耐鹽鹼高蛋白雜種酸模的選育方法
2023-06-09 23:11:16 1
專利名稱：耐鹽鹼高蛋白雜種酸模的選育方法
技術領域：
本發明涉及再生植株中變異株的選育方法，特別是涉及耐鹽鹼高蛋白雜種酸模的選育方法。
背景技術：
再生植株的變異是一種普遍的現象。組織培養誘發變異叫做體細胞無性系變異，所產生的變異株叫做細胞突變株。利用無性系變異，經離體或田間篩選獲得有用的細胞突變體是一種新的細胞工程育種途徑。用離體培養的組織和細胞再生出完整植株是植物組織培養和細胞工程研究的核心。按照細胞全能性學說，植物的每一個體細胞具有相同的遺傳信息，由它們分化成的再生植株在理論上應當是完全相同的。但是當植物組織和細胞脫離有機體，進入離體培養的環境中，細胞分裂的不規則性會顯著增加，導致愈傷組織再生植株中常出現基因型變異，故培養細胞是一個很不穩定的遺傳系統，變異株會有生理生化特性和農藝性狀的變化，從而為植物改良提供了豐富的變異材料。所以，一些分化程度比較高的細胞，如葉肉細胞可以在離體條件下經過脫分化和再分化過程，形成胚胎或植株。如中國科學院植物研究所王敬駒等自1980年以來，從大量的廣東與廣西省甘蔗品種的再生無性系中選出數十個優良株系，其中一個株系的蔗糖含量及每畝單產均超過當地當家品種，並通過品種鑑定。又如易溫斯(Evans)和廈泊(Sharp)於1983年對230株番茄再生植株及其R2代進行了性狀觀察和分析，最終從中選育出一些適合做番茄醬的新品種。酬道(Chowdari)等於1998年在水稻再生植株中檢測到DNA水平的變異。這些試驗都說明組織培養細胞可為植物改良提供豐富的變異來源，完全可以從中篩選出理想的新品種。
我國飼料作物短缺已很突出，糧食短缺為當今世界大問題之首。發展糧草型畜牧業是當今的發展趨勢。我國有667萬hm2耕地鹽漬化土壤和0.3億hm2鹽鹼荒地。利用鹽漬土壤、鹽鹼荒地、荒漠土壤種植耐鹽鹼的飼料作物，是解決飼料作物短缺的好辦法。目前能夠在鹽鹼地上生長的植物種類較多，但大部分植物的開發利用價值不大。
雜種酸模是一種生命力強、生長旺盛的多年生高產飼料作物，具有抗寒、速生的特點，富含蛋白質、有機硒、有機鐵、有機碘和多種維生素營養成分。中國人臧鳳豔，吳振穎，梁麗，等論述的「雜種酸模營養價值的研究[J]，2003(118)，PP33-35」和王震星、孫宏偉和張杰的論文「雜種酸模不同品系生物學特性觀察(J)，1999，6(4)，PP28-32」，均論述了雜種酸模。目前我國種植的雜種酸模，多為國外品種，如魯梅克斯(Romax)k-1，其鮮草產量為10-15t/667m2，蛋白質含量為29.8％，還存在耐鹽鹼性差、單寧含量高引起適口性差的缺點。如果採用傳統的育種方法對其進行改良，需要耗費大量的人力、物力和時間。
發明內容
鑑於現有技術中存在的上述缺陷，本發明的目的是提供一種耐鹽鹼高蛋白雜種酸模的選育方法，其鮮草產量15-20t/667m2、營養成分含量優於魯梅克斯k-1的，適口性好，消化率高，可廣泛用於豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、兔、魚的飼餵、並且再生能力強、抗旱寒。
