一種甲醇型畢赤酵母的高密度發酵工藝及設備的製作方法
2023-05-31 06:33:46 4
專利名稱：一種甲醇型畢赤酵母的高密度發酵工藝及設備的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物發酵技術領域，涉及一種甲醇型畢赤酵母的高密度發酵工藝及設備。
背景技術：
隨著生物學技術的發展，利用基因工程菌生產生物產品已成為現實。在微生物表達系統中，酵母作為單細胞低等真核生物，具有易培養、繁殖快、便於基因操作、能對外源蛋白進行翻譯後加工和修飾、不產生有毒物質等優點，成為分子生物學領域中被廣泛用於重組蛋白生產的系統之一。甲醇型巴斯德畢赤酵母Cidia /^1Stori1S)表達系統是目前最優秀、應用最廣泛的外源基因表達系統之一，它不但克服了大腸桿菌表達系統不能表達結構複雜的蛋白質、表達的蛋白多形成不溶性包涵體、背景蛋白多、表達產量低等缺陷，而且彌補了哺乳類細胞、昆蟲細胞表達系統操作複雜、表達水平低、產業化生產造價昂貴的不足。 巴斯德畢赤酵母另一個特點是可以在廉價的非選擇性培養基中生長，可進行細胞高密度培養，利於大規模工業化生產。目前許多產品，如植酸酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等都在巴斯德畢赤酵母中獲得高效表達。P. pastoris是一種嗜甲基酵母，可以在以甲酵為唯一碳源和能源的培養基中快速生長。甲醇畢赤酵母代謝的第一步是氧化甲醇形成甲醛，這一步是由醇氧化酶(alcohol oxidase, Aox)催化的，在畢赤酵母利用甲醇的代謝途徑中存在兩個醇氧化酶，AOXl和 A0X2。在甲醇流加培養時，AOX水平急劇上升，可達細胞可溶性蛋白的30%以上。現在採用的策略是將外源基因替換AOXl基因，這種替換所產生的轉化子是最穩定的。AOXl的合成是在轉錄水平上調控的，其基因啟動子具有明顯的調空功能，可用於調控外源基因的表達。此調控作用是由碳源抑制/解抑制及碳源特殊誘導雙重機制控制的，即外源基因在甲醇以外的碳源中處於非表達狀態，而在培養液中加入甲醇後，外源基因即可被誘導表達。在25°C和1. OX 105! 氧在水中的溶解度僅為0. 25 mmol. L-I左右。在發酵液中含有大量的有機物和無機鹽，氧的溶解度約為0. 21 mmol. L-I,比糖的溶解度小7000倍。在對數生長期即使發酵液中的溶氧能達到100%飽和度，若此時中止供氧，發酵液中溶氧可在幾分鐘之內便耗竭，使溶氧成為限制因素。溶氧(DO)是畢赤酵母生長所必需，尤其是在重組畢赤酵母高密度發酵工藝，在補料發酵階段，由於菌體的大量生長，耗氧速率增加，需氧量非常大；在接下來的甲醇誘導表達階段，甲醇通過畢赤酵母的醇氧化酶(A0X1和A0X2)進行代謝需要大量的氧參與，使溶氧成為甲醇型重組畢赤酵母高密度發酵的限制因素。目前的發酵工藝與設備無法在甲醇型重組畢赤酵母高密度發酵過程中達到供氧與耗氧的平衡。因此，針對大規模工業化的甲醇型重組畢赤酵母高密度發酵，需要從反應器結果設計、供氣質量、菌種與發酵工藝的優化等方面提高氧的供給與利用率，防止發酵過程因缺氧而導致的發酵產率的降低。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種甲醇型畢赤酵母的高密度發酵工藝及設備，以克服目前甲醇型重組畢赤酵母高密度發酵過程中，在發酵工藝與設備方面的供氧不足等問題，防止發酵過程因缺氧而導致的發酵產率的降低。