一種提高人種間核移植胚胎核質相容性及發育率的方法

2023-06-09 17:13:06

專利名稱：：一種提高人種間核移植胚胎核質相容性及發育率的方法
技術領域：
：本發明涉及胚胎工程與發育生物學領域，更具體地，涉及一種提高人種間核移植胚胎核質相容性及發育率的方法。
背景技術：
：核移植(Nucleartransfer,NT)是研究核質互作關係中諸多重要問題的最有效方法。應用不同分化程度的細胞核移入去核卵母細胞的方法，已經在兩棲類動物獲得發育完全的個體。在最近的二十年期間，核移植方法在哺乳動物中發展神速，並已開始應用於生產。大量結果表明，在同種動物之間，把中II期卵母細胞/受精卵作為受體細胞(供質細胞)，把不同分化程度的細胞作為供核細胞，兩者所組成的重構胚在移入寄母生殖道後，在牛、羊、豬、兔、猴、小鼠等多種動物中均已獲得相應的核移植後代。將患者體細胞作為供核體移入去核的卵中，以實現核的重編程並發育為囊胚，取囊胚內細胞團細胞用於培養並獲得幹細胞，此類幹細胞簡稱為核移植胚胎幹細胞(nucleartransferES,ntES)。ntES細胞可應用於臨床移植治療，這就是所謂的治療性克隆(Therapeuticcloning，TC)。由於這種來源的幹細胞染色體源於患者，植回患者體後在理論上不會引起免疫排斥。這是在體細胞核移植技術和胚胎幹細胞製備技術取得重大進展的基礎上興起的新技術，有望解決治療過程中由異體移植引發的免疫排斥難題，並為建立個體化的ntES細胞庫、解決供體ES細胞來源不足等問題，使之能廣泛應用於臨床奠定基礎。目前，在小鼠和牛上，已經獲得來自核移植囊胚的ES細胞[1]或ES樣細胞[2]，而且這些ES細胞與來自受精囊胚的ES細胞的多能性、基因表達譜以及甲基化狀態等沒有明顯的區別[3]，提示人的核移植ES細胞也可以應用於臨床治療。然而，因人卵母細胞的供應量有限等多種原因，一種替代方法是使用異種的卵母細胞。以源自兩種不同物種的卵母細胞胞質體和核供體的核轉移，被定義為種間核移植(interspeciessomaticcellnucleartransfer,iSCNT)。iSCNT最重要的予頁其月應用價值也許是它能方便地重編程人的體細胞但不必使用人卵母細胞[4]。其他一些替代取代人卵母細胞的策略，包括所謂的卵共有制(eggsharing)和卵捐贈制(eggdonation),但未能被廣泛實施並用於研究和治療開發。另一種替代策略是自人ESCs誘導衍生出具人卵母細胞潛能的卵[5]，但迄今未能實現。因此，越來越多的人將注意力轉向iSCNT，認為它是一種可行的戰略，能滿足ESC研究所需的卵母細胞用量。最近，英國政府允許在iSCNT中使用人軀體細胞核作供核體，非人的卵母細胞作受體，以便能徹底探索iSCNT的潛在應用價值。然而，種間核移植胚胎也存在一些問題，其中包括發育率低及囊胚內細胞多能性不足等。導致這些問題的影響因素眾多，其中可能包括供核細胞與異種卵胞質之間的不相容性致使種間核移植胚胎發育率極低，以及異種間胚胎早期發育事件的差異性使異種卵母細胞不能正確調控人種間核移植的早期發育等[6]。另外，供核細胞的發育狀態[7』8』9]、分化狀態[1°』"』12]、表觀遺傳狀態[13]影響核移植重構胚胎的發育。細胞長期在體外的環境中傳代培養，體外環境會影響供核細胞的發育狀態、分化狀態、表觀遺傳狀態，使細胞的遺傳背景改變或異常[14』15』16]。這種體外長期傳代培養的細胞用作供核細胞，導致重構的胚胎發育率或正常發育率低下。因此，本領域迫切需要開發新的提高人種間核移植胚胎核質相容性和/或發育率的方法。