本發明的技術方案是利用體細胞無性系變異，通過愈傷組織再生基因型變異的植株，其步驟為取雜種酸模外植體、切制、消毒、培育於MS培養基NH4NO31650mg/L、KNO31900mg/L、KH2PO4170mg/L、CaCl22H2O 440mg/L、MgSO47H2O 370mg/L、FeSO47H2O 27.8mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、MnSO44H2O 22.3mg/L、ZnSO47H2O 8.6mg/L、H3BO36.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO42H2O 0.25mg/L、CuSO45H2O 0.025mg/L、CoCl26H2O 0.025mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、鹽酸硫胺素0.4mg/L、鹽酸吡哆素0.5mg/L、煙酸0.5mg/L上、光照、控溫、形成愈傷組織、扦插生根，其特徵在於其雜種酸模外植體為一年生雜種酸模葉片、切成0.64cm2-1cm2、培育於含濃度10～30g/L的蔗糖(為植物提供碳源)、0.5-0.9％的瓊脂(作為固形劑)、0.3-0.6mg/L的6-苄基嘌呤(作為細胞分裂素)、0.7-0.9mg/L的吲哚丁酸(作為生長素)和酸鹼度5-6.5的外源激素培養基上，培養溫度為26±2℃、光照強度為2000-3000lx，光照為10-14小時/天，22-28天後觀察愈傷組織的形成及分化情況，確定最佳的分化培養基配方，隨後進行扦插生根，確定適合雜種酸模生根的方法。
本發明的有益效果，與魯梅克斯(Romax)k-1雜種酸模相比，不僅具有適口性好的特點，而且產量明顯提高(33.3％)，同時還能高抗鹽鹼，在pH9.0的含鹽量6.22‰的重鹽鹼地上生長良好。
具體實施例方式
(一)、雜種酸模組培繁育取天津市寧河縣一年生的雜種酸模葉片為外植體，切成1cm2大小，消毒後接種於含上述不同濃度配比的外源激素培養基上，25天後觀察愈傷組織的形成及分化情況。
誘導愈傷組織的形成和分化基本培養基為改良的MS，含濃度0.5mg/L的6-苄基嘌呤+0.8mg/L的吲哚丁酸、10～30g/L的蔗糖，0.7％的瓊脂和酸鹼度5.8。培養溫度為26±2℃，光照強度為2500lx，光照為12小時/天。將分化形成的芽接種在1/2MS附加上述配比的6-苄基嘌呤和吲哚丁酸的培養基上，15天後觀察芽叢的形成及生長狀況。在上述種激素配比中，6-苄基嘌呤0.5mg/L+吲哚丁酸0.8mg/L的組合，不僅有利於愈傷組織的形成，而且有利於芽的分化，且芽叢生長健壯。在組培出酸模芽叢之後，即可開始扦插生根。扦插生根容器可用廉價的營養缽、育苗盤，也可以在其它簡易容器中進行，扦插基質可以是蛭石、棉花或其它物質，扦插空間可以在培養室外有自然光照射的地方，也可以在培養室內完成生根過程。試管內生根培養基為MS，附加濃度為100mg/L萘乙酸和濃度為10g/L的蔗糖。由芽叢組培苗接種在試管內的生根情況中可以看出試管內生根適宜激素是萘乙酸。試管外生根採用扦插方法生根芽苗長到2-3cm(帶3-5片葉子)時，消毒後扦插在含有蛭石的淺盤器皿中，定期澆1/2MS，即定期澆濃度100mg/L萘乙酸的營養液，在25℃下培養。10天後觀察生根率。結果表明100mg/L萘乙酸對生根有利，生根率達63.3％，而高濃度的萘乙酸(200mg/L)反而抑制生根，即萘乙酸比吲哚丁酸更有利於雜種酸模的生根。隨後我們比較了試管內生根和試管外生根組培苗的移栽成活率。試管內生根的組培苗開瓶煉苗5天後進行移栽。對試管外扦插生根的苗，我們採用了過渡方法，即在半無菌狀態下操作扦插過程，在有菌狀態下完成生根過程，15天後移栽。扦插過程是在超淨臺裡完成的，將苗扦插在消過毒的蛭石或棉花中，生根過程是在實驗室環境條件下完成，定期澆灌含激素的營養液，直至生根。這成為移栽生根苗的一個煉苗過程，在生根過程中，不適宜室內環境的苗在生根前已經死亡，生根後的苗都是抗逆性強的苗，所以試管外生根的苗移栽成活率大於試管內生根的苗，並且試管外扦插生根法可節約成本和空間，提高了移栽成活率，因此這是一項值得應用和推廣的技術。
