一種檢測多種傳染病的檢測型基因晶片及應用的製作方法
2023-06-09 13:02:21 2
專利名稱：一種檢測多種傳染病的檢測型基因晶片及應用的製作方法
技術領域：
本發明一種檢測多種傳染病的檢測型基因晶片及應用涉及的技術領域是醫學檢驗和基因晶片技術。是一種用於傳染病檢測的基因晶片，對流行性出血熱、恙蟲病、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾、霍亂、0157H7出血性腸炎7種主要傳染病進行檢測並分型或鑑定毒株。
因此，對這些病原體快速檢測並確定型別不僅有重要的臨床價值，為及時有效地預防、治療和控制傳染病提供依據，而且對保障群眾身體健康和確保部隊的生存力和戰鬥力，以及反生物恐怖等均有重要意義。
目前對上述7種重要傳染病的檢測方法主要基於對病原體的培養、毒素檢測、血清學(抗原或抗體)檢測，但這些檢測方法均不適合早期快速檢測，難於適應軍事鬥爭的需要，並且不易分型。如細菌的培養需要數天甚至數周的時間，瘧原蟲和釘螺的鏡檢費時費力，漏檢率高。酶聯免疫技術、免疫膠體金法、免疫螢光技術、放射免疫技術等免疫學方法具有快速、特異等優點，但大多要求在感染一定時間後才能偵檢，以及操作仍然比較複雜，或敏感性較低，或應用範圍狹窄，也不能分型等，往往只適合於流行病學調查。雖然近年來也發展了PCR技術及DNA探針雜交技術，但仍存在特異性和敏感性等方面的問題。常規PCR技術大多數限於單一病原體型別的臨床診斷，同時存在易被汙染和特異性問題，也難於適應大規模、高通量和平行檢測的要求。DNA探針雜交技術，在檢測的特異性方面有所提高，但操作步驟繁瑣，所需時間較長。
基因晶片(Gene Chip)是將大量的寡核苷酸分子固定於固相載體上形成DNA微點陣，藉助核酸分子雜交配對的特性對DNA樣品的序列信息進行高效解讀和分析。DNA晶片的製備方法主要有兩種一種是在直接在固定面上原位化學合成一系列寡核苷酸，另一種將預先合成好的不同寡核苷酸按照一定的排列方式點樣、固定在固相面上。製備好的晶片通過化學處理後即可進行雜交反應，利用雷射共聚集顯微掃描技術判定雜交結果。病原微生物，包括細菌、病毒的基因組序列已經逐步測出，為其分析提供了一個很好的切入點，而基因晶片又為檢測和平行研究病原微生物提供了有力的工具。將基因晶片技術用於疾病的診斷已成為全球研究的熱點，並已研製成功檢測部分病毒等微生物的基因晶片。基因晶片技術用於疾病診斷的優點有以下幾個方面一是高度的靈敏和準確性，用樣本極少；二是快速簡便、時間短；三是可同時檢測多人的多種疾病。鑑於生物晶片技術具有巨大的理論意義和實際應用價值，我國一些科研實力較雄厚的單位已開展了這方面的研究工作。然而，國內實用性晶片研究多剛剛起步，截至目前，國內外尚未見用於針對我國這7種重要傳染病(流行性出血熱、霍亂、大腸桿菌0157H7、瘧疾、恙蟲病、鉤端螺旋體、血吸蟲)的快速檢測的基因晶片。
流行性出血熱、恙蟲病、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾、霍亂、出血性腸炎(大腸桿菌0157H7)仍然是我國易發生流行的主要傳染病，尤其是在自然災害(如水災)後、大部隊集結以及其它突發情況下，嚴重威脅人類健康，常常危及生命和造成社會恐慌。如血吸蟲和瘧疾等雖然防治工作取得很大進展，但近年來有回潮現象。建立一種快速檢測這7種傳染病的基因晶片，對於傳染病的控制、預防和治療，有著重大的社會應用前景和軍事意義。
本發明主要針對東南沿海存在的7種主要傳染病(流行性出血熱、霍亂、大腸桿菌0157H7、瘧疾、恙蟲病、鉤端螺旋體、血吸蟲)，通過分析篩選這7種疾病病原體的DNA序列，分別設計不同的寡核苷酸片段，建立了包括檢測及鑑定基因晶片技術在內的綜合分析檢測方法，以期達到快速、準確、特異的檢測目的，並進行了應用。同時，根據傳染病流行和爆發的特點，研究制訂了這7種主要傳染病的有效、實用的緊急預防和處理措施。除研製出7種主要疫病檢測及分型基因晶片和建立了突發情況下傳染性疫病的緊急預防和處理措施，還為更多的傳染性疾病的分子生物學檢測和鑑定以及防制建立了理論和技術基礎。
一種檢測多種傳染病的檢測型基因晶片，其特徵在於晶片包括(1)多種傳染病的多種檢測寡核苷酸探針和質量控制寡核苷酸探針；(2)寡核苷酸探針通過手臂分子固化在載體材料上形成的探針陣列；所謂的多種傳染病的檢測型基因晶片是指檢測流行性出血熱、恙蟲病、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾、霍亂、出血性腸炎(大腸桿菌0157H7)七種病的寡核苷酸陣列；所謂的寡核苷酸探針是指能與目的基因雜交的多聚核苷酸，長度在十到五十個鹼基；所謂的檢測寡核苷酸探針是指化學合成的多種重要傳染病病原體的基因保守區、毒力因子序列、基因型及亞型的互補的寡聚核苷酸，毒力因子序列探針包括了病原體致病所必須的多種基因序列的探針，基因型及亞型決定區的探針包括多種基因型和和多種亞型探針；所謂的質量控制探針至少包括二種探針，即陽性對照，陰性對照；陰性對照用於檢測雜交信號錯誤或汙染，陽性對照用於檢測是否正常雜交和準確定位；所謂的手臂分子指具有雙活性基團的長鏈有機化合物；所謂的寡核苷酸探針固定為寡聚核苷酸的末端有一特定基團，固化在載體材料基質表面時，與表面修飾的手臂分子的末端基團形成共價鍵。