發明內容本發明的目的就是提供一種提高人種間核移植胚胎核質相容性及發育率的方法。在本發明的第一方面，提供了一種提高人種間核移植胚胎的早期發育率的方法，包括步驟(a)將原代培養獲得的人成纖維細胞用作供核細胞，將供核細胞的細胞核移入去除了細胞核的非人哺乳動物中II期卵母細胞的卵周隙內，電刺激促進融合，從而形成重構卵；(b)將來自於人卵的胞質移入步驟(a)的重構卵；(C)對步驟(b)的重構卵進行電刺激，以促進人卵胞質與重構卵的融合，從而形成由人體細胞的細胞核、非人哺乳動物的去核卵胞質、和人卵胞質三種成分組成的重構卵。在另一優選例中，所述的成纖維細胞是流產胎兒皮膚組織或病人或健康個體包皮組織原代培養獲得的成纖維細胞。在另一優選例中，所述方法還包括步驟(d)對步驟(C)獲得的重構卵進行化學激活。在另一優選例中，所述的非人哺乳動物選自下組牛、羊、豬、狗、貓、兔、猴、小鼠。在另一優選例中，在步驟(c)中是以下條件中0.3mmol/L甘露醇、0.05mmol/LCaCl2、0.lmmol/LMgSO4和5%BSA、600_610V/cm，單脈衝持續時間為80μs。在本發明的第二方面，提供了一種重構卵，所述的重構卵由人體細胞的細胞核、非人哺乳動物的去核卵胞質、和人卵胞質三種成分組成。在另一優選例中，所述的重構卵是用本發明第一方面中所述的方法製備的。在本發明的第三方面，提供了一種對人種間核移植的重構卵進行處理的方法，其中，所述的重構卵是將人的供核細胞的細胞核移入去除了細胞核的非人哺乳動物中II期卵母細胞而形成的重構卵，該方法包括步驟將來自於人卵的胞質移入所述的重構卵中。在另一優選例中，所述的移入步驟是將人卵的胞質顯微注入卵母細胞的卵周隙內。在本發明的第三方面，提供了本發明第二方面中所述重構卵的用途，它被用於製備用於治療目的的核移植胚胎幹細胞。應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再--累述。圖1顯示了本發明方法的技術路線圖。圖2顯示了本發明一個實例中人體細胞-山羊卵胞質種間核移植胚胎的製備過程。各圖如下上排左供核細胞；上排中成熟的山羊卵母細胞；上排右去核；下排左核已去除；下排中準備移核；下排右移核完備。圖3顯示了將人卵胞質移入重構卵的過程。圖中，左脫掉透明帶的人卵胞質及切割後的卵胞質體；右卵胞質體被導入由人體細胞的細胞核-去核的山羊卵構成的重構卵中。圖4顯示了人卵胞質補加與未補加的人種間移植胚胎發育的囊胚。圖中，左來自人胞質補加組的人種間核移植胚胎發育的囊胚，中未補加人胞質的人種間核移植胚胎發育的囊胚，右人體外受精發育而來的囊胚。圖5顯示了本發明人種間核移植囊胚的染色體核型分析圖。具體實施例方式本發明人經過深入而廣泛的研究，首次發現對於用常規方法製備的人種間核移植重構卵後，如果將人卵的部分胞質移入該重構卵，融合後形成由三種成分(人體細胞、動物的去核卵胞質、人卵胞質)組成的重構卵，可以顯著改善了核質之間的相容性，從而大幅度提高了人異種間核移植胚胎的囊胚發育率，為製備人體細胞核移植幹細胞等研究提供了大量的研究材料。在此基礎上完成了本發明。簡而言之，本發明優選方法包括步驟是將流產胎兒皮膚組織或病人或健康個體的包皮組織原代培養獲得的成纖維細胞用作供核細胞，移入去除遺傳物質的非人哺乳動物動物中II期卵母細胞的卵周隙內，電刺激促進融合形成重構卵後，再將人卵的部分胞質移入重構卵，再次電刺激促進人卵胞質與重構卵的融合，形成由三種成分(人體細胞的細胞核、非人哺乳動物的去核卵胞質、人卵胞質)組成的重構卵，化學激活後形成重構胚胎，將重構胚胎經瓊脂糖包理後移入臨時寄母(山羊)輸卵管內或在體外培養，獲得大幅提高的核移植胚胎囊胚發育率。本發明的核心步驟是對重構卵的後處理，即將來自於人卵的胞質移入重構卵；再次進行進行電刺激，以促進人卵胞質與重構卵的融合，從而形成由人體細胞的細胞核、非人哺乳動物的去核卵胞質、和人卵胞質三種成分組成的重構卵。除了對重構卵的後處理之外，製備重構卵以及人種間核移植胚胎的其他技術與現有技術沒有區別。因此，本領域常規的各種製備重構卵以及人種間核移植胚胎的技術都可用於本發明。為了人們更清楚地了解本發明，以下對包括製備供核細胞、卵母細胞、核轉移等相關技術也作一描述。一種優選的技術路線可參見圖1。一、供質(提供卵母細胞)母畜超數排卵技術超數排卵是指採用製劑誘導動物一次排出正常排卵數若干倍的方法。