一種抗腫瘤的pten-vp22基因的製作方法
2023-05-29 06:46:51
一種抗腫瘤的pten-vp22基因的製作方法
【專利摘要】本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種抗腫瘤的PTEN-VP22基因。本發明所述抗腫瘤的PTEN-VP22基因具有如下序列之一：（i）具有序列表中SEQ?ID?NO.1所述的核苷酸序列；（ii）具有與（i）限定的核苷酸序列至少95%同源性的序列。本發明所述抗腫瘤的PTEN-VP22基因編碼的蛋白質可有效的抑制腫瘤細胞，同時該蛋白質可有效地穿透細胞膜，從而對更多的腫瘤細胞產生抑制效應，對於PTEN基因的臨床應用起到積極的作用。
【專利說明】—種抗腫瘤的PTEN-VP22基因
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種抗腫瘤的PTEN-VP22基因。
【背景技術】
[0002]腫瘤是威脅人類健康的重要疾病，其治療方法的研究一直是醫學和生命科學研究的重點。腫瘤的生物治療已被世界醫學界公認為是繼手術、放射治療和化學治療之後的第四大治療方法，其中的基因治療更是目前腫瘤生物治療中最活躍的研究領域之一。基因治療的原理是將目的基因用基因轉移技術導入靶細胞，使靶細胞表達此基因從而獲得特定的功能，繼而執行或介導對腫瘤的殺傷和抑制作用，從而達到治療的目的。
[0003]癌基因激活和抑癌基因失活是目前公認的腫瘤發生的重要分子機制。PTEN基因屬於抑癌基因中一種，該基因是於1997年發現的一種與人類多種腫瘤的惡性增值與轉移密切相關的抑癌基因。
[0004]PTEN 基因(gene of phosphate and tens1n homology deleted on chromsometen, PTEN)又名 MMACl (mutated in multiple advanced cancerl)和 TEPl (TGF-regulatedand epithelial cell-enriched phosphatase),該基因異常廣泛存在於人類各種的惡性腫瘤中，如惡性神經膠質瘤、前列腺癌、子宮內膜癌、乳腺癌、黑色素瘤等。PTEN基因正常表達可以抑制腫瘤細胞侵襲、轉移和生長；而該基因異常將導致PTEN蛋白表達下降甚至完全不表達。PTEN基因失活與細胞信號轉導、腫瘤發病機理、浸潤轉移、惡性轉化、無限制生長和臨床預後等有較為密切的關係。
[0005]PTEN基因定位於人類染色體10q23.3區，全長200kb，有9個外顯子和8個內含子，其cDNA序列內包含一個由1203個核苷酸組成的開放閱讀框，其編碼的PTEN蛋白含有403個胺基酸，分布在人體多處組織的細胞質和細胞核內。PTEN編碼的蛋白質的胺基酸序列與蛋白質絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶和蛋白質酪氨酸磷酸酶催化區的核心基序符合，是迄今為止發現的第一個編碼具有雙重特異磷酸酶功能的抑制腫瘤基因。同其他抑癌基因一樣，PTEN為一高度保守基因，不同來源的PTEN的同源性較高，通常在95%以上，甚至於可以達到99%以上，其在細胞的分化中起著重要的作用。
[0006]PTEN編碼一個由403個胺基酸組成的一條肽鏈，PTEN蛋白沒有SH2結構，也沒有跨膜信號，其是定位於細胞漿的一種磷酸酯酶。PTEN基因具有雙重磷酸酶活性，即蛋白磷酸酶活性和脂質磷酸酶活性。磷脂醯基醇一3，4，5—三磷酸[PtdIns (3，4，5)P3，簡稱PIP3]是PTEN作用的主要底物，PIP3是細胞生長因子的第二信使，其能夠促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。而PTEN可以使其去磷酸，降低細胞內的PIP3水平，阻斷其後續的生長因子轉導通路，使細胞周期阻斷在Gl期和促使細胞凋亡，對細胞的生長起負調節作用。當PTEN基因發生體細胞突變或缺失而失活時，導致細胞內PIP3的水平增高，其後的信號轉導加強，細胞無限增殖形成腫瘤。此外，PTEN基因也具有蛋白磷酸酶活性，其可以讓磷酸化的酪氨酸和絲氨酸局部粘連激酶(FAK)去磷酸，從而抑制整合素介導的細胞浸潤和轉移；同時，PTEN基因還可以通過抑制MAPK的途徑來抑制腫瘤細胞的生長從而達到抑制腫瘤細胞的目的。
