利用合成的、確定的膠原模擬表面進行細胞培養的方法
2023-05-31 02:32:46 4
專利名稱：利用合成的、確定的膠原模擬表面進行細胞培養的方法
技術領域：
本發明涉及利用模擬膠原包被的表面的表面來增強細胞粘附、增殖和功能的方法。更特別地，本發明涉及利用無異種的、合成的表面的方法。
背景技術：
細胞培養模型依賴於細胞在體外以與體內相當的方式粘附、增殖和功能的能力。 具體而言，在體內應用前，多種培養模型在體外利用角質形成細胞或肝細胞來檢驗化合物。 例如，角質形成細胞培養物用來預測皮膚刺激而肝細胞培養物用來預測肝毒性。利用膠原包被的細胞培養表面支持細胞粘附和細胞功能存在一定的問題，因為用來包被的膠原一般來自於人或其他動物來源，因此通常具有差的確定性。此外，利用衍生自人或其他動物的此類膠原在人類治療應用中可能存在極大的問題其中可能產生免疫原性反應，其導致移植細胞的排斥。儘管分離的人膠原能夠用來包被此類表面，但是相關費用很高並且仍可能導致免疫原性應答。另外，與重組膠原一樣，由於其中存在的汙染物的差異性，不同批次的分離的膠原可能導致細胞培養的差異性。另外，細胞培養的差異性也可能是由分離的和重組的膠原一般均採用的自我包被過程本身導致的。因此，需要利用無異種的、合成的、化學確定的模擬膠原的表面來增強細胞粘附、增殖和功能的方法。
發明內容
本發明提供了利用無異種的、合成的、化學確定的表面用於細胞培養的方法，這種表面能夠提供與膠原包被的表面相當的細胞粘附和功能性。特別是，角質形成細胞、胰腺癌細胞和肝細胞的細胞粘附性與膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的表面上的細胞粘附性是相當的。此外，角質形成細胞的增殖與膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的表面上的增殖是相當的。而且，肝細胞中的CYP450的基礎活性和誘導與膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的表面上的是相當的。這種方法是特別理想的，因為其中使用的表面避免了與人或其他動物來源的膠原相關的問題人或其他動物來源的膠原具有差的確定性並且還可能在治療應用中引發免疫應答。同樣，這種方法在細胞培養檢驗中是尤其優選的，因為培養條件在化學上更加明確。一方面，本發明提供了細胞培養的方法，所述方法包括將細胞懸液與表面接觸，並且在適合細胞培養的條件下孵育細胞，其中所述表面的至少一部分之上含有化合物包被， 所述化合物包含胺基酸序列 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SEQ ID NO 1)，其中表示羥脯氨酸；其中細胞與該表面的粘附與懸浮細胞與膠原包被的表面的細胞粘附相當。在一個實施方案中，該細胞是角質形成細胞。在另一個實施方案中，該細胞是胰腺癌細胞。在另一個實施方案中，該細胞是肝細胞。在一個實施方案中，粘附至表面的細胞數量是其上沒有任何細胞外基質蛋白質包被的對照表面的至少2倍。在一個實施方案中，其中細胞是角質形成細胞，粘附至表面的細胞數量是其上沒有任何細胞外基質蛋白質包被的對照表面的至少3倍。在另一個實施方案中，其中細胞是胰腺癌細胞，粘附至表面的細胞數量是沒有任何細胞外基質蛋白質包被的對照表面的至少10倍。在另一個實施方案中，粘附至表面的肝細胞中細胞色素P45(13A4的基礎活性水平與粘附至膠原包被的表面上的肝細胞中的細胞色素P45(I3A4的基礎活性水平相當。在另一個實施方案中，細胞色素Ρ45(Ι3Α4的誘導與粘附至膠原包被的表面上的肝細胞的細胞色素P45tl 的誘導水平相當。在一個實施方案中，所述表面是細胞培養容器。在另一個實施方案中，所述表面是微載體。在一個實施方案中，細胞在5% CO2的恆溼培養箱中於37°C孵育。在一個實施方案中，孵育細胞至少M小時。另一方面，本發明提供了利用本發明的方法培養的細胞。通過下面詳細描述的研究將更好地理解本發明的這些和其他特徵。