通過激素[孕馬血清促性激素(PMSG)；促卵泡激素(FSH)、促卵泡激素釋放因子(LRH)]處理，使母畜呈非季節性排卵，並且在一次排卵中，能排出較多的卵子。一種具體方法是每隻動物肌注氯前列烯醇(PG，上海計劃生育研究所)0.06-0.Img/次，間隔10-14天後注射第二次，在第二次注射PG10-14天後開始超排，即首先肌肉注射FSH(寧波激素製品廠)，用量按7-12IU/Kg計(不同種動物用量不盡相同)，分6次，2次/日，每次間隔8-12小時。間隔M小時發情時5注射LRH(上海東風製藥廠)，25ug/次，注射!^冊後觀-30小時回收卵母細胞。二、臨時寄母(供核移植胚胎體內培養用)的激素處理(與NT胚胎發育同步)為與提供卵母細胞胞質的供質母羊同步，臨時寄母間隔10-14天分兩次肌肉注射PG，在供質母羊超排注射PG前12小時，受體也同時注射PG，受體注射LRH的時間及劑量同供體。三、人體細胞的培養與供核細胞的處理將人包皮組織或流產胎兒皮膚剪成Icm2組織塊，或用胰酶消化成單個細胞，用DMEM培養液(加10-20%胎牛血清，FCS)培養，傳代，遺傳分析。待細胞長滿培養皿後，冷凍保存於-80°C冰箱中，每支凍存管含1000-5000個細胞。長期凍存可移至液氮中保存。在核移植試驗前，將該細胞在37°C水浴中解凍，然後去除冷凍液，加入含10-20%的FCS的DMEM液，培養2-5天後，用透明質酸酶消化成懸浮的細胞即用於核移植試驗的供核細胞。四、卵母細胞的收集提供卵母細胞的山羊在注射LRH後沈-30小時，進行卵母細胞的收集。收集是通過手術的方法，在母畜的腹部作一切口，將母畜的輸卵管與卵巢暴露在體外，用衝卵液(F10+5%FCS)從輸卵管中衝出卵母細胞，將收集的卵母細胞培養在M16液中。五、卵母細胞去核、移核與融合將卵母細胞移入含CB的M2手術液中20min鍾後，將供核細胞與卵母細胞一同置於玻片上，在顯微鏡下，用持卵針固定卵母細胞，卵母細胞排出的極體處於鐘錶3點位，去核針正對著或稍偏離極體去除極體與一部分胞質。去核之後立即將1個供核細胞移入去核卵周隙內，重複下一枚卵的操作，直至所卵母細胞操作完成後，將移入供核細胞的卵母細胞置於M16液培養30min。將移入供核細胞的卵母細胞在激活液(0.3M甘露醇，％ig/ml的胎牛血清，0.ImMMgSO4)中，在140-160V/mm，80ys電刺激三次，在Μ16液中培養30min，觀察是否融合。未融合的卵再融合一次。融合的NT胚胎在M16液中培養4-6小時。六、人卵胞質體的製備收集體外受精M小時後仍未分裂的卵(廢棄的卵)，37°C保溫狀態運送至體細胞核移植操作實驗室。PBS洗滌後，取一部分卵，螢光顯微鏡下觀察核的狀態和位置。用蛋白酶消化脫去人卵透明帶，然後將脫去透明帶的卵放置在顯微操作儀上，用顯微注射針將脫去透明帶的卵分割成數個卵胞質體，置螢光顯微鏡下觀察，挑出包含核(染色體)的胞質體，剩下的不含核的胞質體即可用於胞質補加。七、人卵胞質體-人體細胞-山羊去核卵三部分組成的核移植胚胎製備將步驟五中的核移植融合胚與人卵胞質體置於同一個操作微滴中，在顯微操作儀上同樣用核移植注射針將人卵胞質體經原先的核移植切口送入卵周隙下，緊貼山羊的胞質。所有的核移植胚胎均補加完畢後，將補加後的胚胎放入培養箱恢復15分鐘，再次採用電刺激促使人卵胞質體與山羊卵胞質融合，融合液為含0.3mmol/L甘露醇、0.05mmol/LCaCl2,0.lmmol/LMgSO4和5%BSA的M16液；融合條件為DC、600_610V/cm，單脈衝持續時間為80μs，刺激一次。刺激後的卵置於Μ16培養液中培養20-30min，觀察是否融合。該融合卵即為重構卵。八、重構卵的激活6用化學方法激舌(10μM離子霄素，Ionomycin5分中+2μM6-dimethylaminopurina(6-DMAP)4-6小時)，激活後移入M16培養液中體外培養或經瓊脂糖包理後移入臨時寄母輸卵管內培養。九、重構胚體內培養應用手術的方法，將激活後的NT胚胎用1%的低熔點瓊脂糖包理後，吸入移卵管內，從輸卵管喇叭口處插入將卵移進輸卵管內，隨後在輸卵管與子宮連接部用縫線結紮。