一種人工合成的sp系列多肽及其用途
2023-06-24 16:14:06
一種人工合成的sp系列多肽及其用途
【專利摘要】本發明公開了一類SP系列多肽及其在治療癌症方面的用途，具體胺基酸序列如SEQ?ID:1-11所示。SP系列多肽可治療慢性髓細胞性白血病，通過激活細胞內PP2A活性，去磷酸化BCR/ABL，從而起到治療白血病的作用，並且此多肽對伊馬替尼耐藥的白血病同樣有效。SP系列多肽通過SET/PP2A途徑發揮作用，具有廣泛的治療癌症的用途。
【專利說明】—種人工合成的SP系列多肽及其用途
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物化學中的多肽藥物【技術領域】，具體涉及多肽的用途，即SP系列多肽具有治療癌症的用途。
【背景技術】
[0002]慢性髓細胞性白血病(CML)，亦稱慢性粒細胞白血病(CGL)，是一類起始於骨髓內形成血液的細胞發生癌變，並浸潤血液的癌症。患CML後，白血病細胞在體內聚集需要很長時間，許多患者在幾年內甚至沒有任何症狀。與此同時，癌細胞浸潤機體其他組織器官，包括脾臟。CML亦可轉變成癌細胞迅速生長的急性白血病，其癌細胞可以快速浸潤機體各個器官。任何造血細胞或者淋巴樣細胞都可以轉變成白血病細胞。一旦產生這樣的變化，這些白血病細胞就不能進行正常的成熟程序。一些白血病細胞可能增殖速度加快，但大多數情況下，在特定時間卻不會死亡。它們繼續存活並聚集起來，經常排擠正常的骨髓細胞，導致血紅細胞數量驟減。隨著時間的推移，白血病細胞浸潤周邊細胞並轉移至其他組織，從而影響機體相關功能。
[0003]患CML的病例佔總白血病病例的10%左右，男性患這種疾病的可能性略高於女性，且白種人患病可能性高於非裔美國人。患CML的患者年齡大約在64歲，幾乎半數以上患者年齡在65歲及以上。大多數CML發生於成人間，極少數發生於兒童間，一般而言，對兒童的治療與成人類似。2014年美國癌症協會公布約有5980患者確診為CML(3130名男性患者和2850名女性患者)，其中約810人死亡(550名男性患者和260名女性患者)。
[0004]CML的症狀 通常比較模糊，且經常由其他原因引起，包括:虛弱、疲勞、盜汗、體重減輕、發燒、骨痛、脾擴大(感覺左側胸廓有異物)、腹部有疼痛感或者腫脹感和吃少量食物就感覺有飽腹感。但是這些並不只是CML會出現的症狀，它們也會出現在其他癌症症狀中，或者非癌症的疾病中。
[0005]許多CML患者在被確診時都未出現任何症狀。白血病通常是患者在做其他非相關的疾病檢查中發現，而且即使已有部分症狀，它們經常是模糊的且非特異性的。通常會做全血檢查，CML患者通常體內白細胞數量增多，且含有許多未成熟的細胞。有時患者體內紅細胞和血小板的數量會降低，儘管這些症狀表明是白血病，患者一般仍要進行其他血液和骨髓檢查以便確診。
[0006]對CML的治療主要包括以下幾個方面:靶向治療、免疫治療、化學治療、放射性療法、手術、幹細胞移植，其中靶向治療是主要手段。
[0007]常用的化學治療通常指任何能治療癌症的藥物，在這裡主要是指常規的細胞毒藥物，主要通過口服或者注射的方式進入人體血液循環，殺死那些增殖分化迅速的細胞。然而體內生長迅速的細胞不僅有癌細胞，正常細胞中也有，如骨髓內細胞、口腔及腸內細胞及毛囊內細胞等，它們通常也會被化療藥物攻擊，從而導致脫髮、口腔潰瘍、噁心嘔吐、易瘀紫出血、疲勞等副作用。現在通常用於輔助靶向藥物治療，或者在靶向藥物失去藥用效果後使用。[0008]CML細胞內存在名為BCR-ABL的癌基因，是由9位、22位染色體重排導致的，在正常細胞中並不存在。這個基因轉錄翻譯成BCR-ABL蛋白，會導致CML細胞生長繁殖超出控制。BCR-ABL是一類酪氨酸激酶蛋白，如今，靶向BCR-ABL的酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)藥物是治療CML的首選藥物。這些藥物對正常細胞影響甚微，所以它們的副作用較之其他用於治療CML的藥物要小得多，例如化學藥物或幹擾素。常用的靶向藥物如下所示:
伊馬替尼(格列衛)是第一個靶向BCR-ABL的藥物，很快成為治療CML的首選藥物，以第一代酪氨酸激酶抑制劑成名。幾乎所有的CML患者都對伊馬替尼治療有應答，大多數患者能生活許多年。但這個藥物並不能完全治好白血病，所以需要患者每日服用，直到失去治療效果。對於有些患者，伊馬替尼最終失去治療功能，這就是所謂的伊馬替尼耐藥。伊馬替尼耐藥主要是CML細胞內某些基因突變導致的，有些耐藥可以通過加大用藥量解決，但有些需要另一種藥物，這就引入TKIs第二代產品——達沙替尼/尼羅替尼。它們通常用於伊馬替尼耐藥或者伊馬替尼副作用患者不能忍受的情況，不過仍然具有很大的副作用，且用藥劑量要高於伊馬替尼。普納替尼是最新的靶向BCR-ABL的TKIs產品。當所有其他TKIs產品失去作用時，才使用普納替尼進行CML治療。或者當CML細胞內發生T315I突變時，也採用普納替尼進行治療。T315I突變通常發生於長期使用其他TKIs產品治療CML產生耐藥性後，目前為止，有且僅有普納替尼能夠繼續治療此耐藥行為。但是，普納替尼對患者身體的副作用相當嚴重，除了常見的虛弱、頭痛、腹痛、疹子或其他皮膚病外，還會在體內產生血塊，容易導致心臟病、中風及阻塞四肢動脈靜脈等。更嚴重的是此藥物會使心臟肌肉萎縮，將導致胰腺炎、肝臟衰竭和充血性心力衰竭等。
[0009]因此，現今急切需要一種新的作用機制的藥物，能夠安全有效治療CML。
【發明內容】
[0010]C0G133是第一個抗炎症和神經保護物質的多肽，來源於人體內載脂蛋白(apoE)受體結合區域133-149位胺基酸序列。C0G112是C0G133的N端融合了源於果蠅屬觸角蛋白的蛋白轉移結構域(PTD)序列形成的融合肽，生物活性較C0G133大大提高。ApoE系列多肽即具有apoE蛋白133-149位胺基酸序列的多肽，此前研究發現其具有治療紊亂性疾病，包括中樞神經系統(CNS)炎症、外傷性腦損傷、炎性腸病、腦缺血症、動脈粥樣硬化、敗血症、關節炎、阿爾茲海默症和其他大腦神經紊亂。
[0011]本發明通過對C0G133進行多肽改造，人工合成了一系列SP系列多肽，如下所示: C0G133 Ac-LRVRLASHLRKLRKRLL-NH2 (SEQ ID NO:1)
SP2 Ac-LRVRLASVLRKLVKRLL-NH2 (SEQ ID NO:2)
SP2 Ac-LRVRLASHLRkLRKRLL-NH2 (SEQ ID NO:3)
SP4 Ac-LRVRLASHLRKLRkRLL-NH2 (SEQ ID NO:4)
SP5 Ac-LRVRLASHLRkLRkRLL-NH2 (SEQ ID NO:5)
SP6 Ac-LRVRLASHLrKLRKRLL-NH2 (SEQ ID NO:6)
SP7 Ac-LRVRLASHLRKLrKRLL-NH2 (SEQ ID NO:7)
SP8 Ac-LRVRLASHLrKLrKRLL-NH2 (SEQ ID NO:8)
SP9 Ac-ASHLRkLRKRLL-NH2 (SEQ ID NO:9)
SPlO Ac-ASHLRKLRkRLL-NH2 (SEQ ID NO:10)CU063 Ac-LRVRLASVLRKLVkRLL-NH2 (SEQ ID NO:11)
其中小寫k表示D型賴氨酸，小寫r表示D型精氨酸，Ac表示乙醯化羧基端。
[0012]對於⑶063，本發明期望通過引入D型胺基酸，能延緩多肽降解，在體內獲得更長半衰期來獲得更好的藥理活性。
[0013]本發明提供了用於治療白血病的方法，包括將至少一種SP系列多肽與所述肽不存在時會發生的相比減少疾病症狀的量施用。在一個實施方案中，所述白血病是慢性髓細胞性白血病(CML)。SET，亦被稱為I2PP2A，是一個有效的生理水平上的PP2A抑制劑。SET在CML細胞中過量表達並且抑制PP2A活性，維持癌基因BCR/ABL激酶處於持續激活狀態。加入SP系列多肽後，可以激活CML細胞內部PP2A活性，去磷酸化相關細胞增殖和存活的調節物，從而抑制BCR/ABL激酶活性，達到減少白血病產生的目的。此機制與酪氨酸激酶抑制劑(伊馬替尼、達沙替尼)作用機制不一樣，後者是直接作用於BCR/ABL激酶，會受此激酶突變而影響藥物活性。因此，SP系列多肽具有治療Bcr/Abl基因突變的CML的能力。