(二)、雜種酸模新品系97-1的選育試驗是在天津農學院園藝系試驗地進行。試材為3年生的魯梅克斯k-1和新選育出來的品系雜種酸模97-1。
試驗採用隨機區組設計，每小區三株，重複三次。在1998-2000三年的2月25日至6月2日，對兩個品系進行較詳細的觀察記載，觀測返青期、生育期、株高、葉生長速度(葉長和葉寬)、葉片生長與溫度關係、新葉生長所需積溫、花薹高度及生長速度、花期。每兩天觀察、測定一次。雜種酸模露地越冬後，早春開始萌動返青，偶遇霜凍時受影響不大。從2月25日開始(日均溫6℃時)，靠近根部的葉簇萌動，陸續從根莖周圍長出2-3個新嫩枝。前期生長速度慢，進入4月以後生長速度開始加快，生長量加大。葉子生長約需60天。通過葉長和葉寬的生長曲線可以看出，無論是魯梅克斯k-1，還是97-1雜種酸模，從4月5日至葉片停止生長時為止，雖然生長速度較快，但是並沒有一個特別明顯的生長高峰出現，曲線趨向於比較平緩。兩個品系的分櫱數差別不大，根系都很發達，主根可深入地下50cm，直徑可達8cm，主根強健，分叉，鬚根較多。魯梅克斯k-1葉子生長期、抽莖期和生育期都較短，莖生長約需20天，抽莖期、開花期開始和結束的時間都比雜種酸模97-1早。魯梅克斯k-1的株形也比雜種酸模97-1小些，株高平均200cm左右，葉長平均比雜種酸模97-1短16cm，葉寬比雜種酸模97-1窄7.32cm，開花節間為第5節。而雜種酸模97-1的生長速度卻很快，生長勢強，株形較大，平均株高在230cm左右，平均葉長接近55cm，葉寬亦接近20cm，開花節間為第8節。儘管雜種酸模97-1的葉長日均生長量比魯梅克斯k-1高0.59cm，葉寬日均生長量較魯梅克斯k-1多，雜種酸模97-1莖日均生長量也比魯梅克斯k-1多出3cm。通過差異顯著性測驗得知，兩品系莖、葉的生長量都有極顯著差異，但葉片和莖稈的生長與溫度無顯著相關。雜種酸模平均長一片葉所需積溫不是很多，但由於雜種酸模97-1的生育期比魯梅克斯k-1稍長，生育各時期也比魯梅克斯延後，所以雜種酸模97-1無論是活動積溫，還是地溫都比魯梅克斯k-1要高，一般高出50℃左右。通過差異顯著性測驗得知t＝9.28＞t 0.01，兩者在單株生物學產量方面存在極顯著差異，即雜種酸模97-1小區的平均單株產量比魯梅克斯k-1高1151.80克，達到極顯著水平。通過觀察測定及結果分析得知，雜種酸模耐寒性強，返青早，前期生長緩慢，後期生長速度快，株形大，生長勢強，生物學產量高。尤其是篩選出的新品系雜種酸模97-1，不論是生長量和生物學產量均高於魯梅克斯k-1。因此在生產上更具推廣價值。
(三)、對雜種酸模97-1和魯梅克斯K-1不同生長時期營養成分的分析乾物質的測定乾物質含量的最高值出現在1999年4月10日，最低值出現在1998年11月10日。雜種酸模在生長過程中乾物質含量在抽莖期最高，越冬前含量最低。
粗蛋白的測定粗蛋白含量的最高值出現在1999年4月10日，最低值出現在1998年10月8日。隨著雜種酸模的生長，在1999年4月10日以前，為營養生長階段，到4月10日開始抽莖，因此此時粗蛋白含量最高，達到39.55％。從1999年4月26日，粗蛋白含量稍降低，這一階段為雜種酸模從營養生長到生殖生長階段。隨著抽莖、開花對養分的消耗，粗蛋含量下降，而且在抽莖前期與抽莖開花後粗蛋白含量差異很大。粗脂肪的測定粗脂肪含量的最高值出現在1999年4月26日，最低值出現在1998年11月10日。隨著雜種酸模的生長，粗脂肪含量在越冬後呈上升趨勢，到抽莖期達到最高，之後逐漸降低，到秋末越冬前含量最低。通過試驗比較，兩者之間營養成分含量差異相近，產量差異顯著，因此在相同面積上一雜種酸模97-1所獲得的經濟效益較高。