在體內培養7天後，剪下輸卵管，用培養液衝出胚胎，觀察胚胎發育情況。本發明的主要優點在於1)顯著提高了人種間核移植胚胎的早期發育率；2)利用廢棄的人卵胞質，解決了卵母細胞供應量不足的問題。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1人卵胞質補加對人體細胞核-去核山羊卵重構胚胎發育的影響1材料與方法1.1.2試劑均為胚胎級試劑，除另有說明外均為Sigma產品。1.2方法1.2.1供質卵母細胞採集奶山羊應用FSH按常規進行超數排卵，在注射LRH後四-30小時，採用手術回收卵母細胞，用含5%小牛血清(FCS，Gibco)的F-IO(Gibco)培養液衝洗輸卵管。收集卵母細胞，透明質酸酶去除附著的顆粒細胞。收集的卵母細胞置於M16液中，37.5°C，5%的二氧化碳培養箱中培養。1.2.2供核細胞將人包皮組織或流產胎兒皮膚剪成Icm2組織塊，或用胰酶消化成單個細胞，用DMEM培養液(加10-20%胎牛血清，FCS)培養，傳代，遺傳分析。待細胞長滿培養皿後，冷凍保存於-80°C冰箱中，每支凍存管含1000-5000個細胞。長期凍存可移至液氮中保存。在核移植試驗前，將該細胞在37°C水浴中解凍，然後去除冷凍液，加入含10-20%FCS的DMEM液，培養2-5天後，用透明質酸酶消化成懸浮的細胞即用於核移植試驗的供核細胞。1.2.3核移植(1)卵母細胞的準備成熟20-24h的卵母細胞，在ang/ml的透明質酸酶溶液中放置5min，用口叼吸管(管徑150mm)輕輕吹打去除顆粒細胞。(2)操作液滴的製備在矽化玻片(經高壓滅菌)的中央滴700微升操作液，並移入去除顆粒細胞的卵母細胞3040枚。在此液滴的右上方用吸卵管加5微升細胞懸浮液。(3)去核在顯微鏡下(150X)，用持卵針固定卵母細胞，並把第一極體調整到「3」點鐘位，將去核針對準第一極體刺入透明帶，在卵周隙中把第一極體連同極體下方的胞質(又稱中期板，約1/3)—並吸入去核針。隨即退出去核針，把第一極體連同中期板一併去除。(4)移核在操作液中將去核針中第一極體和中期板排出後立即從細胞懸浮液滴中選擇一個優良的細胞從去核時所作切口處插入，把細胞移入卵周隙並和卵質膜緊貼。(5)移核卵漂洗在一組卵去核和移核完成之後在體視鏡下把移核卵從操作液中吸出，經平衡後的M199基質中漂洗69次，洗淨操作液。(6)移核卵的暫短培養洗淨的移核卵在M199培養液中培養30min，讓受損卵質膜修復。1.2.4融合經M16培養液洗滌3次並於M16液中37°C培養30min後，進行電融合。融合液為含0.3mmol/L甘露醇、0.05mmol/LCaCl2、0.lmmol/LMgSO4和5%BSA的M16液；融合條件為DC、600-610V/cm，單脈衝持續時間為80μs，連續刺激三次。刺激後的卵置M16培養液中培養20-30min，觀察是否融合。融合卵視為重構卵。1.2.5人卵胞質體的製備收集體外受精M小時後仍未分裂的卵(廢棄卵)，37°C保溫狀態運送至體細胞核移植操作實驗室。PBS洗滌後，取一部分卵螢光顯微鏡下觀察核的狀態和位置。用蛋白酶消化脫去人卵透明帶，然後將脫去透明帶的卵放置在顯微操作儀上，用顯微注射針將脫去透明帶的卵分割成數個卵胞質體，置螢光顯微鏡下觀察，挑出包含核(染色體)的胞質體，剩下的不含核的胞質體即可用於胞質補加。1.2.6人卵胞質體-人體細胞-山羊去核卵三部分組成的核移植胚胎製備將核移植融合卵與人卵胞質體置於同一個操作微滴中，在顯微操作儀上同樣用核移植注射針將人卵胞質體經原先的核移植切口送入卵周隙下，緊貼山羊的胞質。所有的核移植胚胎均補加完畢後，將補加後的胚胎放入培養箱恢復15分鐘，再次採用電刺激促使人卵胞質體與山羊卵胞質融合，融合液為含0.3mmol/L甘露醇、0.05mmol/LCaCl2、0.lmmol/LMgSO4和5%BSA的M16液；融合條件為DC、600-610V/cm，單脈衝持續時間為80μs，刺激一次。