:HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、66、69 等型；低危型包括6、11、43、44等型。HPV高危亞型中，中國南方地區52、58亞型的感染率較北方高，在臺灣除HPV16、18外，31、33、35的感染率較高，說明在中國人中16、18、31、33、52、 58為最常見亞型，但由於中國地域寬廣，人口眾多，故這方面的資料較為缺乏，有待進一步研究。低危亞型中，HPV6，11為常見感染亞型，可致巨大溼疣、尖銳溼疣、呼吸道乳頭瘤、結膜乳頭瘤等疾病。要進一步研究不同亞型HPV在不同種族人群中的致病性、治療和預後情況， 了解HPV臨床感染類型的變化趨勢以及降低宮頸癌的發生和死亡，就需要建立一種適合於臨床應用的、能夠對所有已知高危類型和常見低危類型HPV同時進行篩查和分型檢測的新方法。故本研究初步選取中國人常見的HPV31，33，52三種高危型和HPV6，11兩種低危型作為研究對象。目前，HPV分型方法有很多，常見的有細胞學檢測方法和分子生物學技術方法，如薄層液基細胞學技術和塗片自動檢測技術、雜交捕獲試驗(HC)、原位雜交技術(ISH)和PCR 方法等。其中，PCR技術較為成熟，具有快速、簡便、靈敏等特點。由於單重PCR通量不高的的局限性，本研究採用一種新型的基於GeXP的多重PCR技術，它採用通用引物引發靶基因擴增，能有效解決多重PCR過程中的擴增偏愛性，採用毛細管電泳及螢光標記擴增產物提高的檢測靈敏度和解析度，根據擴增產物片段長度判斷結果，有助於提高檢測特異性。在我們的前期工作中，運用基於GeXP的多重PCR技術成功檢測了新甲型流感病毒和季節性流感病毒。本研究首先用單重PCR技術檢測HPV6，11，31，33和52單重感染的HPV臨床樣本，以驗證GeXP引物的特異性，在此基礎上建立了一種新型多重GeXP-PCR技術檢測，以同時檢測和鑑定生殖道感染中中國人常見的HPV6，11，31，33和52等亞型。

發明內容
1.以GenBank公布的引物序列為參考，從NCBI上下載已知序列使用CLUSTAL X 軟體進行序列比對，選取對於針對各個靶基因高度保守而對於其它型別高度特異的基因區段，由eXpress Profiler Software設計六重引物，如表1 表1 GeXP檢測人乳頭瘤病毒(HPV)的核苷酸引物序列表
權利要求
1.一種用於同時檢測人乳頭瘤病毒朋￥6，朋￥11，朋￥31，朋￥33和朋￥52的多重PCR技術，其中包括用於人乳頭瘤病毒HPV6，HPV11，HPV31，HPV33和HPV52檢測的型特異性引物和通用引物。
2.權力要求1所述的多重PCR技術的引物和通用引物包括表1所列的基因序列及其每種序列的互補序列或變體。
3.權力要求1所述的多重PCR檢測技術包括人乳頭瘤病毒HPV6，HPV11，HPV31，HPV33 和HPV52及其變異株。
4.權力要求3所述的本發明的應用範圍包括各級疾病預防控制機構，醫院用於人乳頭瘤病毒HPV6，HPVl 1，HPV31, HPV33和HPV52同時檢測和分型。
5.權力要求1所述的同時檢測人乳頭瘤病毒HPV6，HPV11，HPV31，HPV33和HPV52的多重PCR技術的反應程序和檢測程序。
全文摘要
GeXP多重PCR技術用於人乳頭瘤病毒HPV檢測和分型的研究，本發明屬於生物技術應用領域，涉及各級疾病預防控制機構，醫院等用於對宮頸分泌物等標本的多種人乳頭瘤病毒HPV亞型(包括HPV6，HPV11，HPV31，HPV33和HPV52)感染的同時檢測和分型。具體通過計算機軟體分析人乳頭瘤病毒HPV各亞型基因的保守序列，分別設計出針對各亞型的型特異性引物，進行單管多重(6重)PCR(包括內參基因Rnasep-DNA)，整個反應不到2個小時。本發明既克服了常規單管多重螢光定性PCR檢測不能分型的缺點，也克服了常規晶片檢測方法的操作繁瑣，時間較長，成本較高等缺點，為HPV的分型技術提供了新的思路，其高特異、高靈敏、快速的特點為實現HPV亞型感染的快速準確篩查鑑別提供了有力的技術支撐，對研究患者HPV感染型別分布特點和提高由HPV各亞型引起的癌症病變的防治水平具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102485912SQ20101056795
公開日2012年6月6日 申請日期2010年12月1日 優先權日2010年12月1日
發明者楊夢婕, 王淼, 羅樂, 聶凱, 蘆春斌, 鄭建新, 馬學軍 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所