一種提取副溶血弧菌總rna的方法

2023-05-30 18:14:21 1

專利名稱：一種提取副溶血弧菌總rna的方法
技術領域：
本發明涉及一種提取副溶血弧菌總RNA的方法。
背景技術：
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是革蘭氏陰性多形態桿菌或稍彎曲弧 菌，廣泛存在於海水中，在含食鹽濃度3% 3. 5%的培養基中生長良好，故又稱致病性嗜 鹽菌。副溶血弧菌是水產品、鹹菜、熟肉類、禽肉及禽蛋類中常見的致病菌，由於人們生活方 式的改變以及水環境的惡化，越來越多人由於進食受汙染的食物或未煮熟的食物而導致食 物中毒，因此對副溶血弧菌進行生物學研究具有重大的意義。分離提取高質量的RNA是後 續的PCR， Real-time PCR，基因克隆，cDNA文庫建立等分子生物學研究的基礎。而細菌的 RNA具有含量少，半衰期短，容易降解等特點，所以相比較植物，動物等真核生物而言，更難 提取出高質量的RNA。目前國內外也還沒有針對副溶血弧菌RNA提取的報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種提取副溶血弧菌總RNA的方法，以方便對副溶血弧菌 進行分子生物學研究。 本發明所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現
—種提取副溶血弧菌總RNA的方法，其特徵在於，包括如下步驟
①取副溶血弧菌菌液1ml於離心管中，離心； ②棄上清，菌體用液氮速凍，磨成粉末，把粉末轉到離心管中，加入Trizol，振蕩 lmin，冰上靜置3min，反覆震蕩3次；
③加入氯仿/異戊醇，離心； 將上清500ul轉入離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，放置使充分沉澱，離 心； ⑤小心移去上清，用70%的乙醇洗，離心； ⑥小心的儘可能吸走上清，超淨臺上倒置將酒精空幹，加入DEPC水溶解；-8(TC保存。所述方法中的離心是指轉速為12000rpm，離心時間為1-5min。
步驟①所述的離心是在4t:離心。 步驟②所述的加入Trizol為800ul。 步驟③所述的加入氯仿/異戊醇的量為200ul，混合比例為24 : 1。 步驟④所述的放置使充分沉澱是指在室溫放置10min，或者-20°0放置1小時或更
長時間。 步驟⑥所述的加入DEPC為40ul 。 本發明所述"Trizol"是一種總RNA抽提試劑，可以直接從細胞或組織中提取總 RNA。其含有苯酚、異硫氰酸胍等物質，能迅速破碎細胞並抑制細胞釋放出的核酸酶。所述"Trizol"可從商業途徑購買得到。 本發明所述"DEPC"即diethypyrocarbonate，中文名為焦碳酸二乙酯，是一種RNA 酶抑制劑。 對提取出的RNA在-S(TC保存，以防止RNA降解。用核酸測定儀測定RNA在A26。、
A28。、 A23。的數值和其濃度，並計算A26。/A28。、 A26。/A23。的比值，以此鑑定RNA的純度。 由於採用了上述技術方案，本發明具有的優點和有益效果是步驟④所述的放置
使充分沉澱是指在室溫放置10min即能充分沉澱，從而使得放置使充分沉澱時間大大縮
短，本發明所述的方法能在短暫的三小時內提取出濃度高，純度高，完整性好的總RNA，且所
用試劑簡單，成本低廉。
具體實施例方式
為了使本發明的技術手段、創作特徵、達成目的與功效易於明白了解，下面結合具
體實施例，進一步闡述本發明。
實施例1 按照以下步驟提取副溶血弧菌總RNA : 1.沉澱菌體取副溶血弧菌菌液1ml於1. 5ml離心管中，4 °C ， 12000rpm離心 lmin ; 2.破裂細胞，溶解出細胞裡的核酸，蛋白質，多糖等物質棄上清，菌體用液氮速 凍，磨成粉末，把粉末轉到1. 5ml離心管中(液氮上操作，保證低溫)，加入800ul Trizol， 振蕩lmin，冰上靜置3min，反覆震蕩3次； 3.去除其中的蛋白質，多糖等雜質加入200ul混合比例為24 : 1的氯仿/異戊 醇；12000rpm離心5min ;將上清500ul轉入1. 5ml離心管中，加入與上清等體積的預冷異丙 醇，室溫沉澱10min以使充分沉澱，注意不要吸取中層物質，否則會有DNA汙染；
4. RNA的洗滌和溶解12000rpm離心5min ;小心移去上清，用70%的乙醇洗2遍， 每次700ul， 12000rpm離心3min ;小心的儘可能吸走上清，超淨臺上倒置將酒精空幹，加入 40ul DEPC水溶解；-80。C保存。 5. RNA質量的鑑定用核酸測定儀測定RNA在A26。、 A28。、 A23。的數值和其濃度，並計 算A260/A280、A260/A230的比值，結果如表1所示。
實施例2 按照以下步驟提取副溶血弧菌總RNA : 1.沉澱菌體取副溶血弧菌菌液1ml於1. 5ml離心管中，4 °C ， 12000rpm離心 lmin ; 2.破裂細胞，溶解出細胞裡的核酸，蛋白質，多糖等物質棄上清，菌體用液氮速 凍，磨成粉末，把粉末轉到1. 5ml離心管中(液氮上操作，保證低溫)，加入800ul Trizol， 振蕩lmin，冰上靜置3min，反覆震蕩3次； 3.去除其中的蛋白質，多糖等雜質加入200ul混合比例為24 : 1的氯仿/異戊 醇；12000rpm離心5min ;將上清500ul轉入1. 5ml離心管中，加入與上清等體積的預冷異丙 醇，_201:放置1小時以使充分沉澱，注意不要吸取中層物質，否則會有DNA汙染；
