具有促進幹細胞分化的支架材料及其製備方法和用途與流程
2023-06-26 03:36:16
本發明涉及一種支架材料，尤其涉及一種由若干種材料交聯而成的支架材料，具有促進幹細胞分化的作用，以及製取的方法和用途。
背景技術：
外傷骨折、炎症、腫瘤和先天異常等均會造成骨缺損，將人工支架材料植入骨缺損處是國際公認的骨缺損修複方法。目前在研的生物支架普遍存在生物惰性問題，主要表現為缺乏骨誘導活性，不能有效誘導自體骨再生，尤其對於眼眶骨這類骨壁菲薄，骨髓腔少，局部血供差，骨再生能力弱的骨組織，缺損骨的自我修復更加困難。為了提高支架材料的骨誘導活性，有大量研究利用幹細胞基因調控(Int.J.Mol.Med.，2010，26，517～525)和生長因子誘導等方法(PNAS，2014，111，12847～12852；Biomacromolecules，2014，15，1019～1030)提高支架材料修復骨缺損的能力，但是卻面臨生物安全性、生長因子活性和經濟成本等新的問題。因此，從根本上提高支架材料的生物活性是發展組織工程支架材料的關鍵。
技術實現要素：
本發明的一個目的在於提供一種支架材料，具有良好生物活性，不僅可以通過納米材料的化學活性誘導幹細胞的分化，而且能夠通過支架材料表面微納結構調控幹細胞的分化。
本發明的另一個目的在於提供一種支架材料，不僅可以通過納米材料的化學活性誘導幹細胞的骨向分化，而且能夠通過支架材料表面微納結構調控幹細胞骨向分化。
本發明的再一個目的在於提供一種製取支架材料的方法，通過化學交聯反應製備具有良好促進組織再生功能的納米複合生物活性支架。
本發明的又一個目的在於提供一種製取支架材料的方法，通過化學交聯反應製備具有良好促進骨再生功能的納米複合生物活性支架。
本發明的又一個目的在於提供一種支架材料在組織修復中的應用。
本發明的又一個目的在於提供一種支架材料，在骨缺損修復中的應用。
一種支架材料，其內部為多孔結構，孔隙率為90％以上，空隙外徑為200±10μm。
另一種支架材料，其表面的羥基含量為40mol％～50mol％。使用boehm滴定法可對支架材料表面的官能團進行定量分析
另一種支架材料，其表面的羧基含量為40mol％～50mol％。使用boehm滴定法可對支架材料表面的官能團進行定量分析。
另一種支架材料，其表面具有羧基和羥基等基團，還具有納米級的凸起結構，凸起高度為1nm～100nm。
另一種支架材料，包括碳基納米材料，天然高分子和一維無機納米材料，碳基納米材料與天然高分子之間經由醯胺鍵互交聯，天然高分子之間經由醯胺鍵自交聯，一維無機納米材料吸附於天然高分子。
另一種支架材料，按重量份，包括0.1～1碳基納米材料、1～5天然高分子和1～5一維無機納米材料。
碳基納米材料如：但不僅限於氧化石墨烯，石墨烯量子點和碳納米管等。
天然高分子材料如：但不僅限於膠原蛋白，水溶性殼聚糖和絲素蛋白等。
一維無機納米材料如：但不僅限於納米羥基磷灰石納米粒子(nHA)、納米二氧化矽納米粒子(nSiO2)等，粒徑為1nm～100nm。
一種製取支架材料的方法，包括如下步驟：
先製得濃度1w/v％～5w/v％天然高分子(如：2w/v％)和濃度0.1w/v％～1w/v％碳基納米材料(如：0.2w/v％)的混合液，再加入一維無機納米材料(如：濃度至1w/v％～5w/v％)，一維無機納米材料經靜電吸附作用而吸附於天然高分子上，製得一維無機納米材料/碳基納米材料/天然高分子混合水溶液；
加入縮合劑和活化劑，攪拌均勻後，室溫靜置交聯2小時，得納米複合水凝膠；
所得納米複合水凝膠進行預冰凍處理(如：放置-40℃冰箱裡24hr)，之後進行冷凍乾燥，得到支架材料預產物，用去離子水超聲清洗3次，每次5分鐘，再經冷凍乾燥，得到支架材料。
縮合劑如：但不僅限於1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，J.Org.Chem.1961，26，2525)。
活化劑如：但不僅限於N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)。
