編碼黃酮合酶的基因的製作方法

2024-03-02 14:29:15

專利名稱：編碼黃酮合酶的基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及通過基因工程技術控制和利用黃酮的生物合成，黃酮對植物中花的顏色，防紫外線的保護作用，與微生物的共生等有影響。更具體地，本發明涉及編碼蛋白質的基因及其應用，所述蛋白質具有由黃烷酮合成黃酮的活性。
「類黃酮」是具有C6-C3-C6碳骨架的一組化合物的通稱，它們廣泛分布於植物細胞中。已知類黃酮具有吸引昆蟲和其它傳粉者的功能，可保護植物免受紫外線的侵襲，並參與與土壤微生物的相互作用(BioEssays,16(1994),Koes等，p123；Trends in Plant Science,1(1997),Shirley,B.W.,p.377)。
在類黃酮中，黃酮在植物與微生物的相互作用中起著重要作用，尤其是在豆科植物中更是如此，其中它們參與了與豆科細菌共生的起始步驟(植物細胞，7(1995),Dixon和Paiva,p.1085；植物病理學年評，33(1995),Spaink,p.345)。花瓣中的黃酮在被昆蟲識別方面起作用並可用作輔色素而與花青苷形成複合物(Gendai Kagaku,(May,1998),Honda和Saito,p.25；Prog.Chem.Org.Natl.Prod.,52(1987),Goto,T.,p.114)。已知當黃酮與花青苷形成複合物時，花青苷的吸光度最大值往較長的波長偏移，即往藍色方向偏移。
已廣泛研究了類黃酮的生物合成途徑(植物細胞，7(1995),Holton和Cornish,p.1071)，已分離出參與花青素3-葡糖苷和黃酮醇生物合成的所有酶的基因。然而，尚未分離出參與黃酮生物合成的基因。合成黃酮的酶包括屬於雙加氧酶家族並依賴於2-氧化戊二酸的酶(黃酮合酶Ⅰ)和屬於細胞色素P450家族的單加氧酶(黃酮合酶Ⅱ)。這些酶是沒有結構同源性的完全不同的酶。
據報導，在歐芹中，依賴於2-氧化戊二酸的雙加氧酶催化由柚苷配基(一種黃烷酮)生產芹菜苷配基(一種黃酮)的反應(Z.Naturforsch.,36C(1981),Britsch等，p.742；Arch.Biochem.Biophys.,282(1990),Britsch,p.152)。已知其它類型的黃酮合酶Ⅱ存在於金魚草(Z.Naturforsch.,36C(1981),Stotz和Forkmann,p.737)和大豆(Z.Naturforsch.,42C(1987),Kochs和Gri sebach,p.343；Planta,171(1987),Kochs等，p.519)中。最近，有人報導了大丁草花瓣中的基因座和黃酮合酶Ⅱ活性之間的相關性(植物化學，49(1998),Martens和Forkmann,p.1953)。然而，無人報導已分離出黃酮合酶Ⅰ和Ⅱ的基因或已高度純化了黃酮合酶Ⅱ。
研究了細胞色素P450蛋白的特性，該蛋白質具有甘草二酮-合成活性，當用誘發劑處理經培養的甘草(Glycyrrhiza echinata)細胞時可誘導該活性。據信該蛋白質可催化甘草根亭配基(其為5-脫氧黃烷酮)第2位的羥化，接著非酶促打開半縮醛環，產生甘草二酮(植物生理學，105(1994),Otani等，p.1427)。為了克隆甘草二酮合酶，由經誘導劑處理的甘草培養細胞製備cDNA文庫，克隆出8個編碼細胞色素P450的基因片斷(植物科學，126(1997),Akashi等，p.39)。
