一種新的豬生長激素的cDNA的製作方法
2023-06-09 19:41:26 2
專利名稱：一種新的豬生長激素的cDNA的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種豬生長激素(PGH)cDNA，特別是一種合成的新豬生長激素的cDNA，該cDNA具有高水平表達能力。
豬生產激素有多種效應，例如可增加豬體重的生長促進效應，胰島素節省效應，脂肪分解效應等。目前，從事豬生長激素研究中，普遍存在著在大腸桿菌中的表達率不夠高的缺點，其原因是基因內非選擇性的密碼子和稀有密碼子不僅通過在翻譯中阻止核糖體在位點的結合，從而降低蛋白的表達水平，而且通過結合錯誤胺基酸降低蛋白的活性，從工業化生產來看，不利於產量的提高，因此，有必要提供一種具有高水平表達能力的cDNA。
本發明的目的是提供一種高水平表達的豬生長激素cDNA，它有獨特的cDNA序列。
為實現上述目的，本發明採取以下設計方案一種新的豬生長激素的cDNA，所述的豬生長激素的cDNA序列中，ATG起始密碼子及其後的15個鹼基順序為TTT CCA GCT ATG CCT和終止密碼子TAA前的15個鹼基順序為TCT TCT TGT GCG TTC，其餘鹼基順序不變。也可以是其餘部分鹼基被改變，即從ATG起始密碼子到TAA TGA終止密碼子，共有94處鹼基被改變，其全長為5′ ATG TTT CCA GCT ATG CCT TTG TCT AGC CTT TTC GCA AATGCT GTT CTG CGT GCA CAG CAT CTG CAC CAA CTG GCA GCA GAT ACCTAT AAA GAA TTT GAA CGC GCA TAT ATT CCG GAA GGT CAG CGA TACTCC ATC CAG AAC GCG CAG GCT GCC TTC TGC TTC TCC GAG ACC ATCCCG GCT CCG ACT GGC AAA GAC GAA GCT CAG CAG CGT TCC GAC GTAGAG CTG CTG CGC TTC TCT CTG CTG CTG ATC CAG TCC TGG CTC GGTCCG GTA CAG TTC CTG TCT CGT GTT TTC ACC AAC AGC CTG GTG TTTGGC ACC TCT GAC CGC GTT TAC GAA AAA CTG AAA GAC CTC GAA GAAGGC ATC CAG GCT CTG ATG CGT GAG CTG GAG GAT GGC TCT CCG CGTGCA GGT CAG ATC CTC AAG CAA ACC TAC GAC AAA TTT GAC ACT AACCTG CGC AGC GAT GAC GCG CTG CTT AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCCTGC TTC AAA AAA GAC CTG CAC AAG GCT GAA ACC TAT CTG CGT GTTATG AAA TGT CGC CGC TTC GTG GAA TCT TCT TGT GCG TTC TAATGA3′。
一個cDNA在E·coli中的表達量與多種因素有關，例如5′端ATG後的15個鹼基的順序等；
從ATG起始密碼子到TAA終止密碼子，共有94處鹼基被改變，把PGH所有稀有密碼子全部換為偏愛密碼子，大大提高PGH的表達量。
下面結合圖表對本發明作進一步說明。
表1天然豬生長激素cDNA基因密碼子序列表2天然豬生長激素cDNA基因密碼子序列及對應的胺基酸序列表3大腸桿菌高表達基因密碼子表4重組豬生長激素cDNA基因密碼子序列與天然豬生長激素cDNA基因密碼子序列比較的改造點。
表5引物PCR擴增示意圖表6各引物的鹼基序列設計表7PGH DNA序列的測定結果
圖1PTrr I-PGH質粒圖2PGH蛋白質N端順序圖3SDS PAGE結果圖4SDS PAGE蛋白分布掃描5PGH SDS PAGE電泳掃描計算結果本發明提供的cDNA序列系按下列步驟進行1、按天然豬生長激素(PGH)cDNA的每一個編碼密碼子翻譯排列出對應的PGH胺基酸序列。(見表2)。