圖IA顯示粘附至其上具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的組織培養表面的人肝細胞(擬次170)的圖像。圖 IB 顯示粘附至其上具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SE Q ID NO 1)包被的組織培養表面的人肝細胞(批次170)的圖像，其中&表示羥脯氨酸。圖IC顯示粘附至具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的組織培養表面的人肝細胞(批次94)的圖像。圖 ID 顯示粘附至其上具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SE Q ID NO 1)包被的組織培養表面的人肝細胞(批次94)的圖像，其中&表示羥脯氨酸。圖IE顯示粘附至其上具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的組織培養表面的人肝細胞(197批次)的圖像。圖 IF 顯示粘附至其上具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SE Q ID NO 1)包被的組織培養表面的人肝細胞(批次197)的圖像，其中&表示羥脯氨酸。圖IG顯示其上沒有任何細胞外基質蛋白質包被的組織培養表面上存在的人肝細胞的圖像。圖2顯示來源於三個不同供體的粘附至其上具有GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFXAERGP PGPPGPPGPPGPPGPC(SEQ ID NO :1)(其中X1表示羥脯氨酸)包被的表面(用「M」表示)，或具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的表面(用「C」表示)的人肝細胞中的細胞色素 P4503A4(CYP3A4)誘導的基礎水平和酶活性水平(以pmol/分鐘/毫克蛋白質表示)以及倍數誘導。圖3A顯示在確定的、無動物成分的培養基中粘附至具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的組織培養表面的人角質形成細胞的圖像。
圖;3B顯示在確定的、無動物成分的培養基中粘附至具有GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFX !GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC(SEQ ID NO :1)包被的表面的人角質形成細胞的圖像，其中&表
示羥脯氨酸。圖3C顯示在確定的、無動物成分的培養基中存在於沒有任何細胞外基質蛋白質包被的組織培養表面的人角質形成細胞的圖像。圖 4 的圖顯示了存在於具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFXiGERGPPGPPGPPGPPGPPGPC^S EQ ID NO :1)(其中&表示羥脯氨酸)包被的表面(用「Mimetic」表示)，或具有膠原(即 BD BioCoat膠原1)包被的表面(用「BD BioCoat Coll」表示)上的人角質形成細胞的MTS 定量檢驗後490nm處的吸光度水平。圖5A顯示在確定的培養基中粘附至具有GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPP GPPGPPGPC(SEQ ID NO 1)包被的表面的人角質形成細包的圖像，其中&表示羥脯氨酸。圖5B顯示在確定的培養基中粘附到具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的組織培養表面的人角質形成細胞的圖像。圖5C顯示在確定的培養基中存在於沒有任何細胞外基質蛋白質包被的組織培養表面的人角質形成細胞的圖像。圖 6 的圖顯示了存在於具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC( SEQ ID NO :1)(其中&表示羥脯氨酸)包被的表面(用「A」表示)，或具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的表面(用「B」表示)，或沒有任何細胞外基質蛋白質包被的組織培養表面(用「C」表示)上的人角質形成細胞的MTS定量檢驗後490nm處的吸光度水平。圖 7A 顯示其上具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC(SEQ ID NO 1)包被的表面上存在的人胰腺癌細胞的圖像，其中表示羥脯氨酸。圖7Β顯示其上具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的組織培養表面上存在的人胰腺癌細胞的圖像。圖7C顯示其上沒有任何細胞外基質蛋白質包被的組織培養表面上存在的人胰腺癌細胞的圖像。圖 8 的圖顯示了存在於其上具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPG PC (SEQ ID NO :1)(其中&表示羥脯氨酸)包被的表面(用「Mimetic」表示)，或其上具有膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的表面(用「Coll」表示)，或沒有任何細胞外基質蛋白質包被的組織培養表面(用「TC」表示)上的人胰腺癌細胞的MTS定量檢驗後490nm處的吸光度水平。