刺激後的卵置於M16培養液中培養20-30min，觀察是否融合。融合卵即為重構卵。1.2.7激活將重構卵置於M16液中，37°C、5%C02培養5h後，用另含5mmol/L離子黴素及無Ca2+、Mg2+的HM16液處理5min，再在另含2mmol/L6-二甲基氨基嘌呤(6-dimethylaminopurine,6-DMAP)及無Ca2+、Mg2+的HM16培養液中培養4_釙。激活後的重構胚置M16培養液中作短暫培養。1.2.8克隆胚胎移植臨時繼母羊體內培養將重構卵用0.8%瓊脂糖包埋後移植到山羊結紮的輸卵管內作體內培養。培養7天後，回收胚胎，觀察發育情況。2.結果共使用成熟山羊卵母細胞318枚用於補加組的試驗，其中核移植成功270枚(圖2和圖3)。經過電融合及激活，獲得了189枚重構胚胎。經體內培養後，回收到148枚胚胎，其中卵裂胚胎為139枚，發育到桑葚和囊胚(圖4)的胚胎數為16枚，桑葚囊胚發育率為11.5%(表1)，顯著高於本試驗室對照組中未補加人卵的種間核移植囊胚發育率(表1)。人胞質補加組的囊胚形態明顯優於未補加組的囊胚(圖4)。為了驗證本實施例中所獲得核移植囊胚是來自人的體細胞核，而不是山羊卵母細胞的孤雌激活發育而來，還分析了部分囊胚的核型。分析結果證實這些核移植囊胚來自人的體細胞核，因為這些囊胚的細胞中包含23對染色體(圖5)。表1、人體細胞-山羊卵胞質種間核移植重構胚的發育發育階段未補加組(%)補加組(%)回收重構胚數180148卵裂數121(67.2%)139(93.9%)4細胞的胚胎數76(62.8%)120(86.3%)囊胚數9(7.4%)16(11.5%)結論本發明採用動物中II期卵母細胞為受體胞質、人卵胞質替換部分動物卵胞質，引入人的線粒體，提高了異種胞質(線粒體)與人體細胞核之間的核質相容性。該方法不僅解決了人核移植胚胎製備過程中卵母細胞缺乏的問題，還可以顯著改善了核質之間的相容性，從而大幅度提高了人異種間核移植胚胎的囊胚發育率。例如，卵裂數從67.2%顯著提高到93.9%，換言之，未成功卵裂的數量從32.8%下降到6.1%。此外，本發明採用原代擴增培養的人皮膚成纖維細胞作為供核細胞(未經體外長期傳代培養的供核細胞)，有助於降低人種間核移植胚胎的異常發育率。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。參考文獻1.Wakayama,S.等人，Establishmentofmaleandfemalenucleartransferembryonicstemcelllinesfromdifferentmousestrainsandtissues.Biol.Reprod.72，932-936(2005).2.Wang,L.,Duan,Ε.,Sung,L.Y.,Jeong,B.S.,Yang,X.禾口Tian,X.C.(2005).Generationandcharacterizationofpluripotentstemcellsfromclonedbovineembryos.Biol.Reprod.73,149-155.3.ffakayama,S.,Jakt,M.L.,Suzuki,Μ.,Araki,R.,Hikichi,Τ.,Kishigarni,S.,Ohta,H.,VanThuan,N.,Mizutani,Ε.,Sakaide,Y.,等人』(2006).Equivalencyofnucleartransfer-derivedembryonicstemcellstothosederivedfromfertilizedmouseblastocyst.StemCells24,2023-2033.4.Fulka,J.,Jr.禾口Mrazek,M.(2004).Cloningofmammals-biologicalaspects.Cas.Lek.Cesk.143,295-298.5.Hubner,K.,Fuhrmann,G.,Christenson,L.K.,Kehler,J.,Reinbold,R.,DeLaFuente,R.,Wood,J.,Strauss,J.F.,III,Boiani,M.