2、將PGH中相應胺基酸在大腸桿菌中高表達的基因密碼子(見表3「Thewisconsin package，by Gonctics Computer Group Inc，Copyright 1992，printed withpermlsion」注1、對應胺基酸的大腸桿菌密碼子在大腸桿菌基因中出現的數目2、該密碼子在大腸桿菌基因中，每1000密碼子中出現的頻數(期望)，3、該密碼子在它的同義密碼子家族中佔有分數比例)分為出現多的密碼子和出現少的密碼子，其中出現多的密碼子定為大腸桿菌偏愛密碼子以及出現少的定為稀有密碼子，並按照偏愛密碼子，將天然PGH基因表中的相應稀有密碼子取代，重新設計構成新的PGH cDNA序列，3、用計算機的DNAsis軟體把PGH5′端的mRNA的二級結構顯示出來，通過利用密碼子在第三位鹼基的兼併性儘可能的去掉這些二級結構，最終設計出新的豬生長激素cDNA基因序列。
4、以計算機設計的新cDNA序列為模板，自中心向兩端分別設計引物，本發明中，將優化後的PGH cDNA劃為8段，前4段設計為正向引物，後4段設計為反向引物，考慮到引物合成儀的效率，我們的引物一般選在70-125個鹼基之間，引物過長，合成出全長的引物就減少，使構建工作變得困難，引物短、使構建的步驟增多，使鹼基出錯率增高。
(1)引物的合成
由Millipore 8900 DNA合成儀合成，合成採用了0.2μm規模的標準條件，引物經去掉保護基和經Sephadex G25柱子脫鹽後用於PGH cDNA的構建。
(2)引物的PCR擴增見表5實施例1以按上述方法設計出的新豬生長激素cDNA為模板，計算機輔助設計並選用下列引物PGP4為79個鹼基PGR5為90個鹼基PGP3為80個鹼基GR6為123個鹼基GP2為99個鹼基PGR8為87個鹼基GP1為97個鹼基PGR9為81個鹼基其各引物的序列及方向見表6(1)引物的合成由Millipore 8900 DNA合成儀合成(見前)(2)引物PCR擴增根據計算機DNAsis軟體設計出相應引物的最佳擴增條件為引物P4和R5方向相反，在它們的3′端有19個鹼基互補區，經12次PCR擴增循環，得到一個149個鹼基的PGH片段，擴增儀為PE2400，反應體積為100μl，擴增條件為94℃20秒；55℃，20秒；72℃，20秒，4個單位Vltma DNA聚合酶在第一循環94℃時加入到反應體系中，149個鹼基的PCR產物經PromegaPCR提純試劑盒提純後作為下一次擴增的底物。
方向相反的引物P3和R6的3′端的20個鹼基和18個鹼基分別互補上述的149個鹼基的PGH片段5′端和3′端，取提純後的149個鹼基的PGH片段為該引物底物(大約100ng底物)，經與第一次擴增相同的條件下擴增出一個314個鹼基的PGHDNA片段。
方向相反的P2和R8的3′端的各18個鹼基分別互補上述的314個鹼基PGH DNA片段的5′端和3′端。用上述相同條件，經第三次PCR擴增後，得到546個鹼基的PGH片段。
方向相反的引物P1和R9的3′端的16個鹼基和18個鹼基分別互補這個546個鹼基的PGH DNA片段的5′端和3′端，經第四次PCR擴增，得到609個鹼基的PGH全長DNA，擴增條件與以上相同。
通過上述PCR擴增獲得PGH全長DNA克隆到由Invitrogen PTrc His載體(外購)改造成PTrcI載體上，而構成PTrcI-PGH。
PTrcI載體的構建
以PTrc His質粒為模板，使用Ttn DNA聚合酶進行PCR擴增，正向引物互補Hind III位點的6個鹼基順序，和該位點後15個鹼基和之前的6個鹼基序列。反向引物的3′端互補PTrc His載體的NcoI酶切位點前20個鹼基序列。負向引物的5′端含有一個NdeI酶切位點和6個鹼基，這6個鹼基主要是提供在酶切時所必要的。
PCR擴增後，Hind III內切酶位點在產物的5′端，現3′端的NdeI酶切位點取代了原來的Nco1位點而構成了PTrc I。由於PTrc I含有兩NdeI酶切位，採用了部分Hde1酶切法，先加入Hind III酶切在37℃酶切1小時，然後加入1單位的NdeI酶，10分鐘時取一半的樣品，20分鐘時取後一半的樣。
PCR擴增得到PGH經Promega PCR提純試劑盒提純後，用Hind III和NdeI酶切，NdeI在PGH cDNA的5′端，Hind III在PGH的3′端，PGH的酶切產物和PTrc 1兩個部分酶切產物跑1％Argrose Gel電泳，從膠上取600個鹼基PGH DNA片段和4·5Kb全長PTrc I DNA片段，這兩個DNA片段經Biolol Geneclean試劑盒提純後，用Promega Ligation試劑盒把兩個DNA片段連接在一起構成PTrcI-PGH質粒，即PGH CDNA被克隆在PTrcI載體上，見圖1，然後按照romega JM109感受態細胞試劑盒的方法，將該質粒轉導到JM109細胞裡，然劃到100μg/ml AmP-LB膠盒上，培養該盒在37℃至到長出克隆JM109-PTrc I-PGH，取單個克隆的JM109-PTrc I-PGH在100μg/ml Amp的LB培養液裡生長傳代。