具體實施例方式本文使用的下列術語應具有如下記載的定義。就比較本發明的化合物包被的細胞培養表面與膠原包被的細胞培養表面而言，本文使用的術語「模擬」和「模擬物」指被評估的一個或多個功能特徵的相對相似性。理想地， 定量分析將顯示出在至少一種功能特徵方面至少90%的相似性。可以利用常規的重組技術或合成技術(例如固相合成)生產用於包被表面的本發明中所使用的化合物。類似地，可以利用常規技術將此類化合物純化到適合於給定應用的程度。在一個實施方案中，化合物的純度水平為至少90%。有利地，合成此類化合物可以提供至少95%或更高的純度水平。理想地，此類化合物的純度水平為97%或更高。在某些應用中，例如治療，尤其優選的是，此類化合物是合成的。本領域技術人員可以置換本文描述的用於包被表面的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸，而不損害由此產生的化合物在包被細胞培養的表面以模擬膠原包被的表面的一種或多種功能特性時的能力。例如，可以保守置換本發明公開的用於包被表面的化合物的一個或多個胺基酸。 保守置換定義為胺基酸的側鏈被具有相似的化學結構和極性的側鏈代替，所述側鏈來源於遺傳編碼的胺基酸或非遺傳編碼的胺基酸。具有相似側鏈的此類胺基酸家族在本領域是公知的。這些胺基酸包括例如具有鹼性側鏈的胺基酸(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側鏈的胺基酸(天冬氨酸、穀氨酸)，具有非帶電極性側鏈的胺基酸(甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非極性側鏈的胺基酸(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β-分支側鏈的胺基酸(蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側鏈的胺基酸(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。對於需要膠原的一種或多種功能特性的細胞培養，本發明的利用包含胺基酸序列 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFX1GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC(SEQ ID NO 1)的化合物進行修飾的表面(其中&表示羥脯氨酸)是有用的。利用本文描述的化合物修飾的表面可以採用被動(即非共價的)包被、化合物的共價固定或化合物的任何其他沉積方式。用於細胞培養的利用本文描述的化合物修飾的表面包括細胞培養容器和微載體。 本發明使用的合適的細胞培養容器對本領域技術人員來說是眾所周知的。合適的容器的例子包括但不限於，平皿、燒瓶、多孔板和顯微鏡載玻片。適用於細胞培養的微載體對本領域技術人員來說也是眾所周知的。例如見Nie，Biotechnol. Prog.，25(1) :20-31 (2009) 有利地，利用本發明的表面進行培養的細胞適用於治療應用(例如傷口癒合)，並且避免了利用來自不同來源的分離的膠原時固有的問題，否則，來自不同來源的分離的膠原可能引發免疫原性應答，甚至導致移植細胞的排斥。實施例利用商業上可獲得的訂製肽合成服務合成具有胺基酸序列gpcgppgppgppgppgppg Fx1Gergppgppgppgppgppgpc(seq id no a)的化合物，其中&表示羥脯氨酸。然後將該化合物添加到適合細胞培養的表面上。為了研究該化合物修飾的表面的增強細胞粘附、增殖和功能達到與膠原包被的表面相當的水平的能力，在相同的培養條件下將細胞接種到上述兩種表面並對其進行監測。 簡言之，按照供應商的指導培養人肝細胞、人角質形成細胞或人胰腺癌細胞。按照使用供應商的指導，用肝細胞純化試劑盒(BD Biosciences Cat No. 454500) 純化從BD Biosciences (BD Biosciences Cat No. 454550)獲得的凍存的可誘導的人肝細胞。