具抗腫瘤作用的海蚯蚓蛋白酶cDNA的克隆與表達的製作方法

2023-05-30 20:35:56

具抗腫瘤作用的海蚯蚓蛋白酶cDNA的克隆與表達的製作方法
【專利摘要】具抗腫瘤作用的海蚯蚓蛋白酶cDNA的克隆與表達屬於生物【技術領域】，涉及到海蚯蚓消化道組織中一條具有GDSGGP保守序列的蛋白酶cDNA序列及克隆、與之對應的蛋白質序列及其在大腸桿菌中的表達。克隆到的編碼海蚯蚓蛋白酶的核苷酸序列全長777bp，編碼的海蚯蚓蛋白酶胺基酸序列長258個胺基酸，含15個胺基酸殘基組成的信號肽。獲得的重組蛋白酶能夠抑制腫瘤細胞增殖的作用，可作為抗腫瘤藥物，具有潛在的醫用前景。
【專利說明】具抗腫瘤作用的海蚯蚓蛋白酶cDNA的克隆與表達
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】:涉及到海蚯蚓蛋白酶的CDNA序列及其相應的胺基酸序列及在大腸桿菌中的表達，及其抑制腫瘤細胞的增殖，發揮抗腫瘤作用。
【背景技術】
[0002]蛋白酶是一類分布於動物、植物和微生物中能夠特異水解肽鍵的水解酶，其中部分為絲氨酸內切蛋白酶，這些蛋白酶在生物體發揮不同的生理作用，如凝集、纖溶、消化、免疫、調節胚胎發育等。近年來的實驗及臨床研究表明，一些蛋白酶能抑制腫瘤細胞生長，並且作為生物反應調節劑，具有輻射增效和化學增效等作用。蛋白酶具有抗腫瘤效應，其潛在的醫用前景，引起了科學界的廣泛關注。
[0003]海蚯蚓是我國海岸廣泛分布的一種海洋環節動物，常被用作釣餌。海蚯蚓最早記載於《中國藥用動物志》，用於癰瘡腫毒，有清熱解毒之功效。目前國內外有關海蚯蚓的研究報導不多。我們從海蚯蚓消化道組織中提取出總RNA，經RACE技術得到一種編碼蛋白質的cDNA，將此cDNA序列中活性肽部分構建入質粒pET_21a，轉化入大腸桿菌，誘導表達出一種重組蛋白，此蛋白質中含絲氨酸內切蛋白酶家族的保守序列GDSGGP，具有抑制腫瘤細胞增殖的活性。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是 提供一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其胺基酸序列。
[0005]為了實現上述發明目的，本發明採用以下技術方案:
以來自海蚯蚓消化道上皮細胞的mRNA為模板，採用同源序列克隆法，通過3' RACE、RACE技術，獲得了一種編碼具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列。將該序列表達活性肽的部分經PCR擴增，克隆到表達載體pET-2Ia上，在原核表達系統大腸桿菌E.coliBL21中誘導表達，生產具有抗腫瘤活性的重組海蚯蚓蛋白酶。重組海蚯蚓蛋白酶具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，可作為潛在的新型基因工程藥物。
[0006]海蚯蚓蛋白酶cDNA序列的克隆:
(O設計引物:根據絲氨酸蛋白酶家族的蛋白酶催化活性中心Ser附近所含的高度保守序列GDSGGP設計引物。
[0007](2)目的基因cDNA 3'端序列擴增及測序:由步驟(1)得到引物，和來自海蚯蚓消化道組織的總cDNA為模板，通過3' RACE CcDNASi末端快速擴增技術)擴增海蚯蚓蛋白酶的基因cDNA 3'端序列。PCR產物膠回收後分別連TA克隆載體，轉化細菌E.coli DH5 α，測序。
[0008](3)目的基因cDNA 5'端序列擴增及測序:根據獲得的目的基因cDNA 3'端序列設計兩對特異性引物，以來自海蚯蚓消化道組織的總cDNA為模板，採用5' RACECcDNA 5'末端快速擴增技術)，進行套式PCR，擴增海蚯蚓蛋白酶基因cDNA 5'端序列。PCR產物膠回收後分別連TA克隆載體，轉化細菌E.coli DH5a，測序。
[0009](4)拼接:應用contigexpress軟體對步驟(2)和(3)得到的目的基因cDNA端和5'端序列進行拼接，獲得本發明的海蚯蚓蛋白編碼基因的DNA (mRNA)序列。
[0010](5)根據上述步驟(4)得到的DNA (mRNA)序列，使用DNAMAN軟體，獲得該海蚯蚓蛋白酶cDNA編碼的胺基酸序列。
[0011]一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的編碼基因序列，該序列如下:
【權利要求】
1.一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶基因核苷酸序列，其特徵在於，此序列由901個鹼基對組成，此核苷酸序列為:
2.根據權利要求1所述的海蚯蚓蛋白酶基因核苷酸序列，其表達的蛋白質為海蚯蚓蛋白酶，其特徵在於，海蚯蚓蛋白酶由258個胺基酸組成，其胺基酸序列為:
【文檔編號】A61P35/00GK103555743SQ201310523442
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月30日 優先權日:2013年10月30日
【發明者】趙春玲 申請人:濰坊醫學院