由這些片斷得到2個不同的全長cDNA序列，各編碼細胞色素P450,直至那時它們仍是未知的。具體地說，它們是CYPGe-3(細胞色素P450 No.CYP81E1)和CYPGe-5(細胞色素P450 No.CYP93B1，下文稱之為CYP93B1)(植物生理學，115(1997),Akashi等，p.1288)。通過在使用培養的昆蟲細胞的系統中進一步表達CYP93B1 cDNA，證實該基因編碼的蛋白質可催化由甘草根亭配基(一種黃烷酮)合成甘草二酮的反應，和由柚苷配基(一種黃烷酮)生產2-羥基柚苷配基的反應。
通過用10％鹽酸進行酸處理(室溫，2小時)使2-羥基柚苷配基轉變為芹菜苷配基(一種黃酮)。通過使聖草酚與表達CYP93B1的酵母的微粒體反應，接著進行酸處理可將聖草酚轉變為藤黃菌素(一種黃酮)。由此闡明細胞色素P450基因編碼黃烷酮2-羥化酶活性的功能(FEBS Lett.,431(1998),Akashi等.,p.287)。這裡，由柚苷配基生產芹菜苷配基需要CYP93B1以及另一個未知的酶，由此得出的結論是總共需要兩種酶。
然而，目前尚未鑑定出具有不經酸處理直接由黃烷酮(如柚苷配基)合成黃酮(如芹菜苷配基)之活性的酶。因此，儘管黃酮在植物中具有多種功能，但控制植物中的黃酮生物合成和改善黃酮參與的生物功能，如花的顏色的技術尚未見報導。與將參與由黃烷酮合成黃酮的兩種酶的基因導入植物細胞相比，本身可催化由黃烷酮合成黃酮的酶的發現，該酶基因的獲得，以及將該基因導入植物中具有更強的可操作性和工業實用性。
另外，在天然含有大量黃酮的花瓣中，預期通過反義方法或共抑制法控制黃酮合酶基因的表達也能改變花的顏色。另外，根據黃酮的抗細菌活性及其與土壤微生物的相互作用而在適當器官中表達黃酮合酶基因可增加植物抗細菌活性並因促進了與根際微生物的共生關係而改善豆科植物的固氮能力，並能獲得防紫外線和光照的保護作用。
因此，本發明提供了編碼可直接由黃烷酮合成黃酮的蛋白質的基因，該基因具體為編碼黃酮合酶Ⅱ的基因，黃酮合酶Ⅱ可通過單個酶反應催化由黃烷酮合成黃酮的反應(下文稱之為「黃酮合酶Ⅱ」)。
更具體地，本發明提供了編碼P450蛋白的基因，所述蛋白質具有序列表中SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列，並具有由黃烷酮合成黃酮的活性，還提供了編碼具有經修飾的胺基酸序列但仍具有由黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質的基因，其中所述修飾是通過在上述胺基酸序列中添加或缺失一個或多個胺基酸和/或用不同胺基酸取代完成的。
本發明還提供了編碼具有與序列表中SEQ ID NO:2所示胺基酸序列至少有55％同一性的胺基酸序列的蛋白質的基因，所述蛋白質具有由黃烷酮合成黃酮的活性。
本發明還提供了編碼具有由黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質的基因，該基因在5×SSC,50℃的條件下可與序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的全部或部分雜交。
本發明還提供了載體，尤其是表達載體，其含有上述任一種基因。
本發明還提供了被上述載體轉化的宿主。
本發明還提供了由上述任一種基因編碼的蛋白質。
本發明還提供了生產上述蛋白質的方法，所述方法的特徵在於培養上述宿主並從宿主中收集具有黃酮合成活性的蛋白質。
本發明還提供了其中導入了上述任一種基因的植物，或表現出相同特性的植物後代或其組織，如切花。
本發明還提供了使用上述基因改變類黃酮的量和組成的方法；使用上述基因改變黃酮量的方法；使用上述基因改變花的顏色的方法；使用上述基因使花的顏色變藍的方法；使用上述基因使花的顏色更紅的方法；使用上述基因修飾植物的光敏性的方法；使用上述基因控制植物和微生物之間的相互作用的方法。