該檢測型基因晶片特徵在於流行性出血熱、恙蟲病、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾、霍亂、出血性腸炎(大腸桿菌0157H7)七種病每種病原體靶基因選擇有1-4個毒力序列探針或亞型特異性探針，並且根據需要添加其它突變探針和其它相關病原體的探針，探針包括了寡核苷酸探針和肽核酸探針。
設計了多組對多種傳染病病原體靶基因進行診斷、檢測、分型和流行病學調查的高特異性的擴增引物，其設計原則為每一個引物必須在對應病原體靶基因的高度特異性部位，每對引物的擴增區域為病原體靶基因特徵序列或毒力必須序列，儘可能包括分型所需的亞型特異性序列；引物包括了針對晶片檢測所需的逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)、多重聚合酶鏈反應(PCR)、常規PCR、不對稱PCR等的特異性引物，每一對特異性引物能夠擴增出基因庫GeneBank中所有同種病原體的基因片斷。
這些探針的固相載體材料包括多種方法處理的玻片、金屬片、矽片、陶瓷片、塑料片、硝酸纖維膜、尼龍膜和其它高分子聚合物製成的膜及片等。
這些固相載體表面以具有雙活性基團的長鏈有機化合物進行修飾，常用的具有雙活性基團的長鏈有機化合物試劑有戊二醛、三羥甲基氨基矽烷(APTES)、N，N-二乙氧基氨基丙基三乙氧基矽烷、多聚賴氨酸，可採用其中的一種或其中的兩種的組合。
擴增的PCR產物可通過標記螢光素Cy3、螢光素Cy5、生物素的引物進行標記等，也可在基因擴增過程中加入螢光素Cy3、螢光素Cy5、生物素等標記的dUTP或dCTP。
該檢測型基因晶片，能在流行性出血熱、恙蟲病、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾、霍亂、出血性腸炎(大腸桿菌0157H7)的檢測、分型、診斷、傳染病監測、流行病學調查、查明傳染病病原體種類及鑑定中應用。
該檢測型基因晶片可用於一種或多種傳染病病原體的檢測，包括流行性出血熱、恙蟲病、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾、霍亂、出血性腸炎(大腸桿菌0157H7)及它們的任意組合。
我們在查閱歷年來大量文獻的基礎上，並參考了國內外關於這7種傳染病檢測的最新進展，檢索並研究了7種病病原體的基因序列(包括不同亞型和突變型)，確定了分別要擴增的靶基因，用Clustal W軟體找出特定病原體靶基因序列的各亞型間共同的高度保守區和不同亞型的各自特異性序列，結合了Primer Primers5.0等專業用於PCR測序引物設計和評估的分析軟體，再應用NCBI的BLAST程序進行篩選，根據結合擴增要求和引物篩選要求，進行了PCR引物設計。
基因晶片中應用的探針為核酸分子探針，是已知的特定序列的核酸片斷，能與互補的核酸序列發生分子雜交，因此可以利用探針雜交技術來檢測樣品中特定基因地的特徵片斷和或測定未知基因的序列。針對病原微生物基因組的特徵性片斷、染色體DNA的序列多態性、基因變異的位點及特徵等，設計和選擇合適的核酸探針並製成晶片。通過與樣品中提取的核酸(DNA或RNA)雜交，一步檢測就可以獲得病原微生物種屬、分型、致病、毒力、相對數量甚至同源性、多態性、變異、表達等相關信息。
根據核酸分子探針的來源及其性質可以分為基因組DNA探針、cDNA探針，RNA探針、肽核酸探針和寡核苷酸探針等。寡核苷酸探針的優點是可以根據需要來隨心所欲地調整和合成相應的序列，避免了天然核酸探針中存在的高度重複序列所帶來的不利影響。寡核苷酸探針具有以下特點探針長度一般為10～50bp，並且由於序列的複雜性低，雜交所需的時間較短。寡核苷酸探針還可用於檢測個別鹼基的變異，用於單核苷酸多態性(SNP)分析。
我們採用了合成寡核苷酸探針的方法。探針選擇的正確與否，將會直接影響雜交結果的分析。選擇探針最基本的原則是應具有高度特異性，同時考慮Tm值、鹼基數目和製作的方便等因素。