[0007]PTEN基因僅是抑癌基因中的一種；在人類大多數的惡性腫瘤中，均有抑癌基因的突變，如P53、PTEN、P16、BRCAU BRCA2、Rbl等。PTEN是目前為止發現的第一個具有雙重磷酸酶功能的抑癌基因，在人類的惡性腫瘤中廣泛存在突變(約25-50%)，如惡性神經膠質細胞瘤、黑色素瘤、頭頸瘤、腎癌等，尤其是在留體激素依賴性腫瘤中如前列腺癌、子宮內膜癌、卵巢子宮內膜樣癌、乳腺癌等，而PTEN基因在子宮內膜癌中的突變是所有惡性腫瘤中檢出率最高的，同時也是至今在子宮內膜樣腺癌中鑑定出的最常見的突變基因，突變率在36%-83%，在子宮內膜癌前病變中也發現有18-55%的突變率。
[0008]雖然目前腫瘤的基因治療已成為備受矚目的研究領域並已顯示出良好的應用前景，但是基因治療的過程需要抑癌的外源基因進入細胞的過程，該過程被稱為轉導。現有直接將PTEN基因運用到載體或質粒中並對腫瘤細胞進行基因治療的方式，由於PTEN基因的轉導效率較低，因此其成為了阻礙腫瘤的PTEN基因治療在臨床應用的原因之一。
[0009]近幾年來，一些蛋白和多肽相繼被發現能穿越細胞膜從而具有細胞間轉運的特性，該類蛋白或多肽被稱為細胞穿透肽。利用細胞穿透肽，已有大量的抑癌蛋白被成功轉運，並顯示出良好的應用價值。
【發明內容】
[0010]有鑑於此，本發明提供一種抗腫瘤的PTEN-VP22基因，該基因編碼的蛋白質可有效的抑制腫瘤細胞，同時該蛋白質可有效地穿透細胞膜，從而對更多的腫瘤細胞產生抑制效應，對於PTEN基因的臨床應用起到積極的作用。
[0011]為解決以上技術問題，本發明的第一個目的是提供一種抗腫瘤的PTEN-VP2 2基因，該基因具有如下序列之一:
[0012](i)具有序列表中SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列；
[0013](ii)具有與(i)限定的核苷酸序列至少95%同源性的序列。
[0014]本發明的第二個目的是提供一種包含前述抗腫瘤的PTEN-VP22基因即基因序列(i)或基因序列(ii)的表達載體。
[0015]優選的，本發明進一步採用包含前述抗腫瘤的PTEN-VP22基因即基因序列(i)的表達載體。
[0016]本發明的第三個目的是提供一種製備前述抗腫瘤的PTEN-VP22基因即基因序列
(i)或基因序列(ii)的方法，包括有如下步驟:
[0017]I)以PTEN cDNA為模板，進行PCR擴增；擴增中採用引物PTEN-F:GTCGAATTCATGACAGCCATCATC 與 PTEN-R: GAGAGGTCATGACTTTTGTAATTTGTGT ；
[0018]2)以VP22基因為模板進行PCR擴增；擴增中採用引物VP22-F:TACAAAAGTCATGACCTCTCGCC 與 VP22-R:AATGAATTCTCACTCGACGGGC ；
[0019]3)步驟I和步驟2)中得到的PTEN基因與VP22基因按照質量比為1:1進行PCR ；
[0020]4)以步驟3)產物為模板為，PTEN-F與VP22-R為引物進行PCR。
[0021]優選的，所述步驟1)、2)和4)中PCR擴增的條件為:94°C 3min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 30 個循環；72°C 5min。
[0022]優選的，所述步驟3)中PCR擴增的條件為:94°C 3min ；94°C 30sec，55°C 30sec,72°C lmin,共 10 個循環；72°C 5min。
[0023]本發明的第四個目的在於提供一種前述PTEN-VP22基因即基因序列(i)或基因序列(ii)在製備治療惡性腫瘤方面藥物中的應用。
[0024]優選的，所述惡性腫瘤為前列腺癌、子宮內膜癌、卵巢子宮內膜樣癌、乳腺癌。
[0025]優選的，所述惡性腫瘤為乳腺癌。
[0026]本發明的第五個目的在於提供一種前述抗腫瘤PTEN-VP22基因編碼的蛋白質，該蛋白質具有如下序列之一:
[0027](i )具有序列表中SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列；
[0028](ii)具有與(i)限定的胺基酸序列至少95%同源性的序列。
[0029]本發明的第六個目的在於提供一種前述PTEN-VP22基因編碼的蛋白質即胺基酸序列(i )或胺基酸序列(ii )在製備治療惡性腫瘤方面藥物中的應用。