實施本發明的具體方案由甘草CYP93B1基因編碼的黃烷酮2-羥化酶由底物黃烷酮產生了2-羥基黃烷酮，通過酸處理將產物轉變為黃酮。本發明人認為通過使用得自甘草的cDNA CYP93B1篩選例如含有大量黃酮的花的cDNA文庫，從而得到編碼具有直接由底物黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質的cDNA，即可得到編碼黃酮合酶Ⅱ的基因(這是本發明的目的之一)。根據本發明，使用得自甘草的cDNA CYP93B1為探針篩選含有大量黃酮的紫蘇的cDNA文庫，可得到編碼新細胞色素P450的cDNA(見實施例1)。
在酵母中表達得自紫蘇的cDNA並與底物柚苷配基(一種黃烷酮)反應，結果無需經酸處理即可產生黃酮芹菜苷配基而不是2-羥基柚苷配基(見實施例2)。換句話說，該酶可直接由黃烷酮產生黃酮，而無需經酸處理，經證實，其基因為以前從未克隆過的黃酮合酶Ⅱ基因。
本發明的基因可以是例如編碼序列表中SEQ ID NO:2所示胺基酸序列的基因。然而，已知其胺基酸序列經添加或缺失多個胺基酸和/或被不同胺基酸取代而被修飾的蛋白質可保持與原始蛋白質相同的酶活性。因此，具有序列表中SEQ ID NO:2所示胺基酸序列，但其中的胺基酸序列經添加或缺失一個或多個胺基酸和/或被不同胺基酸取代而被修飾的蛋白質，以及編碼所述蛋白質的基因也包含在本發明中，只要它們保持直接由黃烷酮生產黃酮之活性即可。
本發明還涉及具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列和編碼本文所述胺基酸序列之核苷酸序列，或在例如5×SSC,50℃的條件下可與所述核苷酸序列的部分雜交的基因，條件是它們能編碼具有由黃烷酮生產黃酮之活性的蛋白質。適當的雜交溫度隨核苷酸序列和核苷酸序列長度的不同而不同，例如，當所用探針是含有編碼6個胺基酸的18個鹼基長的DNA片斷時，優選溫度不超過50℃。
所述雜交選擇的基因可以是天然的，例如得自如金魚草，蝴蝶草或紫蘇的植物基因；也可以是另一種植物的基因，如龍膽，馬鞭草，菊，鳶尾草等的基因。雜交所選擇的基因可以是cDNA或基因組DNA。
本發明還涉及編碼具有與序列表中SEQ ID NO:2所示胺基酸序列至少有55％，優選至少70％，如80％或以上甚至90％或以上同一性的胺基酸序列的蛋白質的基因，所述蛋白質具有由黃烷酮合成黃酮的活性。
通過如實施例所述篩選cDNA文庫可得到具有天然核苷酸序列的基因。可使用具有天然核苷酸序列的DNA作為起始物質，通過常規的定點誘變或PCR法合成編碼具有經修飾的胺基酸序列的酶的DNA。例如，通過用限制性酶處理天然cDNA或基因組DNA，然後用作定點誘變或PCR(使用的引物中導入了所需的突變)的模板，即可得到其中導入所需修飾的DNA片斷。然後可將已導入突變的DNA片斷與編碼靶酶另一部分的DNA片斷連接。
或者，為了得到編碼由縮短的胺基酸序列組成的酶的DNA，例如，可用所需的限制性核酸內切酶切割編碼長於目的胺基酸序列的胺基酸序列(如全長胺基酸序列)的DNA，如果所得DNA片斷不編碼完整的靶胺基酸序列，可將該片斷與含有其餘序列的合成DNA連接。
可在使用大腸桿菌或酵母的表達系統中表達所得的基因，檢測其酶活性以證實所得基因編碼黃酮合酶。通過表達基因，也可得到黃酮合酶蛋白作為基因產物。或者，甚至可以使用SEQ ID NO:2所示的全部或部分胺基酸序列的抗體來得到黃酮合酶蛋白，可使用這種抗體克隆另一種生物中的黃酮合酶基因。
因此，本發明還涉及含有上述基因的重組載體，尤其是表達載體，並涉及被這些載體轉化的宿主。所用宿主可以是原核或真核生物。常用作宿主的原核生物的例子包括埃希氏菌屬的細菌，如大腸桿菌，和芽孢桿菌屬的微生物，如枯草芽孢桿菌。