探針設計的原則如下(1)高度的特異性和敏感性篩選出的探針應該位於特異性引物擴增序列中的高保守區(相對亞型而言)，以保證探針的特異性和敏感性；同時，篩選的探針應該與人基因組序列、其它細菌和微生物、相關動物的基因組序列、環境中常見植物基因序列儘可能同源性低，以避免假陽性結果；分型探針無交叉反應。尋找和篩選出高度特異性的探針，這是至關重要的。(2)7種病探針的Tm值儘可能一致因為在一張晶片上要同時進行多個探針的雜交反應，在一定的溫度下，此時各探針Tm值至關重要，如果Tm值不一致，差距過大，雜交後的螢光信號強弱會受到相當的影響。一般Tm值相差小於三度比較適宜。(3)各種探針有近似的鹼基長度晶片探針的長度，對檢測的敏感性和特異性有一定的影響。病原體檢測晶片的寡核苷酸探針鹼基長度多在15～60bp。各探針鹼基長度一致，在一定程度上可消除雜交後晶片掃描儀掃描焦距定位所帶來的差異。我們設計的探針鹼基數目在28nt左右。(4)篩選的探針儘可能避免二級結構探針應該最好沒有髮夾結構，自身二聚體、錯配等。否則容易形成錯誤的結果。(5)避免選取G、C富集區域的序列作探針(6)7種病的各探針的互補序列之間不形成二聚體和錯配等探針篩選的方法從Gene Bank調出所有這7種病病原體的基因序列，比較同一病原體的基因序列有無存在變異的情況。確定要擴增的靶基因片斷及引物後，根據上述探針設計的原則，用Primer Primers5.0等生物學軟體在7種病病原體基因的鹼基對齊圖上PCR擴增區域內尋找出所有可能的探針，結合Clustal W等同源性分析軟體找出特定病原體靶基因序列擴增區域內各亞型間共同的高度保守區和不同亞型的各自特異性序列，在特定病原體擴增片斷內的高度保守區，並且具有屬、種特異性結構的序列作為分型探針。登陸美國生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)主頁(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)，選擇核酸序列的BLAST，進行資料庫類似檢索(同時檢索GenBank+EMBL+DDBJ+PDB資料庫)，在核酸擴增區域內篩選的探針與已知的人基因組序列、其它常見細菌和微生物、相關動物的基因組序列、環境中常見植物基因序列儘可能同源性低，鹼基數28nt左右，Tm值平均近似69，G+C含量約為50％，根據Blast結果，再結合需求和經驗，手工對篩出的探針進行微調和修整。然後對這7種病病原體基因序列篩出和修改得到的全部探針，同時考慮其互補序列，用RNA Structure軟體進行分析，以排除不同探針互補序列間形成影響和幹擾雜交的二級結構。陽性內參照探針採用的是根據非洲植物基因序列的片斷略加改造而來的DNA序列。在後面實際的晶片雜交檢測中，根據總體的需要和檢測的結果，調整了部分使用的探針。
選擇載玻片為晶片的載體，玻片購自CEL公司或國產優質載玻片，用鉻酸洗液浸泡過夜，然後用雙蒸水清洗，再浸入25％的氨水中過夜，用雙蒸水清洗。晾乾後浸入含有氨丙基三甲氧基矽烷的95％乙醇(pH4.5)中20分鐘，再用95％乙醇超聲清洗，換蒸餾水超聲清洗，115℃烘乾。將已經矽烷化的玻片浸泡在5％的戊二醛溶液中50min，超聲10min，水洗兩次，晾乾備用。
將合成的探針溶於3×SSC溶液內，採用晶片點樣儀機點和人工手點兩種方式。條件摸索時用手工點樣，0.1-0.2μl/點。機點時在Cartesian PixSys5500點樣儀用Chipmaker Pin3點樣針，Pixsys 5500 Workstation點樣軟體編程。將7種病原體的14個探針、2個陰性對照探針和一個陽性內參探針設計形成一個點樣陣列，每個玻片點4個相同的點樣陣列。每個探針點4個點，在4個點的右側點一個陽性探針對照點(植物基因探針)。點樣完畢，霧化保溼2h後37℃水化1h，4℃保存備用。
為了封閉晶片上未與寡核苷酸結合的醛基，將晶片按下述步驟進行處理依次用洗液A、B、C衝洗後再用ddH2O洗2min。甩去水珠，將晶片放入封閉(還原)液內15min。再次用洗脫液和ddH2O衝洗，晶片自然乾燥後即可投入使用。
我們收集樣本，測試比較並優化了各種被檢樣本的處理方法，建立了快速抽提高質量的各種病原體目的DNA片段的標準操作程序。相同的樣本儘量採取相同的處理方法。對於7種主要傳染性疾病病原體，建立了擴增特徵基因的標準PCR擴增方法，均有較好的特異性。應用不對稱PCR製備Cy3螢光標記引物摻入模板。第一輪PCR按常規進行，然後將第一次PCR產物純化(TaKaRa DNA片段純化試劑盒)，以此為PCR的模板，採用以下兩種方法製備螢光靶序列(1)用P2引物進行不對稱PCR，dNTPs內加0.02mM Cy3-dUTP(Amersham Pharmacia公司)摻入；(2)用0.2μM Cy3-P2進行不對稱PCR；除PCR退火溫度改為45℃，其他與第一次PCR相同。
第二輪擴增的Cy3螢光標記產物在98℃變性5min，速置冰浴，取出7μl，與3μl雜交液(摻入陽性內參照植物基因探針)充分混合，取出點在探針陳列區域，蓋上大小合適的經矽化的蓋玻片，將晶片放入雜交盒(盒內有適當的2×SSC以保持溼度)，55℃雜交1小時。取出晶片，依次用預溫至55℃的洗液A、B、C衝洗後再用ddH2O洗，晾乾(以上過程均要求儘量避光)，然後在晶片掃描儀上進行螢光信號掃描及圖象分析(QuantArraysoftware version 3.0.0.0)。
