製備藥用級重組人尿胰蛋白酶抑制劑的方法
2023-05-29 12:23:56 2
專利名稱：製備藥用級重組人尿胰蛋白酶抑制劑的方法
技術領域：
本發明描述了採用重組DNA技術在甲醇酵母(Pichia pastoris)中生產製備一種目前是從人尿液中提取的糖蛋白類藥物------人尿胰蛋白酶抑制劑(Human urinarytrypsin inhibitor，h-UTI)，特別是該生產用甲醇酵母工程菌株的構造、發酵，表達產物的純化、性質確證以及藥效試驗等。
背景技術：
1909年Bauer和Reich等就報導了人尿中存在一種胰蛋白酶抑制劑，也就是所謂的人尿胰蛋白酶抑制劑(Human urinary trypsin inhibitor，h-UTI)，但直到1977年Sumi等才成功地純化出尿液中的這種糖蛋白分子。h-UTI是人血漿中的間-α-胰蛋白酶抑制劑(Inter-α-trypsin inhibitor，I-α-TI)降解產物。研究證實人血漿中的I-α-TI蛋白是由三條重鏈(H1、H2、H3，MW75～80kDa)蛋白分子和一條輕鏈蛋白Bikunin分子(MW 25kDa)經硫酸軟骨素分子共價連接而成的絲氨酸蛋白酶抑制劑複合分子，它代謝轉變後，其中連接有硫酸軟骨素分子的Bikunin分泌到尿液之中，成為h-UTI。因此Bikunin也可以說就是h-UTI的前身，也有稱h-UTI為尿抑素(Ulinastatin)。由於h-UTI分子內有N-糖基化和O-硫酸軟骨素分子修飾，所以，自人尿中提取的h-UTI分子是一種高度糖基化修飾的蛋白，許多研究表明h-UTI的質譜分子量約為25～26kDa，而SDS-PAGE電泳顯示分子量大約在35～45kDa之間，但是通過分子篩測得的分子量卻與人血白蛋白相當，約67kDa左右(Kaczmarczyk，A.，Proteins of the Inter-α-inhibitorFamily---Biosynthesis，Plasma Clearance and Interaction with Extracellular MatrixComponents ISSN 0282-7476，Printed in Sweden by Nina Tryckeri，Uppsala 2003)。
早在1985年，日本就將從人尿中提取的h-UTI用於臨床實踐，而國內1994年廣州天普(Techpool)生化醫藥股份有限公司也將提取的h-UTI用於臨床。h-UTI的主要適應症為急性胰腺炎，慢性胰腺炎的急性發作，急性循環衰竭，腫瘤、休克和外科手術中輔助用藥，防治順鉑化療時對腎功能的損傷，AIDS的輔助治療以及先兆流產的預防和治療等。該提取成分臨床療效明確、副反應小、生產成本低，但是作為從尿中提取的一類藥物，如何避免各種病毒汙染和保證產品的質量穩定性也是一大技術難題。
能採用基因重組的手段獲得重組人尿胰蛋白酶抑制劑(Recombinant HumanUrinary trypsin inhibitor，rh-UTI)是一項能將基礎和應用研究有機結合的工作，但是，早年有報導稱h-UTI糖蛋白分子中的硫酸軟骨素分子是h-UTI發揮胰蛋白酶抑制劑作用的必要部分(Selloum，L.，etal.，Biol.Chem.Hoppe-Seyler，36847～55，1987)，因此，在非哺乳動物細胞表達系統(如，E.coli，酵母)中產生的rh-UTI能不能形成正確的糖基化修飾是非常關鍵的。但是，德國的Bayer Aktiengesellschaft公司1995年申請的美國專利(US5407915，Human bikunin variants as proteinase inhibitors，and medicamentscontaining these)就很好地證明了糖基化並非是其活性所必須的，該專利中還描述了啤酒酵母表達的rh-UTI分子的N-端有嚴重的不均一性問題60％rh-UTI具有天然的N-端，而40％的N-端少一個丙氨酸(Ala)。之後，有許多研究都表明，E.coli重組表達的rh-UTI同樣具對胰蛋白酶等酶抑制作用(Brinkmann，T.，etal J Biol Chem.，272(17)11171～11175，1997)，很明顯，糖基化修飾在h-UTI分子中的作用需要重新審視。不過用現有的酵母或大腸桿菌生產rh-UTI的產量太低，加之蛋白的均一性不能保證，雖有一些研究報導，但是一直沒有規模化生產和動物模型試驗方面的研究報導，因此，有關rh-UTI的臨床價值仍然十分難以確定。