可以使用的真核宿主的例子包括低等真核生物，如真核微生物(如真菌門中的酵母和絲狀真菌)。至於酵母，可提及的是屬於糖酵母屬的微生物，如釀酒酵母，至於絲狀真菌，可提及的是屬於麴黴屬的微生物，如米麴黴和黑麴黴和青黴屬的微生物。也可使用動物細胞和植物細胞，動物細胞可以是小鼠，倉鼠，猴或人的細胞系。也可使用昆蟲細胞，如家蠶細胞或成年家蠶本身。
本發明的表達載體可包括表達調節區，如啟動子和終止子，複製起點等，這取決於它們欲導入的宿主類型。可以使用的細菌表達載體啟動子的例子包括常規的啟動子，如trc啟動子，tac啟動子，lac啟動子等。可以使用的酵母啟動子的例子包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子，PH05啟動子等。可以使用的絲狀真菌啟動子的例子包括澱粉酶啟動子，trpC等。可以使用的動物細胞宿主啟動子的例子包括病毒啟動子，如SV40早期啟動子，SV40晚期啟動子等。
根據常規方法，使用限制性核酸內切酶，連接酶等可以製備表達載體。用表達載體轉化宿主也可根據常規方法進行。
可以培養，栽培或發酵被表達載體轉化的宿主，可根據常規方法，如過濾，離心分離，細胞破碎，凝膠過濾層析，離子交換層析等從培養產物中回收和純化靶蛋白質。
本說明書全文討論了得自紫蘇的黃酮合酶Ⅱ，該酶能直接由黃烷酮合成黃酮，已知細胞色素P450基因構成了超家族(DNA和細胞生物學，12(1993),Nelson等，p.1)，相同家族中的細胞色素P450蛋白的胺基酸序列具有40％或更高的同一性，而亞家族中的細胞色素P450蛋白的胺基酸序列具有55％或更高的同一性，它們的基因能互相雜交(Pharmacogenetics,6(1996),Nelson等，p.1)。
例如，首次從矮牽牛屬植物中分離出類黃酮3』,5』-羥化酶的基因，所述酶是細胞色素P450的一種並參與類黃酮合成途徑(自然，366(1993),Holton等，p.276)，使用矮牽牛類黃酮3』,5』-羥化酶基因作為探針易於從龍膽(植物細胞生理學，37(1996),Tanaka等，p.711)，草原龍膽，風鈴草(WO93/18155(1993),Kikuchi等)，薰衣草，蝴蝶草和馬鞭草(Shokubutsu no Kagaku Chosetsu,33(1998),Tanaka等，p.55)中分離出類黃酮3』,5』-羥化酶基因。
因此，本發明的能直接由黃烷酮合成黃酮的紫蘇黃酮合酶Ⅱ基因的全部或部分可用作探針以從不同種植物中得到能直接由黃烷酮合成黃酮的紫蘇黃酮合酶Ⅱ基因。另外，通過純化本說明書中所述的能直接由黃烷酮合成黃酮的紫蘇黃酮合酶Ⅱ，通過常規方法得到抗該酶的抗體，即可得到與抗體反應的不同黃酮合酶Ⅱ蛋白，並得到編碼這些蛋白質的基因。
因此，本發明並不僅限於能直接由黃烷酮合成黃酮的紫蘇黃酮合酶Ⅱ基因，還涉及得自多種其它植物的能直接由黃烷酮合成黃酮的黃酮合酶Ⅱ。除了本文所述的紫蘇外，所述黃酮合酶Ⅱ基因的來源還可以是龍膽，馬鞭草，菊，鳶尾草，鴨蹠草，矢車菊，鼠尾草，喜林草等，但本發明的範圍不限於這些植物。
本發明還涉及通過導入一個或多個能直接由黃烷酮合成黃酮的黃酮合酶Ⅱ基因使顏色被修飾的植物，以及植物的後代或其組織，所述組織也可以是切花的形式。通過使用本發明的黃酮合酶Ⅱ或其已被克隆的基因，可以在只產生很少黃酮或根本不產生黃酮的植物種或變種中產生黃酮。通過在花瓣中表達一個或多個黃酮合酶Ⅱ基因，可以增加花瓣中黃酮的量，從而使花的顏色往例如，藍色方向轉變。