禾口SchoIer，H.R.(2003).Derivationofoocytesfrommouseembryonicstemcells.Science300,1251-1256.6.ShaHYjWangP，ZhangPYjChengGX,ChenJQ.Closerelatednessbetweenexoticnucleusandcytoplastcanimprovethepost-implantationdevelopmentrateofclonedinter-subspeciesembryos.CloningandStemCells.Volume11，Number3，2009.7.GurdonjJ.B.(1963).Nucleartransplantationinamphibianandtheimportanceofstablenuclearchangesincellulardifferentiation.Q.Rev.Biol.38，54-78.8.KatojY.，TanijΤ.，andTsunodajY.(2000).Cloningofcalvesfromvarioussomaticcelltypesofmaleandfemaleadult,newborn禾口fetalcows.J.Reprod.Fertil.120，231-237.9.Hill,J.R.，Winger,Q.A.,Long,C.R.，LooneyjC.R.，Thompson,J.A.禾口WethusinjΜ.Ε.(2000).Developmentratesofmalebovinenucleartransferembryosderivedfromadultandfetalcells.Biol.Reprod.62,1135-1140.10.BortvinjA.，Eggan，K.，Skaletsky，H.,AkutsujH.，Berry.D.L，Yanagimachi，R.，Page,D.C.禾口Jaenisch,R.(2003).IncompletereactivationofOct-4—relatedgenesinmouseembryosclonedfromsomaticnuclei.Development130，1673-1680.11.EgganjK.，AkutsujH.，LoringjJ.，Jackson-GrusbyjL，KlemmjΜ.，RideoujW.Μ.，III，YanagimachijR.禾口Jaenisch，R.(2001).Hybridvigor，fetalovergrowth,andviabilityofmicederivedbynuclearcloningandtetraploidembryocomplementation.Proc.Natl.Acad.Sci.USA98，6209-6214.12.Rideout,W.Μ.,Wakayama，Τ.，WutzjΑ.，EgganjK.，Jackson-GrusbyjL.，DausmanjJ.,YanagimachijR.禾口Jaenisch，R.(2000).Generationofmicefromwild-typeandtargetedEScellsbynuclearcloning.Natl.Genet.24,109-110.13.Jaenisch,R.禾口Bird,A.(2003).Epigeneticregulationofgeneexpression:howthegenomeintegratesintrinsicandenvironmentalsignals.Natl.Genet.33Supp1.，245-254.14.Dean,W.，BowdenjL.，AitchisonjΑ.，KlosejJ.，Moore,Τ.，MenesesjJ.J.