實驗結果表明，製備的7種傳染病檢測晶片未見有非特異性的交叉反應，而且可以鑑定混合感染並對瘧疾、恙蟲病等進行分型。對多份樣品進行檢測，均顯示了較好的特異性和敏感性。當水中同時存在霍亂、大腸桿菌O157H7、鉤端螺旋體時，經過統一的樣本處理和多重PCR擴增，能夠用晶片同時偵檢出來。基因晶片檢測這7種傳染病的靈敏度是由製備模板的PCR靈敏度所限制的。實驗結果還表明，晶片檢測時的靈敏度要比常規PCR後瓊脂糖凝膠電泳的靈敏性略高，這可能是因為擴增的特異性條帶過於微弱，電泳後的結果不清楚甚至無法顯示時，少量的標記螢光的PCR產物也能和晶片上的特異性探針雜交並被生物晶片掃描儀檢測出來。
模擬檢測和現場初步應用的結果表明，建立的晶片檢測系統在7種病的檢測和鑑定分型方面，與傳統的經典檢測及酶聯免疫和儀器的檢測結果基本一致。和傳統的方法相比較，晶片的優越性體現明顯。本發明的優點(1)高特異性晶片檢測的特異性是經過雙重篩選的，與普通的PCR結合探針雜交檢測的特異性相同；(2)對樣品的高通量檢測和多樣品的平行檢測能同時檢測7種主要傳染病；(3)可以在檢出7種主要傳染病病原體的同時給予分型或鑑定毒株；(4)高靈敏度和可靠性檢測晶片是分子雜交技術和螢光標記技術相結合的新型分子診斷方法，並且在模板和探針雜交時，反應條件和反應體積完全一致，消除了實驗過程中人為的和其它誤差；(5)檢測時間短，耗樣量少，反應體積小，適合於重要傳染病防治的需要；(6)定量準確，重現性好，並可以根據實際需要設計和添加新的病原體探針；(7)為實現全自動化及快速檢測奠定基礎。
圖1是整個晶片製作和檢測過程。
圖2是間日瘧原蟲不同模板處理方法的PCR結果。
圖3是晶片探針點樣矩陣示意圖。
圖4是瘧原蟲的基因晶片檢測結果。4aP.v.陽性4bP.f.陽性4cP.v.和P.f.混合感染。箭頭所示陣列為陽性內參照植物基因，1～14為6種對照病原體基因探針。
圖5是PCR和基因晶片檢測的敏感性實驗。5aP.f.PCR敏感性試驗，M為mark(DL2000)，1～4的P.f.密度依次為1000蟲/μl、100蟲/μl、10蟲/μl和5蟲/μl；5b5蟲/μl的P.f.晶片檢測結果，1～14為6種對照病原體探針。
圖6是血吸蟲不同階段樣本處理後的PCR結果。MMarker(DL2000)、1-4依次為陽性釘螺、成蟲、尾蚴和蟲卵5陰性釘螺對照。
圖7是血吸蟲不同階段樣本的晶片檢測結果。3a、3b、7c、7d依次為釘螺、成蟲、尾蚴和蟲卵。
圖8是單個尾蚴DNA稀釋10倍晶片檢測結果。
圖9是恙蟲病東方體陽性檢測結果。9akarp株晶片掃描結果；9bGilliam株晶片掃描結果；9cKato株晶片掃描結果；9d稀釋後的karp株晶片掃描結果。
1.引物和探針的設計在充分查閱各類文獻的基礎上，根據間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲小亞單位核糖體核糖核酸(SSrRNA)，分析比較其它的人類瘧原蟲屬如三日瘧原蟲等和人SSrRNA相應序列，先用計算機軟體分析，再結合手工在NCBI BLAST上篩選特異性相對更好的序列。設計和篩選出的一對引物，可特異擴增人類瘧原蟲屬的SSrRNA序列。同樣方法，在這對引物相應擴增片段內設計出四條探針，設計的探針同時儘量要求有近似的退火溫度和鹼基長度，避免選取可能形成二級結構或自身二聚體的區域。其中兩條為間日瘧原蟲特異性探針，另外兩條為惡性瘧原蟲特異性探針。探針均為5』端加T臂和氨基化修飾。
引物15』-TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG-3』引物25』-CTACTCCTATTAATCGTAAC-3』間日瘧原蟲正鏈探針5』-TTAAGCAACGCTTCTAGCTTAATCCACA-3』負鏈探針5』-TAGCAAAATGCGCACAAAGTCGATACG-3』惡性瘧原蟲正鏈探針5』-GTAGTTGAATATTAAAGAATCCGATGTTTC-3』負鏈探針5』-ATGAACTCAATCATGACTACCCGTCTG-3』為了標記PCR產物，另外合成5』端標記Cy3的引物1和引物2。
2.樣本的處理根據文獻和本實驗室的摸索，試驗了幾種耗樣本(血)量少，快速簡便的高純度瘧原蟲DNA模板製備方法。
(1)Tritonx-100法取10～20μl血樣於1.5ml的Eppendorf管內，加400μlTritonx-100裂解液，混勻，靜置10min，12000r/min離心5min，棄上清，再加300μl 1×PCR buffer，混勻，靜置5min，同上離心，棄上清，加20μl ddH2O，沸水浴5min，離心片刻，上清即可作模板。
(2)快速煮沸法、全血PCR儀法、鹼裂解法、磷酸三鈉法等參照文獻進行。