對已進行PGH新cDNA轉基因操作的並經傳代的JM109-PTrcI-PGH細胞中PGH基因測序，測序方法JM109-PTrcI-PGH細胞在LB培養液中和37℃溫度生長過夜，PromegaDNA提純試劑盒用於製備PTrcI-PGH質粒，一個正向引物位於Irp起動子和一個反向引物位於PGH終止密碼子之後，被用於測序。
測序使用PE公司自動測序試劑盒以及PE公司測序結果(見表7)。證明傳代後的JM109-PTrcI-PGH菌株中的PGHcDNA序列與優化設計的PGHcDNA序列一致，無變異。
對JM109-PTrcI-PGH細胞表達的PGH蛋白質N端順序進行測序，並與天然PGH相應段的蛋白質胺基酸序列比較，證明表達產物正確，無變異，方法從100μg/ml Amp，LB盤上取單個JM109-PTrcI-PGH菌株克隆，放到50ml LB(100μg/ml Amp)，在搖床上(200rpm轉速)生長過夜，用LB稀釋生長過夜的細胞到100倍，細胞在37℃的搖床(200rmp轉速)長到OD600＝0.6，加入1mM IPTG誘導3.5小時。
誘導前和誘導後的JM109-PTrcI-PGH細胞經SDS上樣(Loading)緩衝液處理後，跑SDS PAGE將細胞總蛋白分開，再由蛋白質掃描儀對該SDS PAGE進行蛋白質純度掃描測定，SDS PAGE結果如圖3所示，1A是誘導前的JM109-PTrcI-PGH細胞蛋白總表達量，2A是誘導後的該細胞的蛋白總表達量。
PGH蛋白表達量的測定是由新加坡生物工程中心進行的，使用Biorao掃描儀，PGH的表達量48-50％。表4中*為改造點。
由SDS PAGE分離的PGH被轉到nitrocellulose紙上，由新加坡生物工程中心進行蛋白質N端測序，結果表明PGH蛋白質N端順序是正確的與對應的合成PGH cDNA相符，見圖2。
本發明優點用PGH cDNA中優化的E.coli密碼子取代稀有密碼子，使PGH表達水平可達50％以上(世界最高水平約30％)，高表達水平PGH使蛋白純化容易達到獸用標準，據實驗得知，本發明的PGH蛋白經簡單的提純後，純度提過了95％。因此，本發明提供的PGH cDNA具有很高的工業化價值。5′ATG TTT CCA GCT ATG CCT TTG TCT AGC CTT TTC GCA AAT GCT GTT CTG CGTGCA CAG CAT CTG CAC CAA CTG GCA GCA GAT ACC TAT AAA GAA TTT GAA CGCGCA TAT ATT CCG GAA GGT CAG CGA TAC TCC ATC CAG AAC GCG CAG GCT GCCTTC TGC TTC TCC GAG ACC ATC CCG GCT CCG ACT GGC AAA GAC GAA GCT CAGCAG CGT TCC GAC GTA GAG CTG CTG CGC TTC TCT CTG CTG CTG ATC CAG TCCTGG CTC GGT CCG GTA CAG TTC CTG TCT CGT GTT TTC ACC AAC AGC CTG GTGTTT GGC ACC TCT GAC CGC GTT TAC GAA AAA CTG AAA GAC CTG GAA GAA GGCATC CAG GCT CTG ATG CGT GAG CTG GAG GAT GGC TCT CCG CGT GCA GGT CAGATC CTC AAG CAA ACC TAC GAC AAA TTT GAC ACT AAC CTG CGC AGC GAT GACGCG CTG CTT AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC AAA AAA GAC CTG CACAAG GCT GAA ACC TAT CTG CGT GTT ATG AAA TGT CGC CGC TTC GTG GAA TCTTCT TGT GCG TTC TAA TGA ACC TCC CAT CCT ATT ATT 3′表1GCC TTC CCA GCC ATG CCC TTG TCC AGC CTA TTT GCC AAC GCC GTG CTC CGGMet Phe Pro Ala Met Pro Leu Ser Ser Leu Phe Ala Asn Ala Val Leu ArgGCC CAG CAC CTG CAC CAA CTG GCT GCC GAC ACC TAC AAG GAG TTT GAG CGCAla Gln His Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Thr Tyr