[0014]在本發明的一個實施方案中，SP系列多肽在受處理的細胞中增加PP2A的活性。PP2A是一個重要的絲蘇氨酸磷酸酶，是一個異質三聯體，包括兩個常見組分，一個催化亞基(PP2Ac)和一個支架亞基(PP2A A)組成催化中心二聚體，同時連接著一個由四種不同家族基因編碼的調節B亞基。PP2A可以調節細胞內大多生物學進程，包括細胞增殖、凋亡、發育和遷移。PP2A活性的喪失或者受抑制會導致PP2A嚴重失去抑制腫瘤的功能。本發明人有理由相信SP系列多肽可減少一種或多種與癌症相關的症狀，包括但不僅限於腫瘤形成、腫瘤生長、癌細胞數、癌細胞向健康組織的擴散以及減少的存活。SP系列多肽可用於治療多種白血病(急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞性白血病、慢性淋巴細胞白血病、慢性髓細胞性白血病等)、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、結腸癌、肺癌、胰腺癌、腦癌、皮膚癌(黑色素瘤和非黑色素瘤)、膀胱癌、子宮內膜癌、腎細胞癌、胃癌、食道癌、肝癌、淋巴瘤和肉瘤等。
`[0015]本發明的多肽可通過如本領域已知的標準技術產生。本發明的肽可附加多種標記部分如放射性標記、螢光標記以供檢測和示蹤。螢光標記包括但不僅限於螢光素、曙紅、羅丹明、香豆素和NBD螢光團等。
[0016]對本文中公開的肽的修飾以增強與這些肽相關的功能活性可容易的由本領域技術人員達成。例如，用於本發明方法中的肽可經化學修飾或偶合於其他分子以增強如溶解性、血清穩定性等參數，而保留功能活性。具體而言，本發明的肽可在N-端乙醯化和/或在C-端醯胺化，或偶合、複合或融合於增強其血清穩定性的分子，包括但不僅限於白蛋白、免疫球蛋白及其片段、轉鐵蛋白、脂蛋白、脂質體、PEG和右旋糖酐等。
[0017]本發明的肽不僅包括所有公開的SP系列多肽的胺基酸序列，同時還還包括那些通過例如同源重組、定點或PCR誘變，以及其他動物物種的相應肽，其中所述動物物種包括但不僅限於兔、大鼠、豬、牛、羊、馬和非人靈長類物種，和包括其中的肽用除了天然存在的胺基酸之外的部分經取代、化學、酶或其他合適手段而共價修飾的衍生物。
[0018]本發明公開的SP系列多肽，包括但不僅限於SP系列多肽及其衍生物，還可為游離形式或鹽形式，其中所述鹽是藥學上可接受的。這包括鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳等的無機鹽。還可用包括但不僅限於乙酸、丙酸、丙酮酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、水楊酸等製備所述肽的多種有機鹽。
[0019]本發明公開的SP系列多肽可與藥學上可接受的載體組合。所述載體可為液體，從而使得該組合物適用於腸胃外施用，或可為固體，即配製用於口服的片劑或丸劑。此外，所述載體可為可噴霧的液體或固體形式，從而使得所述組合物適用於吸入。本發明的肽還可配製為供局部施用，例如乳膏或凝膠的形式，局部製劑對於治療皮膚癌特別有用。
[0020]本發明公開的SP系列多肽可通過不同途徑對人體給藥，具體的給藥途徑包括口月艮、非胃腸道給藥、口腔吸入、直腸給藥、鼻腔給藥、舌下給藥及通過植入性容器給藥。非胃腸道給藥又包括在皮下、靜脈內、肌肉內、關節內、滑膜腔內、胸骨內、鞘內、肝內、損傷部位內和顱內注射或浸滲。
[0021]本發明公開的SP系列多肽在用於人體疾病預防和治療時，所用的劑量受多種因素的影響，這些因素包括年齡、體重、健康狀況、性別、種族、飲食習慣、給藥時間、排尿頻率及是否使用其他藥物，等等。