本發明所採用的技術方案是一種甲醇型畢赤酵母的高密度發酵工藝，包括分批發酵階段、補料發酵階段和甲醇誘導階段，在補料發酵階段和甲醇誘導階段，由氧氣發生器製得的高濃度氧氣流入氧氣儲罐，然後與進入發酵罐的空氣混合，使之氧氣含量在40% -60%,以1. OOvvm的流量通入發酵罐，以維持發酵罐內發酵液氧的濃度高於同溫同壓下空氣中的氧氣在初始培養液中溶解度的30%。本發明進一步技術方案是提供一種應用於上述甲醇型畢赤酵母的高密度發酵工藝中的酵母高密度培養設備，該設備包括由管道依次連接的氧氣發生器、氧氣儲罐、氣水分離器、膜過濾器以及發酵罐。所述的發酵罐包括罐體、攪拌裝置和通氣裝置；所述攪拌裝置包括攪拌電機、固定在一根攪拌軸上的若干組攪拌漿，下層攪拌槳置於罐體底部且位於通氣裝置上方，中層攪拌槳置於罐體的中部，上層攪拌槳置於罐體的上部；所述通氣裝置為環形空氣分布器，環形空氣分布器上安置多個45度角的出氣小管，出氣小管上設有多個出氣孔引導氣體旋轉的方向與攪拌軸旋轉方向相反。本發明與現有技術比較具有以下有益效果1.在甲醇型重組畢赤酵母的高密度發酵工藝的補料發酵階段和甲醇誘導階段通入高濃度的氧氣，可以增大發酵液中氧的溶解度，強化氧的供給，消除發酵過程中氧的限制對畢赤酵母生長和外源基因表達的影響，防止發酵過程因缺氧而導致的發酵產率的降低。2.由於環形空氣分布器上安置了 45度角的出氣小管，出氣小管上排列有出氣孔，使通氣裝置進入的氣體能夠均勻分散上升，並增加了氣液接觸面；同時由於出氣小管上的出氣孔引導氣體旋轉的方向與攪拌軸旋轉方向相反，促進了進氣與發酵液的混合，有利於提高氧的利用率。
圖1為本發明一種實施例甲醇型畢赤酵母高密度培養設備組成示意圖。圖2為本發明發酵罐結構示意圖。圖3為通氣裝置結構示意圖。圖4為圖3的A-A視圖。
具體實施例方式如圖1所示實施例，應用於所述甲醇型畢赤酵母的高密度發酵工藝中的酵母高密度培養設備，包括由管道依次連接的氧氣發生器1、氧氣儲罐2、氣水分離器3、膜過濾器4以及發酵罐5。如圖2所示，本實施例發酵罐5包括罐體、攪拌裝置和通氣裝置；所述攪拌裝置包括攪拌電機6、固定在一根攪拌軸7上的三組攪拌漿8，下層攪拌槳8. 1置於罐體12底部且位於通氣裝置上方，為徑流型攪拌槳，中層攪拌槳8. 2置於罐體的中部，為軸流型攪拌槳， 上層攪拌槳8. 3置於罐體的上部，為軸流型攪拌槳；所述通氣裝置為環形空氣分布器9，環形空氣分布器9上安置多個45度角的出氣小管10，出氣小管10上排列有出氣孔引導氣體旋轉的方向與攪拌軸8旋轉方向相反。如圖2、3所示，所述通氣裝置為環形空氣分布器9， 環形空氣分布器9上安置多個45度角的出氣小管10，出氣小管10上設有多個出氣孔引導氣體旋轉的方向與攪拌軸8旋轉方向相反，促進進入氣體與發酵液的混合，提高氧的利用率。出氣孔最好均勻分布於出氣小管10上，使通氣裝置進入的氣體能夠均勻分散上升，並增加氣液接觸面。圖2、圖3中的標註11為進氣口。以下為15升發酵罐內甲醇型畢赤酵母pidia pas tor is高密度(好氧)發酵工藝。菌種甲醇型畢赤酵母PicAia pas tor is ATCC 76274，購於美國模式培養物集存庫(American type culture collection)。發酵培養與結果將從平板上挑取一單菌落接入YPD種子培養基(500mL三角燒瓶裝液量125mL)中(1L含酵母粉10g，蛋白腖20g，葡萄糖20g) 30°C下220 r/min培養 20h。然後按10%接種量接入裝有IOL分批發酵培養基的15L發酵罐中(IL含葡萄糖30g， 硫酸銨15g，硫酸鎂8g，硫酸鉀7. 5g，磷酸二氫鉀3. 5g，硫酸鈣1. 0g，氫氧化鉀1. 2g，PTMl 4mL)。 發酵溫度30°C，利用氨水溶液將pH控制為5. 