Lys Glu Phe Glu ArgGCC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGG TAC TCC ATC CAG AAC GCC CAG GCT GCCAla Tyr Ile Pro Glu Gly Gln Arg Tyr Ser Ile Gln Asn Ala Gln Ala AlaTTC TGC TTC TCG GAG ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG GAC GAG GCC CAGPhe Cys Phe Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro Thr Gly Lys Asp Glu Ala GlnCAG AGA TCG GAC GTG GAG CTG CTG CGC TTC TCG CTG CTG CTC ATC CAG TCGGln Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu Arg Phe Ser Leu Leu Leu Ile Gln SerTGG CTC GGG CCC GTG CAG TTC CTC AGC AGG GTC TTC ACC AAC AGC CTG GTGTrp Leu Gly Pro Val Gln Phe Leu Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu ValTTT GGC ACC TCA GAC CGC GTC TAC GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAG GGCPhe Gly Thr Ser Asp Arg Val Tyr Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu GlyATC CAG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAG GAT GGC AGC CCC CGG GCA GGA CAGIle Gln Ala Leu Met Arg Glu Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Ala Gly GlnATC CTC AAG CAA ACC TAC GAC AAA TTT GAC ACA AAC TTG CGC AGT GAT GACIle Leu Lys Gln Thr Tyr Asp Lys Phe Asp Thr Asn Leu Arg Ser Asp AspGCG CTG CTT AAG AAC TAC GGG CTG CTC TCC TGC TTC AAG AAG GAC CTG CACAla Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Leu HisAAG GCT GAG ACA TAC CTG CGG GTC ATG AAG TGT CGC CGC TTC GTG GAG AGCLys Ala Glu Thr Tyr Leu Arg Val Met Lys Cys Arg Arg Phe Val Glu SerAGC TGT GCC TTC TAG T-- TGC TGG GCA TCT CTG TTGSer Cys Ala Phe *** *** Ser Leu Asp Pro Ile Ile表2aa Gedam Numbert/1800t Praetlamtaa GadamNumbert/1800tFraetlamtGlyGGG 13 1.89 0.02 TrpUGG55 7.98 1.00GlyGGA3 0.44 0.00 stop UGA 0 0.00(stop)GlyGGU 365 52.99 0.59 CysUGU22 3.19 0.49GlyGGC 238 34.55 0.38 CysUGC23 3.34 0.51GluGAG 108 15.68 0.22 stop UAG 0 0.00(stop)GluGAA 394 57.20 0.78 stop UAA 0 0.00(stop)AspGAU 149 21.63 0.33 TyrUAU51 7.40 0.25AspGAC 298 43.26 0.67 TyrUAC 157 22.79 0.75ValGUG 93 13.50 0.16 LeuUUG18 2.61 0.03ValGUA 146 21.20 0.26 LeuUUA12 1.74 