一種柑橘的基因瞬時表達方法
2023-05-29 00:23:26
專利名稱：一種柑橘的基因瞬時表達方法
技術領域：
本發明涉及一種柑橘的基因表達方法，尤其是涉及一種柑橘的基因瞬時表達方法。
背景技術：
將外源基因轉入生物體中進行有效表達是評價基因功能的重要指標。目前，主要是通過遺傳轉化的方法將外源基因導入柑橘體內。植物遺傳轉化的操作進程實際上是一個組織培育的分化再生過程，其操作複雜；而且因為柑橘是多年生木本植物，再生效率和轉化效率低(< 3%)，使遺傳轉化受到極大的限制。此外，從獲得轉基因抗性芽到成苗的過程周期長，最快也需要4個月時間。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，克服現有柑橘基因表達方法存在的操作複雜，周期長，很難獲得轉基因植株的不足，提供一種操作方便，無需組織培育過程而不受再生效率、 轉化效率低的限制，能快速地使外源基因在墨西哥來檬、檸檬、甜橙、櫳柑等柑橘品種體內表達的方法。本發明解決所述技術問題所採用的技術方案是，一種柑橘的基因瞬時表達方法， 包括以下步驟
(1)農桿菌培養將公知的含有外源基因(^AS)的植物表達載體PBI121、pCAMBIA 1301或pCAMBIA 2301 (優選pCAMBIA 2301)導入公知的農桿菌EHA105中，再將含有植物表達載體 pBI 121、pCAMBIA 1301 或 pCAMBIA 2301 的農桿菌 EHA105 (0D 值為 0. 6)按 0. 5% (V/V)的比例接種於YEB培養基中，在^°C、220rpm條件下振蕩培育16小時，使農桿菌EHA105生長達到對數生長期(0D值0.6)；
(2)菌體收集離心收集菌體並懸浮於緩衝液中，調整農桿菌EHA105菌液濃度OD值為 0. 1 1. 2(優選0. 4)d8°C靜置2小時，取ImL —次性注射器，去掉針頭吸取農桿菌菌液待用；
所述緩衝液成分優選pH5. 6 IOmM 2- (N-嗎啉代)乙磺酸、2mM氯化鎂、150mM乙醯丁
香酮；
(3)注射菌液在柑橘植株上選取剛轉綠的成熟葉片，先用針頭將葉片背面表皮刺破 (不刺穿葉片)，將注射器管口頂住葉片刺破處並推動，將菌液從破損處滲入葉片並擴展到全葉片。注射後1 5天，通過公知的組織化學染色法檢查外源基因在葉片中的表達。本發明之柑橘基因表達技術，操作方便，無需組織培育過程而不受再生效率、轉化效率低的限制，最早能在1天時間內快速地使外源基因在柑橘體內表達，能夠高通量在柑橘中鑑定基因功能，挖潛提高柑橘抗病的基因。
圖1是外源基因gus在墨西哥來檬體內表達； 圖2是外源基因^AS在檸檬體內表達；
圖3是外源基因^AS在甜橙體內表達； 圖4是外源基因gas在櫳柑體內表達。
具體實施例方式以下結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。實施例1
(1)農桿菌培養將公知的含有外源基因(卵·5)的植物表達載體pCAMBIA2301導入公知的農桿菌EHA105中，再將含有植物表達載體的農桿菌EHA105 (0D值0. 6)按0. 5% (V/ V)的比例接種於YEB培養基中，在^°C、220rpm條件下振蕩培育16小時，使農桿菌EHA105 生長達到對數生長期(OD值0. 6 )；
(2)菌體收集離心收集菌體並懸浮於緩衝液中(緩衝液成分為pH5.6 IOmM 2- (N-嗎啉代)乙磺酸、2mM氯化鎂、150mM乙醯丁香酮)，調整菌液濃度OD值為0. 4J8°C靜置2小時，取ImL—次性注射器，去掉針頭吸取農桿菌菌液待用；
(3)注射菌液選取剛轉綠的成熟墨西哥來檬葉片，先用針頭將葉片背面表皮刺破(不刺穿葉片)，將注射器管口頂住葉片刺破處並推動，將菌液從破損處滲入葉片並擴展到全葉片。注射後1天，通過公知的組織化學染色法檢查外源基因在葉片中表達。結果表明(參見圖1)，^ 基因導入墨西哥來檬葉片並表達。實施例2
