一種從野生過山蕨裡提取總黃酮的新型工藝方法
2023-05-31 07:55:51 1
專利名稱：一種從野生過山蕨裡提取總黃酮的新型工藝方法
技術領域：
本發明屬於天然有機化學領域，涉及一種從大興安嶺野生過山蕨裡提取黃酮的方法，特別是涉及一種利用酶法提取，高速逆流色譜分離純化過山蕨總黃酮的新方法。
背景技術：
過山蕨，植株高達20釐米。根狀莖短小，直立，先端密被小鱗片；鱗片披針形，黑褐色膜質，全緣。葉簇生；基生葉不育，較小，柄長1-3釐米，葉片長1-2釐米，寬5-8毫米，橢圓形，鈍頭，基部闊楔形，略下延於葉柄；能育葉較大，柄長1-5釐米葉片長10-15釐米，寬5-10毫米，披針形，全緣或略呈波狀，基部楔形或圓楔形以狹翅下延於葉柄，先端漸尖，且延伸成鞭狀(長3-8釐米)，末端稍捲曲，能著地生根行無性繁殖。葉脈網狀，僅上面隱約可見，有網眼1-3行，靠近主脈的I行網眼狹長，與主脈平行，其外的1-2行網眼斜上，網眼外的小脈分離，不達葉邊。葉草質幹後暗綠色，無毛。孢子囊群線形或橢圓形，在主脈兩側各形成不整齊的1-3行，通常靠近主脈的I行較長，生於網眼向軸的一側，囊群蓋向主脈開口，其外的1-2行如成對地生於網眼內時則囊群蓋相對開，如單獨地生於網眼內時則囊群蓋開向主脈或葉邊；囊群蓋狹，同形，膜質，灰綠色或淺棕色。國內一般用溶劑法提取總黃酮，存在著操作溫度高，得率偏低等缺點，本發明的不同之處在於主要採用酶法提 取，後期採用高速逆流色譜法分離純化總黃酮，產品不僅得率高，而且純度高。
發明內容
本發明優點本發明主要採用生物酶解技術，採用乙醇做提取劑，後期採用高速逆流色譜法(HSCCC)分離純化總黃酮。本發明方法提取快捷、產品純度高，得率高，選用食品允許使用的乙醇為提取溶劑回流提取，無化學殘留。為實現上述目的，本發明採用的技術方案是—種採用酶法提取並與高速逆流色譜藕聯，最終得到高純度過山蕨總黃酮的方法，其步驟如下(I)酶解過山蕨乾燥全草粉碎至20-40目，酶濃度O. 2-03g/l,酶解溫度45-50°C，酶解時間 2-3h ；(2)回流提取加入60-70%乙醇，採用加熱回流提取法，料液比1: 12_15，提取溫度80-90°C，提取兩次，每次提取時間1-1. 5h ；(3)收集回收乙醇，薄層層析檢測分析，收集總黃酮部分；(4)過濾過濾，合併兩次濾液，得總黃酮粗提物；(5)分相稱取一定克數總黃酮粗提物，選擇HSCCC溶劑系統，按比例將各種溶劑加入分液漏鬥中，震蕩使溶液充分混合，放置過夜，分相平衡後分出上相和下相；(6)將總黃酮粗提物溶於一定量的下相溶液中，震蕩使完全溶解，備用；
(7)HSCCC分離以一定流速將溶劑的上相(固定相)和下相(流動相)以一定比例泵入HSCCC螺旋管，調整轉速為800r/min，以2_3ml/min的流速泵入流動相，紫外檢測器檢測流出物；(8)收集各色譜組分，將HSCCC分離的到的流分揮幹，得含量為90%以上的總黃酮。
具體實施例方式實施例1 :一種採用酶法提取並與高速逆流色譜藕聯，最終得到高純度過山蕨總黃酮的方法，其步驟如下(I)酶解將500g過山蕨乾燥全草粉碎至20目，酶濃度O. 2g/l,酶解溫度45°C,酶解時間2h ；(2)回流提取加入60%乙醇，採用加熱回流提取法，料液比1: 12，提取溫度80°C，提取兩次，每次提取時間1. 5h ;(3)收集回收乙醇，薄層層析檢測分析，收集總黃酮部分；(4)過濾過濾，合併兩次濾液，得總黃酮粗提物；(5)分相稱取Ig總黃酮粗提物，選擇HSCCC正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水溶劑系統按30 70比例加入分液漏鬥中，震蕩使溶液充分混合，放置過夜，分相平衡後分出上相和下相；
(6)取O. 5g總黃酮粗提物溶於50ml的下相溶液中，震蕩使完全溶解，備用；(7) HSCCC分離以10ml/min流速將溶劑的上相(固定相)和下相(流動相)以一定比例泵入HSCCC螺旋管，調整轉速為800r/min，以2ml/min的流速泵入流動相，紫外檢測器檢測流出物；(8)收集各色譜組分，將HSCCC分離的到的流分揮幹，HPLC分析，得含量為93. 6%的總黃酮。實施案例2 :—種採用酶法提取並與高速逆流色譜藕聯，最終得到高純度過山蕨總黃酮的方法，其步驟如下(I)酶解將500g過山蕨乾燥全草粉碎至40目，酶濃度O. 3g/l,酶解溫度50°C,酶解時間2. 5h ；(2)回流提取加入70%乙醇，採用加熱回流提取法，料液比1: 14，提取溫度90 °C，提取兩次，每次提取時間Ih ；(3)收集回收乙醇，薄層層析檢測分析,收集總黃酮部分；(4)過濾過濾，合併兩次濾液，得總黃酮粗提物；(5)分相稱取Ig總黃酮粗提物，選擇HSCCC氯仿-甲醇-水-醋酸溶劑系統按40 : 60比例加入分液漏鬥中，震蕩使溶液充分混合,放置過夜,分相平衡後分出上相和下相；(6)取O. 5克總黃酮粗提物溶於50ml的下相溶液中，震蕩使完全溶解，備用；(7) HSCCC分離以15ml/min流速將溶劑的上相(固定相)和下相(流動相)以一定比例泵入HSCCC螺旋管，調整轉速為800r/min，以3ml/min的流速泵入流動相，紫外檢測器檢測流出物；