本發明的支架材料具有組織誘導活性，無需使用組織分化培養基，即能促進接種其上的細胞(如：骨髓間充質幹細胞、脂肪幹細胞)進行組織分化，如：
在支架材料上接種幹細胞，體外非成骨分化培養基培養7天，待細胞貼壁增殖良好後，將納米複合支架材料移植到體內非承重骨(如：眼眶骨和顱蓋骨)骨缺損處，移植後隨訪觀察3月，CT檢查缺損部位骨修復效果良好。
由此可見，在目前大部分細胞成骨分化都是在分化培養基的培養條件下進行，本發明具有在非成骨分化培養基培養環境下，三維支架通過化學誘導作用和表面微納結構作用促進細胞成骨分化。
本發明技術方案實現的有益效果：
本發明提供的支架材料，是具有良好組織誘導(如：硬骨組織誘導和軟骨組織誘導)活性的納米複合支架材料，不僅可以通過納米材料的化學活性誘導幹細胞的分化(如：骨向分化，以及向軟骨分化等)，而且能夠通過支架材料表面微納結構調控幹細胞的分化(如：骨向分化，以及向軟骨分化等)。
在非承重骨(如：眼眶骨和顱蓋骨)骨缺損時，作為組織工程支架體外接種幹細胞後，移植在缺損部位，促進新骨的再生並修復缺損骨組織。
附圖說明
圖1A為本發明nHA/GO/CMC交聯10分鐘後的形貌圖；
圖1B為本發明nHA/GO/CMC交聯2小時後的形貌圖；
圖2A為本發明nHA/GO/CMC支架材料形貌圖；
圖2B為本發明nHA/GO/CMC支架材料掃描電鏡圖；
圖3為本發明細胞成骨分化後成骨相關因子基因表達水平圖；
圖4為本發明細胞成骨分化後成骨相關蛋白表達水平凝膠電泳圖；
圖5為本發明細胞在nHA/GO/CMC複合支架生長7天後鹼性磷酸酶染色結果和生長14天後茜素紅染色結果圖；
圖6為本發明細胞在nHA/GO/CMC複合支架生長7天後的螢光照片。
具體實施方式
以下結合附圖詳細描述本發明的技術方案。本發明實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍中。
實施例1支架材料修復大鼠顱蓋骨缺損
(1)稱取4g羧甲基殼聚糖(CMC)溶解於100mL去離子水中得到4％(w/v)CMC水溶液；稱取0.4g氧化石墨烯(GO)溶解於100mL去離子水中，並超聲(200W，80％)1個小時得到黃褐色透明0.4％(w/v)GO水溶液。
(2)取5mL 4％(w/v)CMC水溶液與5mL 0.4％(w/v)GO水溶液磁力攪拌混合，再放置在超聲發生器中超聲(200W，80％)分散1h，得到2％(w/v)GO和0.2％(w/v)CMC充分混合的水溶液。
(3)稱取0.1g nHA加入到上述混合水溶液中，超聲(200W，80％)分散1h，獲得均勻分散的nHA/GO/CMC混合溶液。
(4)取上述10mL nHA/GO/CMC混合溶液中加入1mL 1mM EDC水溶液和250μL 1mM NHS水溶液並迅速攪拌均勻，將混合後的溶液放置在室溫下靜止10min，得到nHA/GO/CMC凝膠，並在室溫下再靜止2hr，得到充分交聯的nHA/GO/CMC複合凝膠(如圖1A和圖1B)。
(5)將nHA/GO/CMC複合凝膠進行放置在-40度冰箱裡進行預冰凍處理24hr，之後放置冷凍乾燥機進行冷凍乾燥，得到nHA/GO/CMC複合支架預產物。
(6)將nHA/GO/CMC複合支架預產物放置在去離子水中超聲清洗3次(每次5min)，去掉反應副產物，再進行冷凍乾燥，獲得nHA/GO/CMC複合三維多孔支架待用，三維多孔支架孔徑大小為200±10μm，孔隙率為90％，支架表面呈現微納粗糙結構(如圖2A和圖2B)。
(7)將nHA/GO/CMC複合三維多孔支架鋪板在6孔板中，並接種大鼠來源骨髓間充質幹細胞(rBMSCs)後，用非成骨分化培養基(10％FBS、90％DMEM培養基和1％青鏈黴素)培養細胞7天、14天後，提取細胞tRNA，反轉錄為cDNA後，通過螢光定量PCR分析檢測成骨相關因子如：鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)的基因表達水平，相對於對照組(CMC三維多孔支架、GO/CMC複合三維多孔支架)，實驗組(nHA/GO/CMC複合三維多孔支架)基因表達水平顯著上調(P＜0.05)(參見圖3)，同時在rBMSCs培養7天後，提取細胞總蛋白，從蛋白水平檢測分析成骨相關蛋白(BSP，OCN，OPN)的表達水平，結果顯示成骨相關蛋白在實驗組(nHA/GO/CMC複合三維多孔支架)的表達水平最高(圖4)。