(四)、雜種酸模等氮量替代豆餅飼養肉兔試驗為了確保試驗順利進行，首先在一個月內觀察了肉兔對雜種酸模的採食性能和雜種酸模對肉兔健康狀況的影響。結果發現兔子不僅採食，而且表現積極，未出現拉稀、消化不良等現象，至試驗結束也未發現運動異常。增重結果試驗期共48天，經稱重，結果表明；試驗二組增得最高，試驗一組次之，均略高於對照組。但經生物統計，各組之間無顯著性差異(P＞0.05)。
屠宰結果試驗結束，從三個組分別隨機選取2Kg左右的兔子各5隻，進行屠宰，其屠宰率對照組、試驗一組、二組分別為47.8％、47.4％和47.3％，基本相同。心、肝、肺平均分別重15g、95g和21g，各臟器未發現異常。
對健康的影響本試驗採取鮮體飼餵方式，在整個試驗期內未發現任何不良影響，三組兔子採食良好、健康，成活率100％，運動狀況良好。此外，經觀察兔子對曬乾的雜種酸模也很喜食。
權利要求
1.耐鹽鹼高蛋白雜種酸模的選育方法，其步驟為取雜種酸模外植體、切制、消毒、培育於MS培養基NH4NO31650mg/L、KNO31900mg/L、KH2PO4170mg/L、CaCl22H2O440mg/L、MgSO47H2O 370mg/L、FeSO47H2O 27.8mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、MnSO44H2O22.3mg/L、ZnSO47H2O 8.6mg/L、H3BO36.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO42H2O O.25mg/L、CuSO45H2O0.025mg/L、CoCl26H2O 0.025mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、鹽酸硫胺素0.4mg/L、鹽酸吡哆素0.5mg/L、煙酸0.5mg/L上、光照、控溫、形成愈傷組織、扦插生根，其特徵在於其雜種酸模外植體為一年生雜種酸模葉片、切成0.64cm2-1cm2、培育於含濃度10～30g/L的蔗糖(為植物提供碳源)、0.5-0.9％的瓊脂(作為固形劑)、0.3-0.6mg/L的6-苄基嘌呤(作為細胞分裂素)、0.7-0.9mg/L的吲哚丁酸(作為生長素)和酸鹼度5-6.5的外源激素培養基上，培養溫度為26±2℃、光照強度為2000-3000lx，光照為10-14小時/天，22-28天後觀察愈傷組織的形成及分化情況，確定最佳的分化培養基配方，隨後進行扦插生根，確定適合雜種酸模生根的方法。
2.根據權利要求1規定的耐鹽鹼高蛋白雜種酸模的選育方法，其特徵在於其一年生雜種酸模葉片可選用天津市寧河縣一年生的1cm2雜種酸模葉片為外植體。
3.根據權利要求1規定的耐鹽鹼高蛋白雜種酸模的選育方法，其特徵在於其培養基可為培養基的MS，含濃度0.5mg/L的6-苄基嘌呤+0.8mg/L的吲哚丁酸、10～30g/L的蔗糖，0.7％的瓊脂和酸鹼度5.8。
4.根據權利要求1規定的耐鹽鹼高蛋白雜種酸模的選育方法，其特徵在於其培養溫度可為26±2℃，光照強度為2500lx，光照為12小時/天。
全文摘要
本發明涉及再生植株中變異株的選育方法，特別是涉及耐鹽鹼高蛋白雜種酸模的選育方法，其特徵在於其雜種酸模外植體為一年生雜種酸模葉片、切成0.64cm
文檔編號A01H4/00GK1582640SQ200410019480
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月4日 優先權日2004年6月4日
發明者張磊, 劉玉芹, 王震星, 桂枝 申請人:天津農學院