2.3PCR擴增及螢光標記應用不對稱PCR製備Cy3螢光標記引物摻入模板。第一輪常規PCR按文獻進行，擴增結果見圖2。第二輪PCR反應體系見下表成分 濃度 加樣量 終濃度ddH2O -31.5μl -10×PCR buffer-5.0μl -MgCl2 25mmol/l 5.0μl 2.5mmol/ldNTP 2.5mmol/l4.0μl 0.2mmol/lCy3-P25poml/μl2.0μl 0.2poml/μlExTaq 5U/μl 0.5μl 2.5U每50μl第一輪擴增產物-2.0μl -反應條件為94℃，45s；50℃，40s；72℃，60s，共40個循環3.晶片製備
(1)晶片載體的醛基化將已經矽烷化的玻片浸泡在5％的戊二醛溶液中50min，超聲10min，水洗兩次，晾乾備用。
(2)點樣將合成的探針溶於3×SSC溶液內，採用晶片點樣儀機點和人工手點兩種方式。條件摸索時用手工點樣，0.1-0.2μl/點。機點時在Cartesian PixSys5500點樣儀用ChipmakerPin3點樣針，Pixsys 5500 Workstation點樣軟體編程。根據圖4的矩陣進行點樣，每個探針點4個點，在4個點的右側點一個陽性探針對照點(植物基因探針)。點樣的基因探針見下表。
EHFV HantProbe25』-NH2-TTTTTTTTTTACCAAGGAGGCTAACTGCTGCTGTAT(-)EHFV R22Probe1 5』-NH2-TTTTTTTTTTCATGATCGGGAGAGTGTCGCAGCTT(+)恙蟲病東方體OrientProbe5』-NH2-TTTTTTTTTTTTCAGCTAGTGCGATAGAATTGGGTGA(+)鉤端螺旋體LepProbe15-NH2-TTTTTTTTTTCATGAACTTTGGGGCCTTAAACGACG(-)間日瘧原蟲PvProbe25』-NH2-TTTTTTTTTTTAGCAAAATGCGCACAAAGTCGATACG(-)惡性瘧原蟲PfProbe25-NH2-TTTTTTTTTTATGAACTCAATCATGACTACCCGTCTG(-)血吸蟲SchiProbe15』-NH2-TTTTTTTTTTAGTCATCTCAACAGGTCAGCATATTG(+)霍亂弧菌外膜ompWprobe15』-NH2-TTTTTTTTTTTTGCCTCGGTAGTACCTAATGACAGTA(+)霍亂弧菌外膜ompWprobe2 5』-NH2-TTTTTTTTTTAGTTTTGAAGTCCTCGCTCGTACGCCA(+)霍亂弧菌毒素CtxProbe25』-NH2-TTTTTTTTTTTATATTTGGGAGTATGGAATCCCACCT(-)O157 probe15』-NH2-TTTTTTTTTTGGTGGAATGGTTGTCACGAATGACAAA(+)H7 Probe15』-NH2-TTTTTTTTTTGACGATGCAGGCAACTTGACGACTAA(+)Vt2 Probe25』-NH2-TTTTTTTTTTAGATGGTCAAAACGCGCCTGATAGAC(-)Vt1 Probe5』-NH2-TTTTTTTTTTGGATGACGTAACCATTAAAACTAATGCC(+)Control(+)5』-NH2-TTTTTTTTTTCAGATGTTAGTGTCGATCTCTATGTAAC點樣完畢，霧化保溼2h後37℃水化1h，4℃保存備用。
(3)晶片的封閉為了封閉晶片上未與寡核苷酸結合的醛基，將晶片按下述步驟進行處理依次用洗液A、B、C衝洗後再用ddH2O洗2min。甩去水珠，將晶片放入封閉(還原)液內15min。再次用洗脫液和ddH2O衝洗，晶片自然乾燥後即可投入使用。
4.雜交檢測第二輪擴增的Cy3螢光標記產物在98℃變性5min，速置冰浴，取出7μl，與3μl雜交液(摻入陽性內參照植物基因探針)充分混合，取出點在探針陳列區域，蓋上大小合適的經矽化的蓋玻片，將晶片放入雜交盒(盒內有適當的2×SSC以保持溼度)，55℃雜交1小時。取出晶片，依次用預溫至55℃的洗液A、B、C衝洗後再用ddH2O洗，晾乾(以上過程均要求儘量避光)，然後在晶片掃描儀上進行螢光信號掃描及圖象分析(QuantArraysoftware version 3.0.0.0)。整個晶片製作和檢測過程見圖1。
5.特異性和敏感性試驗對間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲感染以及混合感染的晶片檢測結果見圖4。結果顯示，本文製備的晶片能特異地偵檢間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲和混合感染，對照的6種病原體標本和隨機選取的健康人血樣均未發生非特異性結合，而且兩型瘧原蟲間無交叉反應。用健康人全血對適當密度的間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲血樣分別進行梯度稀釋，Tritonx-100法快速製備DNA模板後PCR平行擴增後進行Agarose電泳，凝膠成像系統下可見陽性條帶的間日瘧原蟲最大稀釋度為10蟲/μl，惡性瘧原蟲也為10蟲/μl。