我們將人的h-UTI基因插入到專門的表達載體PICZa-DoI中，就成功地解決了酵母中表達h-UTI均一性以及表達產量不高等技術難題。在酵母中表達的rh-UTI的胺基酸序列(見SEQ-2)、糖基化位點以及二硫鍵連接次序如圖1所示。有關表達載體PICZa-DoI的詳細資料請參考本人2004年4月23日提交的題為「一種利用甲醇酵母系統高效表達tPA等外源蛋白的方法及其表達產物的純化製備技術」(申請號200410017881.4)的專利。
發明內容
1.重組人尿胰蛋白酶抑制劑高表達工程菌株的獲得在甲醇酵母(Pichia pastoris，Pichia methanolica)中我們了進行直接表達rh-UTI的實驗研究，但是表達產量很低，所以將h-UTI基因導入我們申請過專利的融合型表達載體PICZa-DoI的多克隆位點KpnI和NotI之間，得到PICZa-DoI-UTI融合表達載體(見圖2)。有關該融合型表達載體的詳細情況請參見中國專利(申請號200410017881.4)。
表達載體PICZa-DoI-UTI經測序確證序列正確無誤後，按Invitrogen公司的操作手冊中的方法進行轉化、表達篩選就可以得到能表達DoI-UTI融合蛋白的菌株。為能獲得高拷貝的轉化子，採取了特殊的轉化方式將PICZa-DoI-UTI中的DoI-UTI基因用XhoI-NotI雙切出來亞克隆至載體pPIC9和載體pMETaA的XhoI-NotI之間，構造出融合表達載體pPIC9-DoI-UTI和pMETa-DoI-UTI。線性化pPIC9-DoI-UTI表達載體，轉化篩選出GS115型高表達菌株，用線性化pMETa-DoI-UTI表達載體轉化PMAD11型菌株，篩選出高表達的PMAD11型菌株。最後，再用線性化的PICZa-DoI-UTI表達載體電轉化由篩選出的GS115型和PMAD11型高表達菌株製備的感受態，分別鋪板在高Zeocin(≥500ug/ml)的YPD板篩選高抗性克隆，通過這種兩級轉化，就使最終的轉化子的基因拷貝數不斷增加，從理論上說，如此篩選出的工程菌種，GS115型和PMAD11型菌株比X33型菌株的拷貝數要高的多，最終我們根據表達產量的高低，篩選確定了三株GS115-UTI(GS115/pPIC9-pPICZa-DoI-UTI)、X33-UTI(X33/pPICZaDoI-UTI)和PMAD11-UTI(PMAD11/pMETa-pPICZa-DoI-UTI)三個菌株，它們是可以高效表達rh-UTI融合蛋白，具體實現過程見實施例1。
2.重組人尿胰蛋白酶抑制劑的發酵、純化過程研究構造的工程菌種按造Invitrogen的發酵操作手冊中的程序，在30L發酵罐(BioengineeringAG)中進行中試規模的鹽培養基發酵，其中發酵過程的關鍵性參數是pH6.0、30℃、溶氧在20％～30％之間，誘導時間為50小時。誘導結束後離心收集發酵上清液，添加NaCl，用NaOH調節發酵上清液的pH至7.4，添加磷酸鹽至終濃度為50mM，膜過濾即得可用於Ni2+-螯合層析上樣的發酵液。50mM咪唑洗脫下DoI-UTI融合蛋白，脫鹽並將DoI-UTI轉換到腸激酶的酶切緩衝溶液中，酶切完成後再過螯合層析介質和離子交換介質就可以得到純度合乎要求的rh-UTI。