相反，通過抑制黃酮在花瓣中合成，可以使花的顏色往例如，紅色方向轉變。然而，黃酮對花色的作用很大，因此花色的改變並不局限於上述類型。就目前的技術水平而言，可以將基因導入植物並以組成型或組織特異性的方式表達基因，但是，也可以通過反義法或共抑制法抑制靶基因的表達。
可轉化的植物的例子包括玫瑰，菊，麝香石竹，金魚草，仙客來，紅門蘭，草原龍膽，香雪蘭，扶郎花，唐菖蒲，滿天星，伽藍菜，百合，天竺葵，老鶴草，碧冬茄，蝴蝶草，鬱金香，水稻，大麥，小麥，油菜子，馬鈴薯，番茄，白楊，香蕉，桉樹，甜馬鈴薯，大豆，苜蓿，羽扇豆，玉米等，但並不限於這些植物。
由於黃酮具有如上所述的多種生理學活性，它們可賦予植物新的生理學活性或經濟價值。例如，通過在根中表達產生黃酮的基因，可以促進對該植物有利的微生物的生長，從而促進植物生長。也可以合成在人，動物或昆蟲中表現出生理學活性的黃酮。
下列實施例將更詳細地解釋本發明。除非特別說明，可根據分子克隆(Sambrook等，1989)進行分子生物學方法。
實施例1．克隆紫蘇黃酮合酶Ⅱ基因從紫蘇(Perilla frutescens)葉中提取RNA，通過Oligotex得到polyA+RNA。根據Gong等(植物分子生物學，35(1997),Gong等，p.915)的方法，將polyA+RNA用作模板以使用λgt10(Stratagene)為載體來製備cDNA文庫。使用全長CYP93B1 cDNA為探針篩選cDNA文庫。根據廠商推薦的方法，在低嚴緊條件下使用DIG-DNA-標記和檢測試劑盒(Boehringer)進行陽性克隆的篩選和檢測。
具體地說，42℃下，使用雜交緩衝液(5×SSC,30％甲醯胺，50mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0),1％SDS,2％阻斷試劑(Boehringer),0.1％月桂醯基肌氨酸，80微克/ml鮭精DNA)預雜交2小時，然後加入DIG標記的探針，將混合物放置過夜。65℃下，用含有1％SDS的5×SSC洗滌溶液將膜浸洗1.5小時。得到一個陽性克隆，將其稱為噬菌體克隆#3。通過測定#3 cDNA之5』末端的核苷酸序列，預期#3 cDNA編碼與甘草CYP93B1編碼的黃烷酮2-羥化酶具有高同一性的序列，推測其編碼功能類似於黃烷酮2-羥化酶的P450。
所得#3 cDNA編碼的蛋白質在胺基酸水平上與CYP93B1所編碼的黃烷酮2-羥化酶具有52％的同一性。紫蘇克隆#3 cDNA的核苷酸序列示於SEQ ID NO.1，由其推定的胺基酸序列示於SEQ ID NO.2。
實施例2．在酵母中表達紫蘇黃酮合酶Ⅱ基因進行下列實驗以檢測實施例1所得紫蘇cDNA #3編碼的蛋白質的酶活性。將實施例1所得的噬菌體克隆#3用作PCR(使用λ Arm引物(Stratagene))模板。PCR條件是98℃1分鐘；98℃15秒，55℃10秒，74℃30秒共20個循環；接著74℃10分鐘。將擴增的DNA片斷亞克隆至pBluescript KS(-)的EcoRV位點。選擇在pBluescript KS(-)的SalⅠ位點具有紫蘇#3 cDNA起始密碼子的克隆，將其稱為pFS3。測定pFS3 cDNA的核苷酸序列，進行PCR以證實不存在錯誤。
將通過用SalⅠ和XbaⅠ消化pFS3得到的約1.8kb的DNA片斷與用XhoⅠ和XbaⅠ預消化的pYES2連接，產生質粒pYFS3。然後將所得質粒導入BJ2168酵母(Nihon Gene)。通過Akashi等(FEBS Lett.,431(1998),Akashi等，p.287)所述的方法測定酶活性。30℃，在20ml選擇培養基(6.7mg/ml無胺基酸的酵母含氮鹼基(Difco),20mg/ml葡萄糖，30微克/ml亮氨酸，20微克/ml色氨酸和5mg/ml酪蛋白胺基酸)中將轉化的酵母細胞培養24小時。