，ReikjW.,andFeiljR.(1998).AlterimprintedgenemethylationandexpressionincompletelyES-derivedmousefetuses:associationwithaberrantphenotypes.Development125，2273-2282.15.HumpherysjD.，EgganjK.，AkutsujH.，HochedlingerjK.，RideoutjW.Μ.，III，BiniszkiewiczjD.，YanagimachijR.禾口Jaenisch，R.(2001).EpigeneticinstabilityinEScellsandclonedmice.Science293,95-97.16.Wilson,V.L.禾口Jones，P.A.(1983).DNAmethylationdecreasesinagingbutnotinimmortalcells.Science220，1055-1057.權利要求1.一種提高人種間核移植胚胎的早期發育率的方法，其特徵在於，包括步驟(a)將原代培養獲得的人成纖維細胞用作供核細胞，將供核細胞的細胞核移入去除了細胞核的非人哺乳動物中II期卵母細胞的卵周隙內，電刺激促進融合，從而形成重構卵；(b)將來自於人卵的胞質移入步驟(a)的重構卵；(c)對步驟(b)的重構卵進行電刺激，以促進人卵胞質與重構卵的融合，從而形成由人體細胞的細胞核、非人哺乳動物的去核卵胞質、和人卵胞質三種成分組成的重構卵。2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的成纖維細胞是流產胎兒皮膚組織或病人或健康個體包皮組織原代培養獲得的成纖維細胞。3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括步驟(d)對步驟(c)獲得的重構卵進行化學激活。4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的非人哺乳動物選自下組牛、羊、豬、狗、貓、兔、猴、小鼠。5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在步驟(c)中是以下條件中0.3mmol/L甘露醇、0.05mmol/LCaCl2、0.lmmol/LMgSO4和5%BSA、600_610V/cm，單脈衝持續時間為80μS。6.一種重構卵，其特徵在於，所述的重構卵由人體細胞的細胞核、非人哺乳動物的去核卵胞質、和人卵胞質三種成分組成。7.如權利要求6所述的重構卵，其特徵在於，所述的重構卵是用權利要求1所述的方法製備的。8.一種對人種間核移植的重構卵進行處理的方法，其中，所述的重構卵是將人的供核細胞的細胞核移入去除了細胞核的非人哺乳動物中II期卵母細胞而形成的重構卵，其特徵在於，包括步驟將來自於人卵的胞質移入所述的重構卵中。9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述的移入步驟是將人卵的胞質顯微注入卵母細胞的卵周隙內。10.如權利要求6所述的重構卵的用途，其特徵在於，用於製備用於治療目的的核移植胚胎幹細胞。全文摘要本發明提供了一種提高人種間核移植胚胎核質相容性及發育率的方法。該方法包括步驟(a)將供核細胞的細胞核移入去除了細胞核的非人哺乳動物卵母細胞的卵周隙內，電刺激促進融合，從而形成重構卵；(b)將來自於人卵的胞質移入步驟(a)的重構卵；(c)對步驟(b)的重構卵進行電刺激，從而形成由人體細胞的細胞核、非人哺乳動物的去核卵胞質、和人卵胞質三種成分組成的重構卵。本發明方法可顯著提高胚胎發育率。文檔編號C12N5/0735GK102382857SQ20101027028公開日2012年3月21日申請日期2010年9月2日優先權日2010年9月2日發明者馮雲,成國祥,沙紅英,陳建泉申請人:上海轉基因研究中心