3.重組人尿胰蛋白酶抑制劑的性質確證在甲醇酵母中以融合分泌表達的DoI-UTI，在SDS-PAGE電泳時的表觀分子量約45kDa，這同DoI-UTI融合蛋白的理論分子量40.2kDa相差5kDa左右，大量研究證明DoI分子沒有糖基化修飾等蛋白後修飾發生，所以融合蛋白DoI-UTI分子中增加的5kDa是N-糖基化和O-糖基化等修飾後糖鏈部分。將融合蛋白DoI-UTI酶切，再經過一系列的純化步驟就獲得了143個胺基酸殘基組成糖蛋白分子rh-UTI，其蛋白質部分的理論分子量是15.47kDa，理論等電點pI約為4.545，但是我們在酵母中獲得的rh-UTI分子的MW在23～24kDa之間，實際測定的pI為4.5～5.0之間。雖然大量的實驗研究證明天然和重組的h-UTI對胰蛋白酶、胰凝乳蛋白、彈性蛋白酶、纖維蛋白溶酶、精子酵素(Acrosin)、組織蛋白酶B(Cathepsin)、組織蛋白酶H、溶酶體硫醇蛋白酶(Lysosomalthiol protease)等都有很強的抑制作用，但是我們試驗研究發現天然的h-UTI對腸激酶和凝血酶均不具有抑制作用，這也正是採用融合表達並用腸激酶切割融合蛋白的這一設計思路的實驗基礎。用天普公司生物提取的UTI(注射用烏司他丁)作對照，採用Iketa等方法(Iketa，K.，Agric Biol Chem，42(4)309～312，1978)測定rh-UTI的活性，發現rh-UTI同天然的h-UTI沒有明顯區別。
4.重組人尿胰蛋白酶抑制劑的藥效學試驗rh-UTI具有天然h-UTI的全部功能，它可以抑制許多絲氨酸蛋白酶的活性。具有廣泛的臨床用途，用急性胰腺炎動物模型試驗結果表明，rh-UTI同天然的h-UTI一樣，對急性胰腺炎的診斷、防治和預後應該具有重要意義。
有關縮寫的說明h-UTI是人尿胰蛋白酶抑制劑的英文名Human urinary trypsin inhibitor的縮寫，根據上下文可以是指人尿胰蛋白酶抑制劑蛋白或其基因，本專利中的h-UTI作蛋白含義時特指源於人尿的胰蛋白酶抑制劑，它具有特別的人源性糖基化修飾；DoI是特指人血白蛋白的三個結構域(Domain)中的第一個結構域，所以DoI實質是HSA Domain I的簡寫，是一段多肽，如果是HSA Domain I的基因序列一般會描述為DoI基因或基因片段；DoI-UTI特指由DoI基因和h-UTI基因片段通過連接肽連接而成的融合基因或融合基因表達出的DoI-UTI融合蛋白，一旦切開DoI-UTI融合蛋白後，釋放出來的h-UTI部分就特稱rh-UTI，以區別從尿中提取的天然的h-UTI；rh-UTI是指通過重組DNA技術在非哺乳動物細胞(如E.coli、酵母、昆蟲細胞等)中直接或間接表達出來的有糖基化或沒有糖基化修飾，但具有同天然h-UTI或Bikunin相同或相近的胺基酸序列組成，並且生物學功能也相當的一類基因重組人尿胰蛋白酶抑制劑蛋白分子的通稱，在本專利中rh-UTI特指我們在甲醇酵母中製備的h-UTI，其糖基化修飾具有酵母的特徵。
圖1.rh-UTI蛋白的一級結構☆代表可能的O-糖基化修飾，★代表可能的N-糖基化修飾。
圖2.表達載體PICZa-DoI-UTI圖3.工程菌株在試管中誘導48小時DoI-UTI表達量A.X33-UTI/pPICZaDoI-UTI菌株；B.GS 115-UTI/pPIC9-pPICZaDoI-UTI；C.PMAD11-UTI/pMETa-pPICZaDoI-UTI；M.Pharmacia蛋白標準97kDa、67kDa、45kDa、30kDa、20.1kDa和14.4kDa。
圖4.DoI-UTI的純化和酶切4-1.DoI-UTI融合蛋白的純化a.發酵液；b.螯合層析上樣流出液；c.50mM PB，0.3M NaCl，pH7.4，10mM咪唑；d.50mM PB；e.50mM PB，50mM咪唑；f.50mM PB，100mM咪唑；g.50mM PB，20mM EDTANa24-2.腸激酶切割DoI-UTI融合蛋白0～12hrs代表不同時間取樣圖5.rh-UTI純品的SDS-PAGE電泳A為還原電泳；B為非還原電泳1～6泳道的上樣量依次為2.4ug、4.8ug、7.2ug、9.6ug、12ug和14.4ug。
具體實施例方式