離心收集酵母細胞之後，30℃，在表達培養基(10mg/ml酵母提取物，10mg/ml蛋白腖，2微克/ml氯高鐵血紅素，20mg/ml半乳糖)中將收集的酵母細胞培養48小時。收集酵母細胞之後，通過懸浮在水中並收集細胞以進行洗滌。用玻璃珠破碎細胞10分鐘，然後以8000g的轉速離心細胞10分鐘，以15,000g的轉速進一步離心上清液10分鐘以得到粗酶級分。
30℃下，將15微克(R,S)-柚苷配基(溶解於30微升2-甲氧乙醇中)，1ml粗酶溶液和1mM NADPH的混合物(總反應混合物體積1.05ml)反應2小時。通過加入30微升醋酸終止反應之後，加入1ml乙酸乙酯並混合。離心後，用蒸發器乾燥乙酸乙酯層，將殘留物質溶解於100微升甲醇中並用HPLC進行分析。根據Akashi等(FEBS Lett.,431(1998),Akashi等，p.287)所述的方法進行分析。酸處理包括將蒸發器乾燥的樣品溶解於150微升含有10％鹽酸的乙醇中，攪拌30分鐘。用1.3ml水稀釋，加入800微升乙酸乙酯，混合，離心，回收乙酸乙酯層，然後乾燥，溶解於200微升甲醇中並用HPLC進行分析。
表達pYFS3的酵母由柚苷配基產生了芹菜苷配基，而無需用酸處理反應混合物。這表明紫蘇pFS3 cDNA編碼具有黃酮合酶Ⅱ活性的蛋白質。
工業實用性通過將本發明的cDNA與適當植物表達載體連接，並將其導入植物中以表達或抑制黃酮合酶的表達，即可改變花的顏色。另外，通過不僅在花瓣中還在整個植物或其適當器官中表達黃酮合酶基因，可以增加抗植物微生物的抗性，或者通過促進與根際微生物的關係而改善豆科植物的固氮能力，以及改善植物防紫外線和光照的保護性作用。
序列表110SUNTORY LIMITED120編碼黃酮合成酶的基因130160221012111770212DNA213紫蘇220223編碼具有直接將黃烷酮轉變為黃酮之活性的蛋白質的核苷酸序列400 1tgtcgacgga gcaagtggaa atg gca ctg tac gcc gcc ctc ttc ctc ctg tcc 53Met Ala Leu Tyr Ala Ala Leu Phe Leu Leu Ser1 5 10gcc gcc gtg gtc cgc tcc gtt ctg gat cga aaa cgc ggg cgg ccg ccc 101Ala Ala Val Val Arg Ser Val Leu Asp Arg Lys Arg Gly Arg Pro Pro15 20 25tac cct ccc ggg ccg ttc cct ctt ccc atc atc ggc cac tta cac ctc 149Tyr Pro Pro Gly Pro Phe Pro Leu Pro Ile Ile Gly His Leu His Leu30 35 40ctc ggg ccg aga ctc cac caa acc ttc cac gat ctg tcc caa cgg tac 197Leu Gly Pro Arg Leu His Gln Thr Phe Mis Asp Leu Ser Gln Arg Tyr45 50 55ggg ccc tta atg cag ctc cgc ctc ggg tcc atc cgc tgc gtc att gct 245Gly Pro Leu Met Gln Leu Arg Leu Gly Ser Ile Arg Cys Val Ile Ala60 65 70 75gcc tcg ccg gag ctc gcc aag gaa tgc ctc aag aca cac gag ctc