通過沉默ARPC4基因來抑制人結直腸癌細胞遷移的siRNA及其應用的製作方法
2023-05-30 12:45:26
本發明屬於基因工程技術領域，具體涉及一種通過沉默arpc4基因來抑制人結直腸癌細胞遷移的sirna及其應用。
背景技術：
結腸直腸癌(carcinomaofcolonandrectum)胃腸道中常見的惡性腫瘤，早期症狀不明顯，隨著癌腫的增大而表現排便習慣改變、便血、腹瀉、腹瀉與便秘交替、局部腹痛等症狀，晚期則表現貧血、體重減輕等全身症狀。其發病率和病死率在消化系統惡性腫瘤中僅次於胃癌、食管癌和原發性肝癌，嚴重危脅人類的身心健康，在癌症中的發病率約為9.7％。
腫瘤細胞的侵潤性受腫瘤—基質相互作用的調控，在結直腸癌中，arp2/3複合體在基質細胞附近表達，它的形成提高了基質細胞與成瘤細胞之間的運動性，進而為這兩種細胞的侵潤性提供更適合的環境。
肌動蛋白相關蛋白2/3複合體是細胞骨架的重要組成部分，能夠促進新微絲核化，廣泛參與細胞形狀的維持、細胞運動、胞質分裂和細胞移動等功能，arpc4與arpc2構成該複合體的中心，在該複合體的生物學功能上扮演重要角色。在胰腺癌，結直腸癌等多種癌細胞中異常高表達。arpc4是arp2/3複合體的組成亞基之一，它具有控制肌動蛋白(actin)在細胞內的成核過程，與下遊基因產生融合蛋白以及影響胰腺癌細胞的遷移等作用。但目前未見採用sirna沉默sw620細胞系中的arpc4基因來抑制其遷移的相關報導。
技術實現要素：
針對現有技術中的上述不足，本發明提供一種通過沉默arpc4基因來抑制人結直腸癌細胞遷移的sirna及其應用，通過sirna沉默arpc4基因的表達，可有效抑制人結直腸癌細胞的侵襲力。
為實現上述目的，本發明解決其技術問題所採用的技術方案是：
一種通過沉默arpc4基因來抑制人結直腸癌細胞遷移的sirna，該sirna為sirna496或sirna538或sirna679；
sirna496sense：5＇-gagcagagaacuucuuuautt-3＇(seqidno:1)；
sirna496antisense：3＇-auaaagaaguucucugcuctt-5＇(seqidno:2)；
sirna538sense：5＇-gguaugauaucagcuuucutt-3＇(seqidno:3)；
sirna538antisense：3＇-agaaagcugauaucauacctt-5＇(seqidno:4)；
sirna679sense：5＇-gcugaagaguuccuuaagatt-3＇(seqidno:5)；
sirna679antisense：3＇-ucuuaaggaacucuucagctt-5＇(seqidno:6)。
進一步地，sirna所作用的結直腸癌細胞係為ht-29、hct-116、sw620或sw-1116。
進一步地，結直腸癌細胞係為sw620。
上述sirna在製備抑制人結直腸癌細胞遷移藥物中的應用。
本發明的有益效果為：
本發明方法利用sirna沉默arpc4基因，再採用westernblotting方法、cck-8法、流式細胞術和transwell檢測arpc4基因對結直腸癌細胞遷移能力的變化，sirna能夠有效下調人結直腸癌sw620細胞中arpc4基因的表達，減弱細胞的遷移侵襲，通過sirna特異性幹預arpc4基因的表達，使得arpc4基因成為基因治療結直腸癌的一個新靶點。
說明書附圖
圖1為不同結直腸癌細胞系中arpc4基因的表達量圖譜；
圖2為不同sirna轉染效果對比圖；
圖3為轉染後的細胞光吸收值圖譜；
圖4為轉染後細胞的生長曲線圖；
圖5a～d為arpc4-sirna538對sw620細胞周期的影響圖譜；
圖6為實驗組、對照組、空白組的穿膜細胞數量圖譜；
圖7a為e-cadherin基因表達量圖譜；
圖7b為vimetin基因表達量圖譜；
圖7c為pcna基因表達量圖譜。
具體實施方式