實施例1重組人尿胰蛋白酶抑制劑(rh-UTI)工程菌種的構造1.rh-UTI基因的獲得和表達載體PICZa-DoI-UTI的構造參考Genbank中人Bikunin基因序列，合成hBIK5和hBIK3兩條引物hBIK55`-catggtaccgat gat gat gac aaa gct gtg cta ccc caa gaa gag-3`hBIK35`-catgcggccgctta cag cag ctc ctc atc acc-3`以人正常胎肝組織cDNA(LotA604235，Biochain Institute，Inc)的為模板，按下述體系及條件PCR出人的Bikunin基因片段(見SEQ-1)。
50ul PCR體系cDNA(模板)--------------------------2.0ulhBIK5(正向引物)---------------------5.0ulhBIK3(反向引物)---------------------5.0uldNTP--------------------------------2.5ul10XPfu緩衝液------------------------5.0ulPfu酶-------------------------------0.5uldH2O-------------------------------30ul合計50ulPCR條件94℃-40秒、54.5℃-40秒、73℃-50秒，30輪循環。
PCR結束後取樣電泳可見有約500bp片段(474bp)特徵性片段產生，柱回收PCR產物、KpnI-NotI雙切、1.5％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收470bp的h-UTI基因片段備用。將PICZa-DoI載體用KpnI-NotI雙切並進行膠回收，作插入用載體。將h-UTI基因片段和PICZa-DoI連接，轉化Novagen公司的大腸桿菌NovaBlue感受態，在LB+25ug/ml Zeocin平板上篩選插入h-UTI基因的陽性克隆，用α-Signal Factor和3AOX1引物進行全基因測序，由表達載體中的DoI基因片段和插入的h-UTI基因構成一個融合基因DoI-UTI，該融合基因表達出的融合蛋白的胺基酸序列如SEQ-1和SEQ-3所述，我們特將此表達載體命名為PICZa-DoI-UTI，其結構如圖2。
2.表達載體pPIC9-DoI-UTI和pMETa-DoI-UTI的構造將上述經測序確證的PICZa-DoI-UTI載體用XhoI和NotI雙切，膠回收DoI-UTI基因片段。同時，用XhoI/NotI分別雙切pPIC9和pMETaA並膠回收載體作插入之用，將DoI-UTI和pPIC9或pMETaA分別建立連接反應，篩選插入DoI-UTI基因的克隆，測序確證，得到表達載體pPIC9-DoI-UTI和pMETa-DoI-UTI。
3.轉化篩選高表達的工程菌株DNA限制性內切酶SacI線性處理表達載體PICZa-DoI-UTI，電轉化甲醇酵母(Pichiapastoris)宿主菌X33，鋪板至YPD+500ug/ml Zeocin，30℃培養3天，挑單克隆培養於含有500ug/ml Zeocin的24孔板中，共篩選了96個克隆，30℃培養10小時，肉眼觀察有5個培養孔中的菌生長迅速，密度甚高，這就是高抗性克隆。將這5個孔中的菌液轉入試管中，補加YPD至3ml，繼續培養4小時，按操作手冊中的方法留種，BMMY培養基誘導，每24小時補加甲醇，48小時後終止誘導，取上清SDS-PAGE電泳查看表達量。同非高抗性克隆相比，高抗性的克隆的表達產量明顯高。DoI-UTI表達時的基因劑量效應很明顯。我們將PICZa-DoI-UTI轉化X33得到的高表達菌種稱為X33/pPICZaDoI-UTI，簡稱X33-UTI(見圖3)。
用SacI線性化後的pPIC9-DoI-UTI電轉化GS115His-，鋪MD平板，篩選陽性克隆，常規篩選，電泳檢測表達量高的克隆，共篩選6個克隆，其中有2個克隆表達量比較高，取其中一個克隆，YPD培養製備，將其製備成電轉化用的感受態，按照上述PICZa-DoI-UTI轉化X33類似的方法，用線性化過的PICZa-DoI-UTI載體，對其進行再轉化，將轉化液鋪於含500ug/ml Zeocin的YPD平板上，篩選高抗克隆，這樣就得到整合了更多目的融合基因DoI-UTI的克隆，如此一來，該酵母GS115株就含有pPIC9和PICZa-DoI質粒載體帶入的兩組基因，特將此法篩選出的高表達菌株簡稱GS115-UTI。依此類推，可以篩選出PMAD11-UTI高表達菌株，有關他們的表達情況參見圖3。