gtc 293Ala Ser Pro Glu Leu Ala Lys Glu Cys Leu Lys Thr His Glu Leu Val80 85 90ttc tcc tcc cgc aaa cac tcc acc gcc att gat atc gtc acc tac gat341Phe Ser Ser Arg Lys 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Gln Glu Val Val Ile Ile Ile Gly Thr Met Ile Gln Cys Phe Asp450 455 460Trp Lys Leu Pro Asp Gly Ser Gly His Val Asp Met Ala Glu Arg Pro465 470 475 480Gly Leu Thr Ala Pro Arg Glu Thr Asp Leu Phe Cys Arg Val Val Pro485 490 495Arg Val Asp Pro Leu Val Val Ser Thr Gln500 50權利要求
1．基因，其編碼具有序列表之SEQ ID NO:2所示胺基酸序列並顯示出由黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質，或編碼具有下述胺基酸序列之一種並具有由黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質，其中這些胺基酸序列已通過添加或缺失一個或多個胺基酸和/或用不同胺基酸進行一個或多個取代而被修飾。
2．權利要求1的基因，其與序列表之SEQ ID NO:2所示胺基酸序列至少具有55％的同一性，並具有由黃烷酮合成黃酮的活性。
3．權利要求1或2的基因，其在5×SSC,50℃下，能與序列表之SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的全部或部分雜交，並且編碼具有由黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質。
4．載體，其含有權利要求1至3中任一項所述的基因。
5．被權利要求4的載體轉化的宿主。
6．由權利要求1至3中任一項所述的基因編碼的蛋白質。
7．生產具有黃酮合成活性之蛋白質的方法，其特徵在於培養或生長權利要求5的宿主並從所述宿主中回收所述蛋白質。
8．其中已導入權利要求1至3中任一項所述基因的植物，或表現出相同特性的所述植物的後代或其組織。
9．權利要求8之植物或其具有相同特性的後代的切花。
10．使用權利要求1至3中任一項所述的基因改變類黃酮組成和/或其量的方法。
11．使用權利要求1至3中任一項所述的基因改變黃酮的量的方法。
12．使用權利要求1至3中任一項所述的基因改變花的顏色的方法。
13．使用權利要求1至3中任一項所述的基因使花的顏色變藍的方法。
14．使用權利要求1至3中任一項所述的基因使花的顏色變紅的方法。
15．使用權利要求1至3中任一項所述的基因改變植物光敏性的方法。
16．使用權利要求1至3中任一項所述的基因控制植物和微生物的相互作用的方法。
全文摘要
從例如紫蘇中得到的編碼可直接將黃烷酮轉變為黃酮的酶的DNA及其用途;DNA和所編碼酶的胺基酸序列示於SEQ ID NO:1＆2。將該基因導入植物中可例如改變植物的花色。
文檔編號C12N9/02GK1310762SQ00800102
公開日2001年8月29日 申請日期2000年6月30日 優先權日1999年7月19日
發明者水谷正子, 田中良和, 久住高章, 綾部真一, 明石智義 申請人:三得利株式會社