回收重組HBsAg的方法
2023-05-31 10:26:51
>蛋白質毫克數/克細胞乾重HBsAg毫克數/克細胞乾重NanojetLAB30PL粗提物最後的含水物質粗提物最後的含水物質發酵NJ-4128.21.9810.81.77發酵NJ-6100.41.297.11.41發酵NJ-792.60.996.91.10平均值107.11.428.31.43對比實施例1通過溼磨細胞破碎多形漢遜氏酵母回收HBsAg1．玻璃球勻漿器下面說明的裝置用於溼磨方法FrymaCoballMillMS18破碎原理溼磨轉子直徑192mm有效研磨體積1200ml研磨體的填入有效研磨體積的70-80％研磨間隙6.50mm分離間隙0.05mm篩間隙0.20mm差示間隙0.18mm轉子圓周速度14m/s冷卻雙層夾套和轉子冷卻細胞乾重100-120克/升體積流速(200-300)毫升/分鐘密封材料乙烯丙烯DynoMillKDLSpezial:破碎原理溼磨有效研磨腔體積600ml攪拌盤4，聚氨基甲酸乙酯研磨體的填入有效研磨體積的80-85％轉速6.8m/s同軸環間距0.1mm冷卻雙套夾套細胞乾重70克/升體積流速100毫升/分鐘密封材料Viton使用直徑0.45-0.55mm的玻璃球進行溼磨。2．微生物及其培養使用和實施例1相同的材料，但是發酵培養肉湯的細胞密度是70-120克/升細胞乾重。3．細胞破碎根據實施例1所述進行前處理和後處理。DynoMillKDLSpezial中溼磨通過體積流速為100毫升/分鐘的蠕動泵向臥式破碎室連續加入含有70克/升細胞的細胞懸浮液。同時，為了蛋白酶抑制，加入80mMPMSF溶液，在立即混合下1/40的細胞懸浮液流向破碎室的分開的入口部分。在一個循環內破碎細胞懸浮液。FrymaCoballMillMS18內溼磨這裡也是通過蠕動泵連續向豎式破碎室加入細胞懸浮液。但是，該實施例中的細胞密度是100-120克/升，體積流速設定在200-300毫升/分鐘。與DynoMillKDLSpezial相對照，蛋白酶抑制劑貯存液(80mMPMSF)不在球磨機出口之前加入。細胞懸浮液在一個循環內被破碎。終細胞提取物中的PMSF終濃度是2mM。以50升規模進行使用FrymaCoballMillMS18進行破碎試驗。在使用DynoMillKDLSpezial進行的溼研磨中使用10升發酵規模。為了保證可比性，使HBsAg的產率與細胞破碎之前各細胞量相關聯。4．結論4.1DynoMill玻璃球破碎的破碎效率菌株多形漢遜氏酵母K3/8-1起始材料10升發酵培養基RL-98/194.2Fryma玻璃球破碎達到終產物最後的含水物質」的破碎效率菌株多形漢遜氏酵母K3/8-1起始材料50升發酵培養基RL-98/26,/29,/35實施例2溼磨和高壓破碎之間的比較1．Nanojet高壓破碎和DynoMill玻璃球破碎的破碎效率在與DynoMill玻璃球研磨機中細胞破碎比較時，從相同的起始物每克乾物質釋放出高四倍的產物的量。而同時總的蛋白質量只增加了2倍。結果，從相同的起始物釋放出了更大量的產物(HBsAg)。在得到最後的含水物質的所有隨後的處理步驟之後，高壓破碎方法中最初的產物產率保持增長，產物的質量相當於標準方法(溼磨)的質量。這可以利用所描述的Lowry和ELISA的組合來證明。2．Nanojet高壓破碎和FrymaCoballMill玻璃球破碎的破碎效率從各三次通過的平均值來看，與玻璃球破碎相比，Nanojet高壓破碎每克乾物質釋放出高2.9倍的產物的量。細胞破碎更高的產物量得到高2.6倍的量的最後的含水物質中純化的產物。根據下面的分析證明證實，兩種破碎方法的產物的質量處於相同規格。3．分析結果3.1高壓破碎樣品rHBsAg批量號.NJ6GFC1參照WHO(世界健康組織)和歐洲藥學會提供的信息的固定的限定值2高分辨-誘導偶聯的等離子體-質譜3鱟變形細胞溶解物試驗(檢測內毒素的方法)4內毒素單位3.2玻璃球破碎樣品rHBsAg批量號.RL98/35最終物質(FinalBulk)1參照WHO(世界健康組織)和歐洲藥學會提供的信息的固定的限定值2高分辨-誘導偶聯的等離子體-質譜3鱟變形細胞溶解物試驗(檢測內毒素的方法)4內毒素單位4．結論上述分析提供了與現有技術作出的設想相反的證據，高壓破碎對於酵母細胞，至少對於甲基營養型酵母細胞相當有利。通過高壓破碎，產率可以提高2.5-4倍。權利要求1．一種回收重組HBsAg的方法，其中使用高壓勻漿器破碎能表達HBsAg的重組甲基營養酵母細胞，並且從得到的細胞碎屑回收HBsAg。2．根據權利要求1的方法，特徵在於所述重組甲基營養酵母細胞是漢遜氏酵母屬的種的酵母細胞。3．根據權利要求1或2的方法，特徵在於所述酵母細胞在50-150克/升細胞乾重的細胞密度下用於破碎。4．根據權利要求1-3任一項的方法，特徵在於在高壓勻漿器的勻漿裝置中的1000-2000的壓力下破碎酵母細胞。5．根據權利要求1-3任一項的方法，特徵在於產物出口處的溫度是2℃至15℃。6．根據權利要求1-5任一項的方法，特徵在於細胞破碎3-6次循環(通過)。7．根據權利要求1-6任一項的方法，特徵在於細胞破碎之後，使重組HBsAg進行進一步的分離和純化步驟。全文摘要本發明涉及一種獲得重組HBsAg的方法。根據該方法,使用高壓勻漿器破碎能表達HbsAg的重組甲基營養酵母細胞,並且從得到的細胞碎屑回收HbsAg。本發明方法特徵在於每克細胞乾重的高產品產率,因此是對已知的從微生物獲得HBsAg的方法的相當大的改進。文檔編號C12N1/19GK1302329SQ00800644公開日2001年7月4日申請日期2000年4月17日優先權日1999年4月23日發明者M·派昂泰克,M·維尼格申請人:萊因新生物技術工藝和產品公司