[0022]本發明的肽可單獨用於治療癌症或與其他通常用於治療癌症的治療劑組合使用，所述治療劑例如化療劑(苯丁酸氮芥、環磷醯胺)，皮質類固醇(潑尼松、潑尼松龍)，氟達拉濱，噴司他丁，克拉屈濱，伊馬替尼，達沙替尼，激素療法等。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖 1C0G133、SP2、CU063 多肽作用 K562、BaF3p210WT、BaF3p210T315I 細胞株 72h的細胞毒性。
[0024]圖 2C0G133、SP2、CU063 多肽於 24h、48h、72h 分別對 K562、BaF3p210WT、BaF3p210T315I細胞株的細胞毒性。
[0025]圖3C0G133、SP2 多肽對 K562、BaF3p210WT、BaF3p210T315I 細胞株作用後，細胞內SET, PP2A-C, BCR-ABL, p-BCR-ABL 等蛋白的表達情況。
[0026]圖4C0G133、SP2多肽及其分別與岡田酸(OA)聯用，作用於K562、BaF3p210WT、BaF3p210T315I細胞株後，細胞內PP2A的活性。
【具體實施方式】
[0027]列出下述實施例用於說明本發明，但不應視為對本發明的限制。
[0028]實施例1:
BCR-ABL融合會產生一個重達p210或pl80的蛋白質(P為計量細胞內蛋白的質量單位，相當於KDa)。選用具有T315I突變的伊馬替尼耐藥株——鼠源BaF3p210T315I細胞，進行細胞毒性篩選。
[0029]檢測C0G133、SP2-SP10、CU063 等多肽對 K562、BaF3p210WT、BaF3p210T315I 等細胞作用24h、48h、72h的半數抑制濃度(IC5tl)。
[0030]實驗步驟:
1向 96 孔板中接種 K562、BaF3p210WT、BaF3p210T315I 細胞(每孔 2.5-4X103 個細胞)，12-18h後每孔加入100 μ I含有多肽的培養基，多肽的最大濃度為64 μ Μ，濃度2倍遞減。
[0031]2待多肽作用24h、48h、72h後，將板從培養箱取出，室溫下放置30min後，加入CellTiter Glo Reagent (試劑於室溫下平衡,96孔板每孔加入25 μ I),將板置于振蕩器上振蕩5min (300 - 500rpm),於室溫下放置IOmin-1h (具體時間根據細胞種類確定)。
[0032]3.讀數後求 IC5tl (Perkin Elemer2103Multipliable Reader)。[0033]在K562、BaF3p2IOffT細胞株中檢測C0G133、SP2-SP10多肽對細胞的半數抑制率。
[0034]表1:K562/BaF3p210WT細胞株中多肽的活性篩選
【權利要求】
1.一種源於載脂蛋白的人工設計合成的多肽，稱為SP系列多肽，其胺基酸序列為SEQID NO: 1-11，具有治療癌症的用途。
2.根據權利要求1的多肽，其特徵是，所述多肽的N端經乙醯化修飾、C端經醯胺化修飾。
3.根據權利要求1所述的癌症，是指白血病。
4.根據權利要求3所述的白血病，是指慢性髓細胞性白血病(CML)。
5.根據權利要求1所述的多肽，還包括那些通過例如同源重組、定點或PCR誘變，以及其他動物物種的相應肽。
6.根據權利要求1所述的多肽，還包括以游離形式或者鹽形式存在的多肽。
7.根據權利要求1所述的多肽，還包括可與藥學上可接受的載體組合的多肽。
8.根據權利要求1所述的多肽，可單獨用於治療癌症或與其他通常用於治療癌症的治療劑組合使用。
9.根據權利要求1所 述的多肽，可通過不同途徑對人體給藥。
【文檔編號】C07K14/705GK103819554SQ201410088581
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月11日 優先權日:2014年3月11日
【發明者】陳依軍, 王淑珍, 戴雯, 謝偉全 申請人:中國藥科大學