簡單的說，按照供應商的指導將細胞以3xl05個細胞/孔的密度接種到M孔板上的 BD BioCoat 膠原 1 上，或以具有胺基酸序列 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFXAERGPPGPPGPPGPPGPP GPC(SEQ ID NO 1)的化合物包被的表面上，其中&表示羥脯氨酸。細胞在5% CO2濃度的恆溼細胞培養箱中37°C培養。2-4小時後，除去培養基，按照供應商的指導每孔加400 μ 1 H印atostim完全培養基(BD Biosciences Cat No. 355056)對細胞進行重新培養。
人(新生兒的)表皮角質形成細胞購於hvi trogen公司(Cat#C-001-5C)，並根據生產商的說明書，在添加了 EDGS(含動物成分)或者S7(無動物成分)補充物的Epilife 培養基中，在以動物來源的膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的表面或以具有胺基酸序列 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFX1GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC(SEQ ID NO 1)的化合物(其中 ^C1 表示羥脯氨酸)包被的表面上進行培養。簡單的說，將細胞以25，000/cm2的密度接種後在5% CO2的恆溼細胞培養箱中37°C培養。用顯微鏡觀察細胞並捕捉圖像。鋪板後的第四至第五天用MTS檢驗定量分析細胞粘附到表面的情況。簡言之，吸去培養基後在M孔板的每個孔中加入300 μ 1含有MTS (ftOmega目錄序號G3582)的完全培養基。將細胞在37°C，5% CO2 的恆溼細胞培養箱中孵育1小時。孵育後，將0. Iml培養基轉入BD Falco 96孔板中並測量490nm處的吸光值。從ATCC獲得的PANC-1 (人胰腺癌細胞系)細胞用添加了 10 %胎牛血清的 DMEM(Invitrogen Cat No. 11885-084)培養基在37°C,5% CO2的恆溼細胞培養箱中培養。為了進行接種，除去培養基，用PBS清洗細胞，然後向裝有細胞的T-75燒瓶中加入 3ml 0. 25%的胰蛋白酶-EDTA。顯微鏡下檢查燒瓶，一旦細胞從表面脫離，加入IOml培養基以中和胰蛋白酶。將細胞特移到15ml BD i^ilcon管中然後以200x g離心10分鐘。除去上清後用含有200μ g/ml BSA的DMEM(Invitrogen目錄序號#11885-084)洗滌細胞沉澱一次。然後將細胞重懸於含有200 μ g/ml BSA的DMEM中，以50，000個細胞/cm2的密度接種到每孔有0. 5ml培養基的對孔板中。培養表面為作為陽性對照的BD BioCoat膠原1，或通過具有胺基酸序列 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SEQ ID NO 1)的肽進行修飾的表面，其中&表示羥脯氨酸。此外，BD組織培養處理表面作為陰性對照。細胞在5% CO2的恆溼細胞培養箱中37°C培養。接種後孵育M-48小時之後，使用顯微鏡觀察細胞並捕捉圖像。值得注意的是，在具有胺基酸序列 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SEQ ID NO 1)的化合物(其中&表示羥脯氨酸)進行包被的表面和用膠原(即BD BioCoat膠原1)進行包被的表面上培養時，二者的細胞粘附、擴散和增殖是相當的；而在沒有包被的組織培養處理表面培養的細胞的粘附、擴散和增殖顯著降低。這種模式在人肝細胞(見圖1A-G)、人角質形成細胞(見圖3和5)和人胰腺癌細胞(見圖7)中是明顯的。除了上述提到的視覺分析，還在鋪板後第4天至第5天利用MTS分析法對細胞數量進行量化分析。簡單的說，吸去培養基後在M孔板的每個孔中加入300μ 1含有 MTS(Promega目錄序號G3582)的完全培養基。在37°C，5% CO2的恆溼培養箱中孵育細胞1 小時。孵育後，將0. Iml培養基轉入BD Falco 96孔板中並測量490nm處的吸光值。
與上述視覺觀察相符的是，用 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC ( SEQ ID NO 1)(其中\表示羥脯氨酸)包被的表面或用膠原(即BD BioCoat膠原1)包被的表面上的細胞數量是相當的，而使用沒有任何包被的組織培養表面上的細胞數量顯著減少。這種模式在人角質形成細胞(見圖4和6)和人胰腺癌細胞(見圖8)中是明顯的。