下面對本發明的具體實施方式進行描述，以便於本技術領域的技術人員理解本發明，但應該清楚，本發明不限於具體實施方式的範圍，對本技術領域的普通技術人員來講，只要各種變化在所附的權利要求限定和確定的本發明的精神和範圍內，這些變化是顯而易見的，一切利用本發明構思的發明創造均在保護之列。
實施例
1、由上海吉瑪製藥有限公司設計合成3個sirna序列，根據靶序列對應的cdna起始位點命名為sirna496、sirna538和sirna679，另外還設計有一條陰性對照(negativecontrol,nc)序列；
sirna496sense：5＇-gagcagagaacuucuuuautt-3＇(seqidno:1)；
sirna496antisense：3＇-auaaagaaguucucugcuctt-5＇(seqidno:2)；
sirna538sense：5＇-gguaugauaucagcuuucutt-3＇(seqidno:3)；
sirna538antisense：3＇-agaaagcugauaucauacctt-5＇(seqidno:4)；
sirna679sense：5＇-gcugaagaguuccuuaagatt-3＇(seqidno:5)；
sirna679antisense：3＇-ucuuaaggaacucuucagctt-5＇(seqidno:6)；
ncsense：5＇-uucuccgaacgugucacgutt-3＇(seqidno:7)；
ncantisense：3＇-acgugacacguucggagaatt-5＇(seqidno:8)。
2、採用westernblotting實驗確定arpc4基因異常高表達細胞系，其具體過程為：
將人結直腸癌細胞系ht-29、hct-116、sw620、sw480、sw-1116以及兩類病人腫瘤組織在處於對數生長期時收集提取細胞中總蛋白，採用bca法對總蛋白進行定量，然後通過sds-page電泳分離蛋白，再應用bio-rad公司的quantityone軟體對westernblot結果進行圖像分析，比較相應蛋白條帶的光密度值，結果顯示arpc4基因在幾種結直腸癌細胞系中均有較高表達，但sw620細胞中相對表達水平最高(p＜0.05，p<0.05時認為差異具有統計學意義)(見圖1)，因此選用人結直腸癌細胞系sw620進行後續操作。
3、將培養的sw620細胞分為陰性對照組(nc)、實驗組(arpc4-sirna)和control組(sw620)三組，在轉染前一天，分別取處於對數生長期細胞消化計數後鋪入6孔板內，次日，待細胞匯合度達到80％時，採用只含dmem的培養基培養4h，然後按照lipofetamintm2000說明書，分別轉染48h，其結果見圖2；其具體過程為：
(1)轉染前一天，將細胞接種於500μl不含抗生素的培養基中培養，使其在轉染時可生長至30～50％融合；
(2)製備轉染液；
a、用50μlopti-mei低血清培養基或無血清培養基稀釋步驟(1)中所述sirna，輕輕混勻，使其濃度為66nm；
b、取1μllipofetamintm2000加入50μlopti-mei培養基中，室溫孵育5min；
c、將步驟a和步驟b所得產物混合，輕輕混勻，室溫放置20min，得轉染液；
(3)向每孔細胞中分別加入製備得到的轉染液，輕輕搖勻，37℃培養48h。
如圖2所示，sirna496、sirna538和sirna679在轉染48h後，均對arpc4具有抑制作用，其中，以sirna538對其抑制效果最為明顯，抑制率達到了87％(p＜0.05)。
檢測項
1、cck-8實驗檢測轉染後的細胞增殖活性
分別取實驗組(arpc4-sirna)和control(sw620)組轉染後生長狀態良好的對數生長期細胞，胰酶消化後調整細胞密度至(1～3)×104個/ml，100ul/孔接種於96孔板中，每組設置3個復孔，37℃、5％co2條件下培養過夜後，按照lipofetamintm2000說明書步驟轉染，分別在轉染0d，1d、2d、3d和4d時，每孔加入10ulcck-8溶液，孵育4h後利用酶標儀在450nm波長處測定每孔的光密度(od值)(見圖3)，並繪製生長曲線(見圖4)。