(8)收集各色譜組分，將HSCCC分離的到的流分揮幹，HPLC分析，得含量為95.1 %的總黃酮。實施案例3 :—種採用酶法提取並與高速逆流色譜藕聯，最終得到高純度過山蕨總黃酮的方法，其步驟如下(I)酶解將500g過山蕨乾燥全草粉碎至40目，酶濃度O. 2mg/ml,酶解溫度45°C,酶解時間3h ；(2)回流提取加入70%乙醇，採用加熱回流提取法，料液比1: 15，提取溫度90°C，提取兩次，每次提取時間1. 5h ;(3)收集回收乙醇，薄層層析檢測分析,收集總黃酮部分；(4)過濾過濾，合併兩次濾液，得總黃酮粗提物；(5)分相稱取Ig總黃酮粗提物，選擇HSCCC正己烷-醋酸乙酯-正丁醇-甲醇溶劑系統按20 80比例加入分液漏鬥中，震蕩使溶液充分混合，放置過夜，分相平衡後分出上相和下相；(6)取O. 5克總黃酮粗提物溶於50ml的下相溶液中，震蕩使完全溶解，備用；(7) HSCCC分離以20ml/min流速將溶劑的上相(固定相)和下相(流動相)以一定比例泵入HSCCC螺旋管，調整轉速 為800r/min，以2ml/min的流速泵入流動相，紫外檢測器檢測流出物；(8)收集各色譜組分，將HSCCC分離的到的流分揮幹，HPLC分析，得含量為95. 3%的總黃酮。
權利要求
1.一種採用酶法提取並與高速逆流色譜藕聯，最終得到高純度過山蕨總黃酮的方法，其步驟如下 (1)酶解過山蕨乾燥全草粉碎至20-40目，酶濃度O.2-0. 3mg/ml，酶解溫度45-50°C，酶解時間2-3h ； (2)回流提取加入60-70%乙醇，採用加熱回流提取法，料液比1: 12-15，提取溫度8090°C，提取兩次，每次提取時間1-1. 5h ； (3)收集回收乙醇,薄層層析檢測分析,收集總黃酮部分； (4)過濾過濾，合併兩次濾液，得總黃酮粗提物； (5)分相稱取一定克數總黃酮粗提物，選擇HSCCC溶劑系統按其比例分別將各種溶劑加入分液漏鬥中，震蕩使溶液充分混合，放置過夜，分相平衡後分出上相和下相； (6)取適量總黃酮粗提物溶於一定量的下相溶液中，震蕩使完全溶解，備用； (7)HSCCC分離以一定流速將溶劑的上相(固定相)和下相(流動相)以一定比例泵入HSCCC螺旋管，調整轉速為800r/min，以2_3ml/min的流速泵入流動相，紫外檢測器檢測流出物； (8)收集各色譜組分，將HSCCC分離的到的流分揮幹，得含量為90%以上的總黃酮。
2.根據權利要求1所述的利用酶法提取並與高速逆流色譜藕聯，最終得到高純度過山蕨總黃酮的方法，其特徵是在所述的步驟(I)中，採用的酶為纖維素酶。
3.根據權利要求2所述的利用酶法提取並與高速逆流色譜藕聯，最終得到高純度過山蕨總黃酮的方法，其特徵是在所述的步驟(5)中，HSCCC溶劑系統為正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水或氯仿-甲醇-水-醋酸或正己烷-醋酸乙酯-正丁醇-甲醇的一種。
4.根據權利要求3所述的利用酶法提取並與高速逆流色譜藕聯，最終得到高純度過山蕨總黃酮的方法，其特徵是在所述的步驟￠)中，總黃酮粗提物與下相溶液比為1: 10。
5.根據權利要求4所述的利用酶法提取並與高速逆流色譜藕聯，最終得到高純度過山蕨總黃酮的方法，其特徵是在所述的步驟(7)中，採用10-20ml/min的流速將溶劑的上相和下相泵入HSCCC螺旋管。
全文摘要
本發明屬於天然有機化學領域，涉及一種從大興安嶺野生過山蕨裡提取總黃酮的方法，特別是涉及一種利用酶法提取，高速逆流色譜分離純化總黃酮的新方法。本發明優點本發明提取快捷、迅速，所得產品純度高，環境汙染小。1、應用生物酶解技術，使細胞內有效成分充分溶出。2、採用高速逆流色譜技術分離過程簡單、溶劑消耗量少，在短時間內實現有效成分的快速分離，且純度高。本發明利用生物酶法，促使有效成分充分溶出，乙醇回流提取，再採用高速逆流色譜分離純化，所得總黃酮純度提高到95.3％。
文檔編號C07G99/00GK103059069SQ201210595538
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月13日 優先權日2012年12月13日
發明者張亞紅, 姚德坤, 姚德利, 萬莉 申請人:大興安嶺林格貝有機食品有限責任公司