按照供應商(BD Biosciences)的流程說明、包括推薦的誘導濃度，使用利福平作為誘導劑，在人肝細胞在鋪板後18到M小時進行CYP3A4誘導。陰性對照中僅使用DMS0。 誘導期間將細胞在37°C，5% CO2的恆溼細胞培養箱中孵育M小時士6小時。該誘導步驟在隨後的兩天進行重複，一共3天時間。
新鮮鋪板的肝細胞誘導 72小時士8小時後，吸去培養基並用預溫的 H印ato-STIM培養基洗細胞，然後用睪酮作為底物進行CYP3A4酶檢驗。按照供應商(BD Biosciences)的說明配製睪酮反應混合物。吸去培養基後，往M孔板的每個孔中加入 400μ1睪酮反應混合物。將細胞在37°C，5% CO2的恆溼細胞培養箱中孵育30分鐘。孵育結束後，從每個孔中取出300 μ 1轉入印pendorf管中在冰上儲存。往每個管中加入150 μ 1 乙腈以終止反應。樣品在室溫下14，OOOrpm離心5分鐘，然後將上清轉入另一個管中。然後對上清進行HPLC分析。用6-β -睪酮繪製標準曲線，然後從中量化細胞產生的6-β -睪酮的量。將剩下的反應混合物從平板中移出後，用PBS+1 % SDS裂解細胞，用BCA試劑盒 (Pierce)確定細胞裂解液中的總蛋白的量。酶活性用pmol產物/分鐘/毫克蛋白表示。如圖2 所示，在具有膠原(即 BD BioCoat 膠原 1)或 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFXpER GPPGPPGPPGPPGPPGPC (SEQ ID NO 1)(其中&表示羥脯氨酸)包被的表面上，CYP3A4的基礎活性水平以及倍數誘導是相當的。在不偏離本廣泛發明思想基礎上對上述實施方案進行的改變是本領域技術人員可以想到的。因此，本發明不限於公開的特定實施方案，而應該覆蓋如所附權利要求所限定的本發明精神和範圍內的所有改變。
權利要求
1.一種細胞培養的方法，所述方法包括將細胞懸液與表面接觸並在適合細胞培養的條件下孵育細胞，所述表面的至少一部分之上包括化合物包被，該化合物包含胺基酸序列GPC GPPGPPGPPGPPGPPGFX1GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC(SEQ ID NO :1)，其中 \ 表示羥脯氨酸；其中細胞對該表面的粘附與細胞懸液對膠原包被的表面的細胞粘附相當。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述細胞是角質形成細胞。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述細胞是胰腺癌細胞。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述細胞是肝細胞。
5.如權利要求1所述的方法，其中粘附至所述表面的細胞數量是其上沒有任何細胞外基質蛋白質包被的對照表面的至少2倍。
6.如權利要求2所述的方法，其中粘附至所述表面的細胞數量是其上沒有任何細胞外基質蛋白質包被的對照表面的至少3倍。
7.如權利要求3所述的方法，其中粘附至所述表面的細胞數量是其上沒有任何細胞外基質蛋白質包被的對照表面的至少10倍。
8.如權利要求4所述的方法，其中粘附至所述表面的肝細胞的細胞色素P45(i3A4的基礎活性水平與粘附至膠原包被的表面的肝細胞的細胞色素Ρ45(Ι3Α4的基礎活性水平相當。
9.如權利要求4所述的方法，其中細胞色素Ρ45(Ι3Α4的誘導與粘附至膠原包被的表面的肝細胞的細胞色素P45tl的誘導水平相當。
10.如權利要求1所述的方法，其中所述表面是細胞培養容器。
11.如權利要求1所述的方法，其中所述表面是微載體。
12.如權利要求1所述的方法，其中所述細胞在37°C，5%CO2的恆溼培養箱中孵育。
13.如權利要求1所述的方法，其中所述細胞至少孵育24小時。
14.利用權利要求1的方法培養的細胞。
全文摘要
本發明公開了利用模擬膠原包被的表面的表面增強細胞粘附、細胞增殖和細胞功能的方法。有利地，該方法採用了無異種的、合成的、化學確定的表面。
文檔編號C12N5/071GK102586172SQ201110462549
公開日2012年7月18日 申請日期2011年12月8日 優先權日2010年12月8日
發明者D·薩克斯納, E·J·亞伯拉罕, X·K·陳 申請人:貝克頓·迪金森公司