0.02ValGUU 289 43.26 0.51 PheUUU51 7.40 0.24ValGUC 38 5.52 0.07 PheUUC 166 24.10 0.76AlaGCG 161 23.37 0.26 SerUCG14 2.03 0.04AlaGCA 173 25.12 0.28 SerUCA 7 1.02 0.02AlaGCU 212 30.78 0.35 SerUCU 120 17.42 0.34AlaGCC 62 9.00 0.10 SerUCC 131 19.02 0.37ArgAGG1 0.15 0.00 ArgCGG 1 0.15 0.00ArgAGA0 0.00 0.00 ArgCGA 2 0.29 0.01SerAGU9 1.31 0.03 ArgCGU 290 42.10 0.74SerAGC 71 10.31 0.20 ArgCGC96 13.94 0.25LysAAG 111 16.11 0.26 GlnCAG 233 33.83 0.86LysAAA 320 46.46 0.74 GlnCAA37 5.37 0.14AsnAAU 19 2.76 0.06 HisCAU18 2.61 0.17AsnAAC 274 39.78 0.94 HisCAC85 12.34 0.83MetAUG 170 24.68 1.00 LeuCUG 480 69.69 0.83IleAUA1 0.15 0.00 LeuCUA 2 0.29 0.00IleAUU 70 10.16 0 17 LeuCUU25 3.63 0.04IleAUC 345 50.09 0.83 LeuCUC38 5.52 0.07ThrACG 25 3.63 0.07 ProCCG 190 27.58 0.77ThrACA 14 2.03 0.04 ProCCA36 5.23 0.15ThrACU 130 18.87 0.35 ProCCU19 2.76 0.08ThrACC 206 29.91 0.55 ProCCC 1 0.15 0.00表3
*** * * * ** * * * ** * *重組基因5′ATG TTT CCA GCT ATG CCT TTG TCT AGC CTT TTC GCA AAT GCT GTT CTG CGT天然基因 GCC TTC CCA GCC ATG CCC TTG TCC AGC CTA TTT GCC AAC GCC GTG CTC CGG** * * * * * * *GCA CAG CAT CTG CAC CAA CTG GCA GCA GAT ACC TAT AAA GAA TTT GAA CGCGCC CAG CAC CTG CAC CAA CTG GCT GCC GAC ACC TAC AAG GAG TTT GAG CGC* ** * * * * *GCA TAT ATT CCG GAA GGT CAG CGA TAC TCC ATC CAG AAC GCG CAG GCT GCCGCC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGG TAC TCC ATC CAG AAC GCC CAG GCT GCC* * ** * * *TTC TGC TTC TCC GAG ACC ATC CCG GCT CCG ACT GGC AAA GAC GAA GCT CAGTTC TGC TTC TCG GAG ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG GAC GAG GCC CAG* ** * * * *CAG CGT TCC GAC GTA GAG CTG CTG CGC TTC TCT CTG CTG CTG ATC CAG TCCCAG AGA TCG GAC GTG GAG CTG CTG CGC TTC TCG CTG CTG CTC ATC CAG TCG* * * * *** ** *TGG CTC GGT CCG GTA CAG TTC CTG TCT CGT GTT TTC ACC AAC AGC CTG GTGTGG CTC GGG CCC GTG CAG TTC CTC AGC AGG GTC TTC ACC AAC AGC CTG GTG* * * ** **TTT GGC ACC TCT GAC CGC GTT TAC GAA AAA CTG AAA GAC CTG GAA GAA GGCTTT GGC ACC TCA GAC CGC GTC TAC GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAG GGC* **** * * *ATC CAG GCT CTG ATG CGT GAG CTG GAG GAT GGC TCT CCG CGT GCA GGT CAGATC CAG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAG GAT GGC AGC CCC CGG GCA GGA CAG* * *ATC CTC AAG CAA ACC TAC GAC AAA TTT GAC ACT AAC CTG CGC AGC GAT GACATC CTC AAG CAA ACC TAC GAC AAA TTT GAC ACA AAC TTG CGC AGT GAT GAC* * *GCG CTG CTT AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC AAA AAA GAC CTG CACGCG CTG CTT AAG AAC TAC GGG CTG CTC TCC TGC TTC AAG AAG GAC CTG CAC* * * * ** * ***AAG GCT GAA ACC TAT CTG CGT GTT ATG AAA TGT CGC CGC TTC GTG GAA TCTAAG GCT GAG ACA TAC CTG CGG GTC ATG AAG TGT CGC CGC TTC GTG GAG AGC*** * * **TCT TGT GCG TTC TAA TGA 3′AGC TGT GCC TTC TAG T--表4
表5
表6
表6
表7
表權利要求
1.一種新的豬生長激素的cDNA，其特徵在於所述的豬生長激素的cDNA序列中，ATG起始密碼子及其後的15個鹼基順序為TTT CCA GCT ATG CCT和終止密碼子TAA前的15個鹼基順序為TCT TCT TGT GCG TTC，其餘鹼基順序不變。
2.按權利要求1所述的新豬生長激素的cDNA，其特徵在於所述的其餘鹼基順序部分被改變，其全長為5′ ATG TTT CCA GCT ATG CCT TTG TCT AGC CTT TTC GCA AATGCT GTT CTG CGT GCA CAG CAT CTG CAC CAA CTG GCA GCA GAT ACCTAT AAA GAA TTT GAA CGC GCA TAT ATT CCG GAA GGT CAG CGA TACTCC ATC CAG AAC GCG CAG GCT GCC TTC TGC TTC TCC GAG ACC ATCCCG GCT CCG ACT GGC AAA GAC GAA GCT CAG CAG CGT TCC GAC GTAGAG CTG CTG CGC TTC TCT CTG CTG CTG ATC CAG TCC TGG CTC GGTCCG GTA CAG TTC CTG TCT CGT GTT TTC ACC AAC AGC CTG GTG TTTGGC ACC TCT GAC CGC GTT TAC GAA AAA CTG AAA GAC CTC GAA GAAGGC ATC CAG GCT CTG ATG CGT GAG CTG GAG GAT GGC TCT CCG CGTGCA GGT CAG ATC CTC AAG CAA ACC TAC GAC AAA TTT GAC ACT AACCTG CGC AGC GAT GAC GCG CTG CTT AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCCTGC TTC AAA AAA GAC CTG CAC AAG GCT GAA ACC TAT CTG CGT GTTATG AAA TGT CGC CGC TTC GTG GAA TCT TCT TGT GCG TTC TAA TGA3′。
全文摘要
一種新的豬生長激素的cDNA,其序列中ATG起始密碼子及其後的15個鹼基順序為TTTCCAGCTATGCCT和終止密碼子TAA前的15個鹼基順序為TCT TCT TGT GCGTTC,其餘鹼基順序不變。也可以是全長中94個鹼基被改變。本發明用PGH cDNA中優化的E.coli密碼子取代稀有密碼子,使PGH表達水平可達50%以上,高表達水平PGH使蛋白純化容易達到獸用標準,本發明的PGH蛋白經簡單的提純後,純度超過了95%,本發明具有很高的工業化價值。
文檔編號C12N15/18GK1197845SQ97121969
公開日1998年11月4日 申請日期1997年12月3日 優先權日1997年12月3日
發明者朱文斯, 朱文建 申請人:朱文斯, 朱文建