4. RNA的洗滌和溶解12000rpm離心5min ;小心移去上清，用70%的乙醇洗2遍，每次700ul， 12000rpm離心3min ;小心的儘可能吸走上清，超淨臺上倒置將酒精空幹，加入 40ul DEPC水溶解；-80。C保存。 5. RNA質量的鑑定用核酸測定儀測定RNA在A26。、 A28。、 A23。的數值和其濃度，並計 算A260/A280、A260/A230的比值，結果如表1所示。
實施例3 按照以下步驟提取副溶血弧菌總RNA : 1.沉澱菌體取副溶血弧菌菌液1ml於1. 5ml離心管中，4 °C ， 12000rpm離心 lmin ; 2.破裂細胞，溶解出細胞裡的核酸，蛋白質，多糖等物質棄上清，菌體用液氮速 凍，磨成粉末，把粉末轉到1. 5ml離心管中(液氮上操作，保證低溫)，加入800ul Trizol， 振蕩lmin，冰上靜置3min，反覆震蕩3次； 3.去除其中的蛋白質，多糖等雜質加入200ul混合比例為24 : 1的氯仿/異戊 醇；12000rpm離心5min ;將上清500ul轉入1. 5ml離心管中，加入與上清等體積的預冷異丙 醇，_201:放置大於1小時以使充分沉澱，注意不要吸取中層物質，否則會有DNA汙染；
4. RNA的洗滌和溶解12000rpm離心5min ;小心移去上清，用70%的乙醇洗2遍， 每次700ul， 12000rpm離心3min小心的儘可能吸走上清，超淨臺上倒置將酒精空幹，加入 40ul DEPC水溶解；-80。C保存。 5. RNA質量的鑑定用核酸測定儀測定RNA在A26。、 A28。、 A23。的數值和其濃度，並計 算A260/A280、A260/A230的比值，結果如表1所示。 表1實施例1-3提取得到的RNA的A26。/A28。、 A26。/A23。的數值
樣品A260/A280A260/A230
實施例12. 01±0. 022. 27±0. 02
實施例22. 05±0. 012. 13±0. 01
實施例32. 04±0. 012. 36±0. 01 RNA純度的測定不僅要考慮A260/A280的比值，同時也要參考A260/A230，的比值。 如果A260/A230的比值過低，表明可能有多聚糖、胍鹽或者P-巰基乙醇的汙染(法雷爾， 2007)。經檢測，結果如表1所示，該方法提取出的總RNA純度較高，所有樣品的A260/A280 值均在1. 9和2. 1之間，A260/A230值基本大於2. 0且小於2. 4，表明RNA樣品含酚類、多糖 類物質和蛋白質等雜質少，該方法所提取的RNA樣品純度較好。 以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特徵和本發明的優點。本行業的技術 人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變 化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其 等同物界定。
權利要求
一種提取副溶血弧菌總RNA的方法，其特徵在於，包括如下步驟①取副溶血弧菌菌液1ml於離心管中，離心；②棄上清，菌體用液氮速凍，磨成粉末，把粉末轉到離心管中，加入Trizol，振蕩1min，冰上靜置3min，反覆震蕩3次；③加入氯仿/異戊醇，離心；④將上清500ul轉入離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，放置使充分沉澱，離心；⑤小心移去上清，用乙醇洗，離心；⑥小心的儘可能吸走上清，超淨臺上倒置將酒精空幹，加入DEPC水溶解；-80℃保存。
2. 根據權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述的離心是指轉速為12000rpm，離心時 間為l-5min。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟①所述的離心是在4t:離心。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟④所述的放置使充分沉澱是指在室 溫放置10min，或者_201:放置1小時或更長時間。
全文摘要
本發明提供一種提取副溶血弧菌總RNA的方法，其特徵在於，包括如下步驟①取副溶血弧菌菌液1ml於離心管中，離心；②棄上清，菌體用液氮速凍，磨成粉末，把粉末轉到離心管中，加入Trizol，振蕩1min，冰上靜置3min，反覆震蕩3次；③加入氯仿/異戊醇，離心；④將上清500ul轉入離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，放置使充分沉澱，離心；⑤小心移去上清，用70％的乙醇洗，離心；⑥小心的儘可能吸走上清，超淨臺上倒置將酒精空幹，加入DEPC水溶解；-80℃保存。由於採用了上述技術方案，本發明具有的優點和有益效果是本發明所述的方法能在短暫的三小時內提取出濃度高，純度高，完整性好的總RNA，且所用試劑簡單，成本低廉。
文檔編號C12N15/10GK101775389SQ20101011544
公開日2010年7月14日 申請日期2010年3月1日 優先權日2010年3月1日
發明者孫曉紅, 潘迎捷, 趙勇, 陳星 申請人:上海海洋大學