用上述標本製備模板，進行晶片的模擬檢測，發現間日瘧原蟲密度在10蟲/μl時，惡性瘧原蟲在5蟲/μl可檢測出來。見圖5。實施例二.日本血吸蟲基因晶片的製備及檢測研究血吸蟲病是一種人獸共患的寄生蟲病，在全世界範圍內廣泛分布，我國某些地區現流行仍很嚴重。在防治過程中，人群再感染和控制地區血吸蟲病的再度流行，一直是防治實踐中的難題。由於釘螺是日本血吸蟲的唯一中間宿主，釘螺的擴散和重新分布是造成血吸蟲病再度流行的基本因素。因此，高效、正確地監測血吸蟲和釘螺在血吸蟲病防治工作中顯得極為重要。基因晶片技術，適應於大規模、高通量的檢測要求，尤其適用於血吸蟲病流行區現場的檢測及監測，具有廣泛的應用前景。本研究初步建立了檢測日本血吸蟲尾蚴、陽性釘螺及動物模型標本中血吸蟲的基因晶片。
1.晶片的製備選用經矽烷化處理的玻片為晶片載體，用5％戊二醛浸泡50min，dd H2O超聲清洗2次，置乾燥處備用。點樣採用Cartesian Pix Sys 7500點樣儀，Chipmaker Pin40點樣針及Pixsys5500 Workstation點樣軟體編程，將探針(TakaRa公司合成)溶於3×SSC溶液內，終濃度為100μmol/L，每個點直徑0.15mm。點樣後霧化保溫2h後37℃水浴1h。室溫依次用洗脫液A(1×SSC，0.2％SDS)、B(0.5×SSC，0.2％SDS)、C(0.1×SSC)和dd H2O各衝洗5min，甩去水珠後，將晶片放入封閉液30min，再次依次用洗脫液A、B、C和ddH2O衝洗，超淨臺內吹乾後待用。
2.DNA模板製備蟲卵和尾蚴在顯微鏡下計數後，分裝於Eppendrof管中，6000rpm離心5min，棄上清加入100μl Triton X-100裂解液，60℃水浴2h，100℃隔水加熱10min後，10000rpm離心5min，取上清即為模板DNA。成蟲或陽性釘螺的DNA採用經典的酚-氯仿抽提法，即成蟲或釘螺壓碎後置適量生理鹽水，加蛋白酶K(終濃度為200μg/ml)、Triton X-100，60℃水浴3h後加氯仿、異戊醇抽提一次，然後用無水乙醇沉澱，經12000rpm離心，80％乙醇洗滌一次，棄上清，沉澱溶於TE或dd H2O中，即為模板DNA。
3.PCR擴增及螢光標記根據日本血吸蟲5D基因的DNA序列，設計併合成了引物P15』TCA CAC ATT CAAACA CAG TAC 3』，引物P25』AAG TAC CAC CAC CAT AAT GTC 3』(TaKaRa公司合成)，同時在這對引物相應擴增片段內設計出1個負鏈探針5』CCA GTC ATC TCA ACA CGT CAGCAT ATT GAT3』，經BLAST基因檢索，與曼氏、埃及血吸蟲及GenBank內的其他所有基因均無顯著同源性。
第一輪常規PCR反應製備蟲卵、尾蚴、成蟲、陽性釘螺雙鏈DNA模板反應體積50μl，包括10×Buffer 5μl、25mmol/L MgCl2 4μl、2.5mmol/LdNTP2μl、5U/μl Taq酶0.3μl及模板5μl。反應程序為94℃變性4min，按94℃ 30 Sec、57℃ 45 Sec、72℃ 45 Sec擴增35個循環，然後72℃延伸7min。PCR產物經純化(TakaRa DNA片段純化試劑盒)作為第二輪PCR反應模板，並經ABI377測序儀測序，證實為5D基因序列後，採用Cy3螢光標記引物摻入模板進行不對稱PCR擴增，即加10mmol/L Cy3-dUTP(AmershamPharmacia公司合成)1μl摻入，退火溫度降為50℃，PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
4.雜交及晶片檢測第二輪擴增的Cy3螢光標記產物於98℃變性5min後迅速冰浴。取螢光靶序列7μl，與3μl雜交液(摻入陽性內參照植物基因探針)混勻後點入探針陣列區域，蓋上矽化的蓋玻片，置溼雜交盒(內有2×SSC)避光50℃水浴1h。取出後依次用洗液A、B、C及ddH2O洗滌，吹乾後用ScanArray3000掃描儀檢測。整個晶片製作和檢測過程見圖1。
5.檢測結果陽性釘螺、尾蚴、成蟲、蟲卵抽提的DNA模板，常規擴增經純化後進行1％的瓊脂糖電泳檢測，結果顯示，除對照陰性釘螺未見特異性條帶外，四種樣本均擴增出大小為262bp的特異性條帶(見圖6)。通過雜交後晶片檢測，日本血吸蟲探針處均出現較強的陽性信號(見圖7)；對照6種病原體標本相應的探針處皆無雜交陽性信號。日本血吸蟲尾蚴經梯度稀釋後，單個尾蚴DNA經稀釋10倍後在晶片上仍可檢測到較弱陽性信號(見圖8)。