[0030]優選的，所述惡性腫瘤為前列腺癌、子宮內膜癌、卵巢子宮內膜樣癌、乳腺癌。
[0031]優選的，所述惡性腫瘤為乳腺癌。
[0032]本發明與現有技術相比，其詳細說明如下:
[0033]本發明採用的技術方案為:一種抗腫瘤的PTEN-VP22基因，該基因具有如下序列之一:
[0034](i)具有序列表中SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列；
[0035](ii)具有與(i)限定的核苷酸序列至少95%同源性的序列。
[0036]本發明所述序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列為採用將現有PTEN基因與現有的細胞穿透肽之一即VP22基因相結合所得。序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列中第1-1209個核苷酸為PTEN基因，第1210-2115個核苷酸為VP22基因。PTEN基因為現有用於治療腫瘤的基因之一，VP22基因所編碼出來的多肽可以穿透細胞膜；本發明人經過充分的研究發現，將PTEN基因與VP22基因結合後所得的本發明抗腫瘤基因PTEN-VP22編碼出的蛋白質不僅沒有因為VP22基因的連入而減弱該蛋白質對於腫瘤細胞的抑制作用，反而由於VP22能夠穿透細胞膜，促使該蛋白質可以在細胞間傳遞，從而可以更加有效地抑制腫瘤細胞。
[0037]本發明所述PTEN基因不僅可以選自人源性PTEN基因，甚至於可以採用與人源性PTEN基因有95%以上同源性的任何來源的PTEN基因，包括鼠源性PTEN基因、犬源性PTEN基因等。
[0038]本發明所述PTEN-VP22基因所編碼的蛋白質可以用於抑制現有PTEN基因編碼出的蛋白質治療的各種腫瘤細胞，包括有惡性神經膠質細胞瘤、黑色素瘤、頭頸瘤、腎癌、前列腺癌、子宮內膜癌、卵巢子宮內膜樣癌、乳腺癌等；令人吃驚的是，本發明人發現本發明所述PTEN-VP22基因所編碼的蛋白質尤其對於乳腺癌的抑制作用最為明顯。
[0039]本發明所述PTEN-VP22基因的製備方法可以採用現有的將兩種基因組合的通用製備方法，還可以採用本發明提供的製備方法，本發明製備方法是在多次試驗的基礎上獲得的，其可以有效的提高本發明所述PTEN-VP22基因的擴增效率。
【具體實施方式】
[0040]為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。
[0041]實施例1一採用PCR的方式構建抗腫瘤的PTEN-VP22基因
[0042]對照例I
[0043]I)以人源性PTEN cDNA為模板，採用引物PTEN-F:
[0044]GTCGAATTCATGACAGCCATCATC 與 PTEN-R:
[0045]GAGAGGTCATGACTTTTGTAATTTGTGT，PCR 擴增基因 PTEN cDNA。PCR 參數:94°C 3min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 30 個循環；72°C 5min。
[0046]2)以基因VP22為模板，採用引物VP22-F:
[0047]TACAAAAGTCATGACCTCTCGCC 與 VP22-R:
[0048]AATGAATTCTCACTCGACGGGC 擴增基因 VP22，PCR 擴增基因 VP22。PCR 參數同 I)。
[0049]3)步驟I)和步驟2)中得到的PTEN基因與VP22基因各10ng做模板，30 μ I體系進行 PCR，參數:94°C 3min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 10 個循環；72°C 5min。
[0050]4)以步驟3)產物為模板，PTEN-F與VP22-R為引物，50 μ I體系進行PCR，參數同I)。
[0051]將步驟4)得到的產物經DNA序列測定確定構建成功，即對照例I抗腫瘤PTEN-VP22基因序列構建成序列表中SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。
[0052]對照例2
[0053]I)以鼠源性PTEN cDNA為模板，採用引物PTEN-F:
[0054]GTCGAATTCATGACAGCCATCATC 與 PTEN-R:
[0055]GAGAGGTCATGACTTTTGTAATTTGTGT，PCR 擴增基因 PTEN cDNA。PCR 參數:94°C 3min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 30 個循環；72°C 5min。
[0056]2)以基因VP22為模板，採用引物VP22-F:
[0057]TACAAAAGTCATGACCTCTCGCC 與 VP22-R:
[0058]AATGAATTCTCACTCGACGGGC 擴增基因 VP22，PCR 擴增基因 VP22。PCR 參數同 I)。
[0059]3)步驟I)和步驟2)中得到的PTEN基因與VP22基因各10ng做模板，30 μ I體系進行 PCR，參數:94°C 3min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 10 個循環；72°C 5min。
[0060]4)以步驟3)產物為模板，PTEN-F與VP22-R為引物，50 μ I體系進行PCR，參數同I)。
[0061]將步驟4)得到的產物經DNA序列測定確定構建成功，即對照例2抗腫瘤PTEN-VP22基因序列構建成具有與序列表中SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列95%以上同源性的序列。
[0062]對照例3
[0063]I)以犬源性PTEN cDNA為模板，採用引物PTEN-F:
[0064]GTCGAATTCATGACAGCCATCATC 與 PTEN-R:
[0065]GAGAGGTCATGACTTTTGTAATTTGTGT，PCR 擴增基因 PTEN cDNA。PCR 參數:94°C 3min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 30 個循環；72°C 5min。
[0066]2)以基因VP22為模板，採用引物VP22-F:
[0067]TACAAAAGTCATGACCTCTCGCC 與 VP22-R:
[0068]AATGAATTCTCACTCGACGGGC 擴增基因 VP22，PCR 擴增基因 VP22。PCR 參數同 I)。
[0069]3)步驟I)和步驟2)中得到的PTEN基因與VP22基因各10ng做模板，30 μ I體系進行 PCR，參數:94°C 3min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 10 個循環；72°C 5min。
[0070]4)以步驟3)產物為模板，PTEN-F與VP22-R為引物，50 μ I體系進行PCR，參數同I)。
[0071]將步驟4)得到的產物經DNA序列測定確定構建成功，即對照例3抗腫瘤PTEN-VP22基因序列構建成具有與序列表中SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列95%以上同源性的序列。
[0072]實施例2—實施例1中所得對照例1-3的PTEN-VP22基因對於腫瘤細胞的細胞體外實驗
[0073]將對照例1-3的PTEN-VP22基因、以及PTEN、VP22基因連入真核表達質粒pcDNA3，分別構建成 pcDNA3-PTEN-VP22、pcDNA3_PTEN、pcDNA3_VP22 表達載體。
[0074]細胞實驗一:對乳腺癌細胞BT549的抑制效應
[0075]A、時間效應關係:分另丨」將 Iyg pcDNA3、pcDNA3-PTEN、pcDNA3-VP22、pcDNA3-PTEN-VP22質粒轉染24孔板培養的BT549細胞，另設未轉染的BT549細胞陰性對照組，每組設8個復孔。轉染後細胞繼續培養4h，96孔培養板每孔加入細胞懸液100 μ I(IXlO3個細胞)，於37°C，5%C02條件下培養;分別於24h、48h、72h、84h、96h後，每孔加入10 μ I CCK-8溶液，370C，5%C02孵育2h，酶聯免疫檢測儀測定A450值。將陰性對照組A450值視為I，按下式計算各組細胞的增殖力。
[0076]細胞增殖力=實驗組OD A450值/陰性對照組OD A450值