(1)整個步驟同實施例1，注射葉片為檸檬葉。注射後4天，通過公知的組織化學染色法檢查外源基因(gus)在葉片中表達。結果表明(參見圖2)，^AS基因導入檸檬葉片並表達。實施例3
(1)整個步驟同實施例1，注射葉片為甜橙。注射後4天，通過公知的組織化學染色法檢查外源基因(gus)在葉片中表達。結果表明(圖3)，^AS基因導入甜橙葉片並表達。實施例4
(1)整個步驟同實施例1，注射葉片為櫳柑。注射後4天，通過公知的組織化學染色法檢查外源基因(gvs)在葉片中表達。結果表明(圖4)，^AS基因導入櫳柑葉片並表達。以上所述實施例只是本發明的幾個優選實施例，不得用於解釋對本發明保護範圍的不當限制。
權利要求
1.一種柑橘的基因瞬時表達方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)農桿菌培養將公知的含有外源基因的植物表達載體PBI121、pCAMBIA 1301或 pCAMBIA 2301導入公知的農桿菌EHA105中，再將含有植物表達載體pBI 121、pCAMBIA 1301或pCAMBIA 2301的農桿菌EHA105按0. 5 % (V/V)的比例接種於YEB培養基中，在 28°C,220rpm條件下振蕩培育16小時，使農桿菌EHA105生長達到對數生長期；(2)菌體收集離心收集菌體並懸浮於緩衝液中，調整農桿菌EHA105菌液濃度OD值為 0. 1 1.2二8°C靜置2小時，取ImL—次性注射器，去掉針頭吸取農桿菌菌液待用；(3)注射菌液在柑橘植株上選取剛轉綠的成熟葉片，先用針頭將葉片背面表皮刺破， 將注射器管口頂住葉片刺破處並推動，將菌液從破損處滲入葉片並擴展到全葉片。
2.如權利要求1所述柑橘的基因瞬時表達方法，其特徵在於，步驟(1)，農桿菌EHA105 的OD值為0.6。
3.如權利要求1或2所述柑橘的基因瞬時表達方法，其特徵在於，步驟O)，所述緩衝液成分為pH5. 6 50mM 2-(N-嗎啉代)乙磺酸、2mM磷酸鈉、0. 5wt%葡萄糖、IOOmM乙醯丁香酮。
4.如權利要求1或2所述柑橘的基因瞬時表達方法，其特徵在於，步驟O)，所述緩衝液成分為pH5. 6 IOmM 2- (N-嗎啉代)乙磺酸、2mM氯化鎂、150mM乙醯丁香酮。
5.如權利要求1或2所述柑橘的基因瞬時表達方法，其特徵在於，步驟O)，調整農桿菌EHA105菌液濃度OD值為0. 4。
6.如權利要求3所述柑橘的基因瞬時表達方法，其特徵在於，步驟O)，調整農桿菌 EHA105菌液濃度OD值為0. 4。
7.如權利要求4所述柑橘的基因瞬時表達方法，其特徵在於，步驟O)，調整農桿菌 EHA105菌液濃度OD值為0. 4。
全文摘要
一種柑橘的基因瞬時表達方法，包括以下步驟(1)將公知的含有外源基因的植物表達載體導入農桿菌EHA105中，再將含有植物表達載體的農桿菌EHA105接種於YEB培養基中，振蕩培育16小時，使農桿菌EHA105生長達到對數生長期；(2)離心收集菌體並懸浮於緩衝液中，調整農桿菌EHA105菌液濃度OD值為0.1～1.2，28℃靜置2小時，取1mL一次性注射器，去掉針頭吸取農桿菌菌液待用；(3)在柑橘植株上選取剛轉綠的成熟葉片，用針頭將葉片背面表皮刺破，將注射器管口頂住葉片刺破處並推動，將菌液從破損處滲入葉片並擴展到全葉片。本發明操作方便，無需組織培育過程而不受再生效率、轉化效率低的限制，能快速使外源基因在柑橘體內表達。
文檔編號C12N15/82GK102337291SQ20111021196
公開日2012年2月1日 申請日期2011年7月27日 優先權日2011年7月27日
發明者戴素明, 李大志, 李芳 , 鄧子牛 申請人:湖南農業大學