實施例三.基因晶片技術檢測恙蟲病東方體DNA的方法建立恙蟲病是由恙蟲病東方體引起的蟲媒自然疫源性疾病，近年來，我國的疫區有不斷擴大的趨勢。由於該病易引起誤診，導致治療不當，甚至發生死亡。因此，快速、準確的診斷極為重要。我們選用恙蟲病東方體三個標準株56kD蛋白基因既保守又特異區序列，合成了寡核苷酸探針，初步建立了用晶片技術檢測恙蟲病東方體特異性DNA的診斷方法1.引物和探針的設計與合成根據恙蟲病東方體標準株Karp Gilliam和Kato的主要表面抗原56kD蛋白的序列[2，3]，結合計算機軟體分析及NCBI BLAST上篩選設計了群特異性引物及探針。
引物15′-tta att gct agt gca atg tc-3′分別位於Gilliam、Karp和Kato株56kD蛋白571～590，15～34bp和87～106位點。引物25′-ctt ata ggc att atagta gg-3′分別位於Gilliam、Karp和Kato株56kD蛋白967～87，406～431，468～487位點。負鏈探針ttc agc tag tgc a(g)at aga att g gg tga，分別位於Gilliam、Karp和Kato株的606～632，44～70，125～151位點，5′端加臂和氨基化修飾。為標記PCR產物，另合成5′端標記Cy3的引物2。
2.恙蟲病東方體標準株DNA的提取取Karp、Kato和Gilliam株組織細胞培養物2μl至1.5ml Eppendorf管中，加ddH2O至0.5ml，加入10％SDS 50μl，6.5mg/ml蛋白酶K 20μl，62mg/ml溶菌酶20μl，55℃水浴2h，按苯酚-酚氯仿-酚氯仿異戊醇常規法抽提DNA，最後一次抽提取水相，加1/10體積的3mol/L NaAc，混勻後加2倍體積-20℃預冷無水乙醇，靜置10min，10000rpm離心10min，70％乙醇洗滌，溶於ddH2O或1×TE中備用。
3.PCR擴增及特異性鑑定PCR反應體系為50ul，包括標準株模板DNA 2μl，25mmol/LMgCl2 5μl，2.5mmol/LdNTP4μl，10×反應緩衝液5μl，50pmol引物P1、P2各1μl，5u/μl Taq聚合酶0.5μl。反應條件為94℃變性5min，94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 1min，35個循環後，於72℃延伸7min，再至4℃。為判斷所設計的東方體群特異性引物的特異性，用所設計的引物，按上述反應條件，對黑龍江立克次體株、立氏立克次體R株、普氏立克次體、加拿大立克次體、斑點熱立克次體、Q熱立克次體六株立克次體進行PCR擴增。用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。
4.螢光標記PCR產物用Cy3螢光標記的引物進行不對稱PCR反應製備螢光標記的PCR產物，反應體系如下上述PCR純化產物1μl，25mmol/L MgCl2 5μl，2.5mmol/LdNTP 4μl，10×反應緩衝液5μl，10pmol/L Cy3-標記P2 2μl，5U/μl Taq聚合酶0.5μl，反應條件同上。2.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的螢光標記產物可用於雜交試驗。
5.晶片製備5.1晶片載體的醛基化將已經矽烷化的玻片浸泡在5％的醛溶液中50min，超聲10min，水洗兩次，晾乾備用。
5.2點樣將合成的探針(六種病原體共16種探針分別溶於3×SSC溶液內，採用晶片點樣儀機點和人工手點兩種方式。條件摸索用手工點樣，0.1-0.2μl/點，機點用Chipmaker Pin40點樣針，分別把不同探針溶液逐點分配在玻璃表面的不同位點上，通過化學的共價結合使之固定於相應位點，每個探針點樣4點，在每個探針點樣的一端均設有一個植物陽性內參探針。點樣完畢，霧化保溫2h後37℃水浴1h，室溫放置。
5.3晶片的封閉為了封閉晶片上未與寡核苷酸結合的醛基，將晶片按下述步驟進行處理依次用洗液A、B、C衝洗後再用ddH2O洗2min，甩去水珠，將晶片放入封閉(還原)液內15min。再次用洗脫液和ddH2O衝洗，晶片自然乾燥後即可用於雜交。
6.雜交和檢測Cy3螢光標記PCR產物在98℃變性5min，速置冰浴，取出7μl約200ng DNA，與3μl雜交液(摻入Cy3標記的陽性內參照植物基因探針)充分混合，取出點在探針陣列區域，蓋上大小合適的經矽化的蓋玻片，注意避免氣泡，將晶片放入雜交盒(盒內有適當的2×SSC以保持溼度)，50℃雜交1h。取出晶片，依次用預溫至55℃的洗液A、B、C衝洗後再用ddH2O洗，晾乾後用晶片掃描儀讀片。整個晶片製作和檢測過程見圖1。
7.螢光數據的獲取和定量分析雜交後的玻璃片用Scan Array Lite3000，掃描，5mm分辯率。每個點的螢光強度用Quant Array軟體分析，螢光信號強度與背景信號強度統計學上顯著性差異(P＜0.01)為陽性點。陽性檢測結果見圖9。
權利要求