(8)將nHA/GO/CMC複合三維多孔支架鋪板在6孔板中，並接種大鼠來源骨髓間充質幹細胞(rBMSCs)後，用非成骨分化培養基(10％FBS、90％DMEM培養基和1％青鏈黴素)培養細胞7天後進行鹼性磷酸酶(ALP)染色，培養14天後進行茜素紅(ARS)染色，染色結果顯示實驗組(nHA/GO/CMC複合三維多孔支架)較對照組(CMC三維多孔支架、GO/CMC複合三維多孔支架)有明顯的細胞外基質礦化現象(參見圖5)。
(9)將nHA/GO/CMC複合三維多孔支架修剪為直徑為5mm，高度為1.2mm原片，將1×106大鼠來源骨髓間充質幹細胞(rBMSCs)接種在nHA/GO/CMC複合三維多孔支架上，體外用非成骨分化培養基培養7d，待細胞貼壁並增殖良好(如圖6)。
(10)選用6周～8周齡雌性SD大鼠，無菌狀態下使用5％戊巴比妥(劑量為3.5mg/100g)行腹腔麻醉，使用75％酒精消毒大鼠顱骨皮膚，並做1.0cm縱向切口，依次切開皮膚、皮下組織、肌肉、骨膜層，鈍性分離骨膜，暴露顱骨組織。用外徑5mm的環鑽在大鼠顱骨上製作直徑5mm的圓形全層骨膜骨質缺損，然後仔細衝洗創面，去除殘留碎骨。嚴密止血後，將上述nHA/GO/CMC複合三維多孔支架填充於缺損區，使用5-0縫線逐層縫合骨膜和皮膚。
(11)術後12周，經腹腔注射過量戊巴比妥以處死實驗大鼠。標本使用4％福馬林固定24h。然後，將各組樣品行Micro-CT檢測，20μm層掃，並進行三維重構，通過系統自帶軟體分析新生骨體積佔總體積百分比(BV/TV)，達到新骨形成量80％以上。
實施例2支架材料修復犬眼眶骨缺損
(1)稱取4g膠原蛋白(Col)溶解於100mL去離子水中得到4％(w/v)Col水溶液；稱取0.4g GO溶解於100mL去離子水中，並超聲(200W，80％)1個小時得到黃褐色透明0.4％(w/v)GO水溶液。
(2)取5mL4％(w/v)Col水溶液與5mL0.4％(w/v)GO水溶液磁力攪拌混合，再放置在超聲發生器中超聲(200W，80％)分散1h，得到2％(w/v)Col和0.2％(w/v)GO充分混合的水溶液。
(3)稱取0.2g納米二氧化矽(nSiO2)加入到上述混合水溶液中，超聲(200W，80％)分散1h，獲得均勻分散的nSiO2/GO/Col混合溶液。
(4)取上述10mL nSiO2/GO/Col混合溶液中加入1mL 1mM EDC水溶液和250μL 1mM NHS水溶液並迅速攪拌均勻，將混合後的溶液放置在室溫下靜止10min，得到nSiO2/GO/Col凝膠，並在室溫下再靜止2hr，得到充分交聯的nSiO2/GO/Col複合凝膠。
(5)將nSiO2/GO/Col複合凝膠進行放置在-40度冰箱裡進行預冰凍處理24hr，之後放置冷凍乾燥機進行冷凍乾燥，得到nSiO2/GO/Col複合支架預產物。
(6)將nSiO2/GO/Col複合支架預產物放置在超純水中超聲清洗3次(每次5min)，去掉反應副產物，再進行冷凍乾燥，獲得nSiO2/GO/Col複合三維多孔支架待用。
(7)將nSiO2/GO/Col複合三維多孔支架修剪為直徑為8mm，高度為1.2mm原片，將1.5×106犬來源間充質幹細胞(bBMSCs)接種在nSiO2/GO/Col複合三維多孔支架上，體外用非成骨分化培養基培養7d，待細胞貼壁並增殖良好。
(8)選成年比格犬全麻後於下眶緣切口分離至內下眶緣，切開骨膜暴露眶內側壁，模擬人眶內下壁骨缺損的狀況，用骨科環鑽鑽除眶內下壁直徑8mm大小的全層圓形骨組織，去除局部的骨膜和篩竇黏膜，嚴密止血後，將上述nSiO2/GO/Col複合三維多孔支架填充於缺損區，分層關閉切口。術後3月進行犬眼眶CT掃描，觀察眼眶骨缺損自行修復情況，新骨形成量達80％以上。測量犬雙側眼球突出度及對稱情況，並觀察眼球運動情況，眼球運動良好，對稱情況良好，並無突出。