由cck-8檢測結果繪製細胞生長曲線(圖4)可見，轉染arpc4-sirna組的細胞增殖能力與空白對照組cck-8法結果顯示實驗組和control組的細胞增殖差異不具統計學意義[(0.469±0.011vs0.507±0.007)，p＞0.05]，表明，通過sirna抑制arpc4基因並不能抑制結腸癌細胞的增殖。
2、流式細胞術檢測細胞周期分布
分別收集實驗組和對照組的sw620細胞1x106個，分別用4℃預冷的pbs洗滌3次，然後70％冰乙醇固定後，置於4℃冰箱內過夜，次日再分別用pbs重懸洗滌2次，然後加入20μg/ml碘化丙啶(pi)和5ug/mlrnasea的混合液，室溫避光染色1h，採用流式細胞儀檢測所處的細胞周期，並分別計算g0/g1期、s期細胞所佔的百分比，結果見圖5a～d。
流式細胞儀分析結果顯示(圖5a～d)，實驗組與control組相比，g0/g1期細胞所佔比例(66.92％vs66.80％)，s期細胞所佔比例(20.71％vs22.18％)，在g0/g1期及s期差異不具統計學意義(p＞0.05)，表明通過sirna抑制arpc4基因並不會影響結腸癌細胞的分裂。
3、transwell實驗檢測細胞遷移能力
分別調整實驗組、空白組和對照組的細胞密度至5×105個/ml，每孔上室加200ul無血清該細胞懸液，下室加30％胎牛血清培養基450ul，常規培養48h後取出小室，pbs洗滌3次，用棉籤擦去濾膜上層細胞，甲醇固定30min，2g/l結晶紫染色3min，10×40倍鏡下觀察濾膜下細胞並計數，每個樣本隨機計數3個視野，取平均數，其結果見圖6。
由圖6可知，在transwell實驗中，實驗組的穿膜細胞數顯著少於空白組和對照組。空白組和對照組穿膜細胞數分別為(60.6±2.07)和(50.0±1.58)，與實驗組(20.4±1.14)相比較，差異具有統計學意義(p＜0.05)，可以由此推論，sirna538將arpc4沉默後，增加了sw620細胞的粘附性從而降低了它的侵襲與轉移能力。
4、westernblot檢測遷移和增殖相關基因的表達
提取實驗組和對照組蛋白，以β-actin為內參，westernblot檢測e-cadherin，vimetin和pcna的表達水平，應用bio-rad公司的quantityone軟體對westernblot結果進行圖像分析，比較相應蛋白條帶的光密度值，其結果見圖7a、圖7b和圖7c。
由圖7a、b、c可知，遷移相關基因e-cadherin和viemetin的westernblot結果顯示：實驗組與對照組相比差異具有統計學意義[(51.9)vs(41.1)(25.04)vs(42.31)](p＜0.05]，而增殖抗原pcna的westernblot結果顯示實驗組和對照組相比差異無統計學意義[(47.5)vs(45.3)，p＞0.05]。
綜上所述，arpc4-sirna538轉染sw620細胞後細胞的增殖能力變化不明顯而侵襲能力明顯減弱，實驗組和對照組e-cadherin的表達相比明顯升高，而vimetin的表達則相反，可以預測arpc4基因可能通過增強vimetin的表達而抑制了e-cadherin表達，降低細胞之間的黏附性進而促進腫瘤細胞遷移侵潤，參與腫瘤發生發展過程，表明，利用rnai技術能夠有效下調人結直腸癌sw620細胞中arpc4的表達，減弱細胞的遷移侵襲，因次，特異性幹預arpc4基因的表達有可能成為基因治療結直腸癌的一個新靶點。
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四川大學
通過沉默arpc4基因來抑制人結直腸癌細胞增殖和遷移的sirna及其應用
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