1.一種檢測多種傳染病的檢測型基因晶片，其特徵在於晶片包括(1)多種傳染病的多種檢測寡核苷酸探針和質量控制寡核苷酸探針；(2)寡核苷酸探針通過手臂分子固化在載體材料上形成的探針陣列；所謂的多種傳染病的檢測型基因晶片是指檢測流行性出血熱、恙蟲病、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾、霍亂、出血性腸炎(大腸桿菌0157H7)七種病的寡核苷酸陣列；所謂的寡核苷酸探針是指能與目的基因雜交的多聚核苷酸，長度在十到五十個鹼基；所謂的檢測寡核苷酸探針是指化學合成的多種重要傳染病病原體的基因保守區、毒力因子序列、基因型及亞型的互補的寡聚核苷酸，毒力因子序列探針包括了病原體致病所必須的多種基因序列的探針，基因型及亞型決定區的探針包括多種基因型和和多種亞型探針；所謂的質量控制探針至少包括二種探針，即陽性對照，陰性對照；陰性對照用於檢測雜交信號錯誤或汙染，陽性對照用於檢測是否正常雜交和準確定位；所謂的手臂分子指具有雙活性基團的長鏈有機化合物；所謂的寡核苷酸探針固定為寡聚核苷酸的末端有一特定基團，固化在載體材料基質表面時，與表面修飾的手臂分子的末端基團形成共價鍵。
2.根據權利要求1所述的一種檢測多種傳染病的檢測型基因晶片，其特徵在於流行性出血熱、恙蟲病、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾、霍亂、出血性腸炎(大腸桿菌0157H7)七種病每種病原體靶基因選擇有1-4個毒力序列探針或亞型特異性探針，並且根據需要添加其它突變探針和其它相關病原體的探針，探針包括了寡核苷酸探針和肽核酸探針。
3.根據權利要求1或2所述的一種檢測多種傳染病的檢測型基因晶片，其特徵在於配備有多組對多種傳染病病原體靶基因進行診斷、檢測、分型和流行病學調查的高特異性的擴增引物，其設計原則為每一個引物必須在對應病原體靶基因的高度特異性部位，每對引物的擴增區域為病原體靶基因特徵序列或毒力必須序列，儘可能包括分型所需的亞型特異性序列；引物包括了針對晶片檢測所需的RT-PCR、多重PCR、常規PCR、不對稱PCR等的特異性引物。
4.根據權利要求1或2所述的一種檢測多種傳染病的檢測型基因晶片，其特徵在於固相載體材料包括多種方法處理的玻片、金屬片、矽片、陶瓷片、塑料片、硝酸纖維膜、尼龍膜和其它高分子聚合物製成的膜及片等。
5.根據權利要求1或2所述的一種檢測多種傳染病的檢測型基因晶片，其特徵在於每一對特異性引物能夠擴增出GeneBank中所有同種病原體的基因片斷。
6.根據權利要求1或2所述的一種檢測多種傳染病的檢測型基因晶片，其特徵在於固相載體表面以具有雙活性基團的長鏈有機化合物進行修飾，常用的具有雙活性基團的長鏈有機化合物試劑有戊二醛、三羥甲基氨基矽烷(APTES)、N，N-二乙氧基氨基丙基三乙氧基矽烷、多聚賴氨酸，可採用其中的一種或其中的兩種的組合。
7.根據權利要求1或2所述的一種檢測多種傳染病的檢測型基因晶片，其特徵在於可引物標記螢光素Cy3、螢光素Cy5、生物素等，也可在基因擴增過程中加入螢光素Cy3、螢光素Cy5、生物素等標記的dUTP或dCTP。
8.根據權利要求1或2所述的一種檢測多種傳染病的檢測型基因晶片，在流行性出血熱、恙蟲病、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾、霍亂、出血性腸炎(大腸桿菌0157H7)的檢測、分型、診斷、傳染病監測、流行病學調查，查明傳染病病原體種類及鑑定中的應用。
9.根據權利要求1或8所述的一種檢測多種傳染病的檢測型基因晶片，其特徵在於用於一種或多種傳染病病原體的檢測，包括流行性出血熱、恙蟲病、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾、霍亂、出血性腸炎(大腸桿菌0157H7)及它們的任意組合。
全文摘要
本發明一種檢測多種傳染病的檢測型基因晶片及應用涉及的技術領域是醫學檢驗和基因晶片技術。是一種用於傳染病檢測的基因晶片，對流行性出血熱、恙蟲病、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾、霍亂、O157H7引起的出血性腸炎等7種主要傳染病進行檢測、分型或鑑定毒株。分別從流行性出血熱病毒的S基因、東方立克次體的56KD蛋白基因、鉤端螺旋體的23SRNA基因、血吸蟲的5D抗原基因、瘧原蟲的SSrRNA基因、大腸桿菌O157H7的O157抗原基因、H7抗原基因及毒素基因、霍亂孤菌的外膜OWP蛋白基因及毒素基因內選擇特異性的基因探針和PCR引物。其特徵在於晶片包括(1)多種傳染病的多種檢測寡核苷酸探針和質量控制寡核苷酸探針；(2)寡核苷酸探針通過手臂分子固化在載體材料上形成的探針陣列。
文檔編號C12Q1/68GK1450171SQ0311342
公開日2003年10月22日 申請日期2003年5月9日 優先權日2003年5月9日
發明者陶開華, 李越希, 張錦海 申請人:陶開華, 李越希