0，補料發酵階段流加葡萄糖並使其濃度維持在10. Og/L左右，24小時後補加甲醇，甲醇加入速率為每升培養液中每小時加入1.5 3.0毫升。由氧氣發生器1 (購自市售的變壓吸附氧發生器)製得的高濃度氧氣 (氧氣濃度90%左右)流入氣體儲罐2內，然後通過氣水分離器3以及膜過濾器4與進入發酵罐5的空氣混合，使之氧氣含量在50%左右，以1. OOvvm的流量通入發酵罐5，以維持發酵罐5內發酵液氧的濃度高於同溫同壓下空氣中的氧氣在初始培養液中溶解度的30%。經過 60小時的培養，最終細胞濃度可以達到109.6g/L。與只用空氣作為氣源的通用型發酵罐發酵結果(發酵時間60小時，細胞濃度64. 2g/L)相比，利用增加通入空氣氧化含量的工藝及本發明的發酵罐進行甲醇型畢赤酵母的發酵生產，細胞濃度濃度提高了 1. 71倍。
權利要求
1.一種甲醇型畢赤酵母的高密度發酵工藝，包括分批發酵階段、補料發酵階段和甲醇誘導階段，其特徵在於在補料發酵階段和甲醇誘導階段，由氧氣發生器製得的高濃度氧氣流入氧氣儲罐，然後與進入發酵罐的空氣混合，使之氧氣含量在40% — 60%，以1. OOvvm的流量通入發酵罐，以維持發酵罐內發酵液氧的濃度高於同溫同壓下空氣中的氧氣在初始培養液中溶解度的30%。
2.根據權利要求1所述的甲醇型畢赤酵母的高密度發酵工藝，其特徵在於所述氧氣含量為50%。
3.一種應用於權利要求1所述甲醇型畢赤酵母的高密度發酵工藝中的酵母高密度培養設備，其特徵在於包括由管道依次連接的氧氣發生器(1)、氧氣儲罐(2)、氣水分離器 (3)、膜過濾器(4)以及發酵罐(5)。
4.根據權利要求3所述的酵母高密度培養設備，其特徵在於所述的發酵罐(5)包括罐體、攪拌裝置和通氣裝置；所述攪拌裝置包括攪拌電機(6)、固定在一根攪拌軸(7)上的若干組攪拌漿(8)，下層攪拌槳(8. 1)置於罐體底部且位於通氣裝置上方，中層攪拌槳(8. 2) 置於罐體的中部，上層攪拌槳(8. 3)置於罐體的上部；所述通氣裝置為環形空氣分布器 (9)，環形空氣分布器(9)上安置多個45度角的出氣小管(10)，出氣小管(10)上設有多個出氣孔引導氣體旋轉的方向與攪拌軸(8)旋轉方向相反。
5.根據權利要求4所述的酵母高密度培養設備，其特徵在於所述下層攪拌槳(8.1)為徑流型攪拌槳，中層攪拌槳(8. 2)為軸流型攪拌槳，上層攪拌槳(8. 3)為軸流型攪拌槳。
6.根據權利要求4所述的酵母高密度培養設備，其特徵在於所述出氣孔均勻分布於出氣小管(10)上。
7.根據權利要求5所述的酵母高密度培養設備，其特徵在於所述出氣孔均勻分布於出氣小管(10)上。
全文摘要
一種甲醇型畢赤酵母的高密度發酵工藝，包括分批發酵階段、補料發酵階段和甲醇誘導階段，在補料發酵階段和甲醇誘導階段，由氧氣發生器製得的高濃度氧氣流入氧氣儲罐，然後與進入發酵罐的空氣混合，使之氧氣含量在40%－60%，以1.00vvm的流量通入發酵罐，以維持發酵罐內發酵液氧的濃度高於同溫同壓下空氣中的氧氣在初始培養液中溶解度的30%。應用於上述甲醇型畢赤酵母的高密度發酵工藝中的酵母高密度培養設備，包括由管道依次連接的氧氣發生器、氧氣儲罐、氣水分離器、膜過濾器以及發酵罐。本發明可以防止發酵過程因缺氧而導致的發酵產率的降低，並可以提高氧的利用率。
文檔編號C12N1/16GK102517223SQ20111044654
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月28日 優先權日2011年12月28日
發明者楊海龍, 章方龍, 章航 申請人:溫州市龍泰輕工機械有限公司