[0077]實驗數據用平均值土標準差表示，採用單因素方差分析和Student Newman Keuls進行統計分析，結果顯示轉染後24h，各組細胞間的增殖力無顯著差異；轉染後48h、72h、84h、96h，pcDNA3-PTEN-VP22組與其它各組間細胞增殖力差異均具有統計學意義。結果表明，在轉染一定時間後，PTEN-VP22對BT549細胞增殖的抑制效應顯著強於PTEN。
[0078]表1一轉染BT549細胞後不同時間的細胞增值力(人源性PTEN)
[0079]
質粒
\pcDNA3- pcDNA3- pcDNA3-
轉染\pcDNA3
\PTENVP22 PTEN-VP22
後時間 \\
24h 0.147 ±0,00416 0.147 ±0.00623 0.142 + 0.0117 0.155 ±0,0144
48h 0.532 ±0.0124 0.446 ±0.0170 0.349 ± 0.0200 0.250 ± 0.0539
72h 0.747 ± 0.0811 0.604 ± 0.0257 0.634 ± 0.0466 0.281 土 0.0264
84h 0.739 + 0.0401 0,645 ± 0,0685 0,703 ±0.0440 0.569 ± 0.0247
96h 0.337 ±0.0286 0.225 ±0.0118 0317 ±0.0285 0.153 ±0.0119
[0080]表2—轉染BT549細胞後不同時間的細胞增值力(鼠源性PTEN)
[0081]
【權利要求】
1.一種抗腫瘤的PTEN-VP22基因，該基因具有如下序列之一: (i)具有序列表中SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列； (?)具有與(i)限定的核苷酸序列至少95%同源性的序列。
2.包含權利要求1所述的抗腫瘤的PTEN-VP22基因的表達載體。
3.製備權利要求1所述的抗腫瘤的PTEN-VP22基因的方法，包括有如下步驟: 1)以PTENcDNA為模板，進行PCR擴增；擴增中採用的引物PTEN-F: GTCGAATTCATGACAGCCATCATC 與 PTEN-R:
GAGAGGTCATGACTTTTGTAATTTGTGT ； 2)以VP22基因為模板進行PCR擴增；擴增中採用引物VP22-F: TACAAAAGTCATGACCTCTCGCC 與 VP22-R:
AATGAATTCTCACTCGACGGGC ；3)步驟I和步驟2)中得到的PTEN基因與VP22基因按照質量比為1:1進行PCR ； 4)以步驟3)產物為模板為，PTEN-F與VP22-R為引物進行PCR。
4.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於:所述步驟1)、2)和4)中PCR擴增的條件為:94°C 3min ；9 4°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 30 個循環；72°C 5min。
5.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於:所述步驟3)中PCR擴增的條件為:940C 3min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 10 個循環；72°C 5min。
6.權利要求1所述的PTEN-VP22基因在製備治療惡性腫瘤方面藥物中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於:所述惡性腫瘤為乳腺癌。
8.權利要求1所述的抗腫瘤PTEN-VP22基因編碼的蛋白質，該蛋白質具有如下序列之 (i)具有序列表中SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列； (?)具有與(i)限定的胺基酸序列至少95%同源性的序列。
9.權利要求8所述的PTEN-VP22基因編碼的蛋白質在製備治療惡性腫瘤方面藥物中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特徵在於:所述惡性腫瘤為乳腺癌。
【文檔編號】C12N15/12GK104178488SQ201310190582
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月21日 優先權日:2013年5月21日
【發明者】雷軍, 餘嫻, 胥正敏, 李婷婷 申請人:川北醫學院