實施例2重組人尿胰蛋白酶抑制劑的發酵、純化製備中試發酵純化過程選用了GS115-UTI菌種，按照Invitrogen發酵操作指南中的描述，在30L發酵罐中進行，發酵和純化的全過程(參見圖4和圖5)可簡述為1.種子液的準備菌種劃線於YPD平板上，倒置於30℃培養箱中48小時後，挑一單克隆轉接入裝有25mlYPD培養液的250ml搖瓶中，30℃、280rpm培養18小時至OD600在4～6時，鏡檢酵母形態正常且無雜菌汙染後，按1∶500的比例再轉接入一瓶裝有500ml YPD培養液1L搖瓶中，30℃、280rpm培養18小時，OD600達5-7，鏡檢酵母形態正常且無雜菌汙染後，作為上罐用種子液。
2.增殖及誘導表達階段將上述種子液按1∶20接種至已滅菌後的罐培養基中，進行菌體增殖培養，此階段為菌體增殖階段。當罐培養基中的碳源耗盡後，溶氧(DO)值會在1分鐘內急劇上升，此時繼續流加甘油，流加速率以維持DO值不低於20％為限。此階段稱限速生長階段。當菌體溼重為180～200g/L時停止補料為誘導做準備，待碳源耗盡出現DO急劇上升後，就可以開始補入甲醇，此時轉換成以甲醇為碳源繼續發酵，進入了甲醇酵母發酵的誘導表達階段，通過調節攪拌轉速、罐壓、空氣流量、通氧和流加甲醇速率使溶氧不低於20％，並保持此狀態至發酵結束。由於甲醇酵母發酵過程中能產生較多的酸性物質，所以PH呈下降趨勢，可以通過補加氨水將pH保持在6.0左右，此一過程達到調節pH並補充氮源的雙重目的。
3.發酵上清的獲得及後處理髮酵結束後，4,000rpm轉速離心收集發酵上清，用5.0M的NaCl加入發酵液中，使終濃度約為0.3M，用1N NaOH調節發酵液的pH至7.4，再加入1.0M的PB(Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.4)到終濃度為50mM。Φ0.45nm的膜過濾後即成可以上樣發酵液5.螯合層析從發酵液中直接捕獲DoI-UTI融合蛋白將上述處理好的發酵上清液上樣至經過緩衝液A(50mM PB，0.3M NaCl，pH7.4)平衡過的Chelating Sepharose Fast Flow介質，上樣結束後再用緩衝液A平衡至基線，先用10mM咪唑+緩衝液A洗脫除去吸附的雜質，再用緩衝液B(50mM PB，pH7.4)衝洗3～4個柱體積，將緩衝體系變換成無NaCl的體系，用50mM咪唑+緩衝液B洗脫出DoI-UTI融合蛋白。
6.DoI-UTI的脫鹽處理50mM Tris-HCl，0.2mM CaCl2，pH7.4平衡Sephadex G25柱，每次脫鹽時的上樣體積不超過柱體積的20％。如果規模放大，處理體積大，則用Millipore超濾系統將螯合層析步驟中的目的洗脫峰緩衝液替換成50mM Tris-HCl，0.2mM，CaCl2，pH8.0的緩衝液，便於使用腸激酶進行酶切。
7.腸激酶酶切DoI-UTI融合蛋白釋放rh-UTI分子由於DoI-UTI具有rh-UTI的生物學活性，腸激酶切割融合蛋白後產生的rh-UTI都能夠抑制發酵液和粗純品中的其他蛋白水解酶的活性，所以加大腸激酶的用量也不會產生異常的切割活性。所以DoI-UTI的切割條件對酶量和溫度都沒有特別的要求，在達到酶切效果的前提下，使用最小的酶量，一般按1單位(U)的腸激酶切割40ug的DoI-UTI融合蛋白的比例向融合蛋白溶液中加入重組腸激酶。
8.螯合層析除去酶切混合物中的雜蛋白將酶切後的DoI-UTI溶液過經過20mM PB，pH7.4平衡後的Chelating SepharoseFast Flow介質，收集流出液，其中的沒有完全切割的DoI-UTI融合蛋白和切割釋放出來的DoI等結合到介質上，切割出的rh-UTI就直接流出。
9.陽離子層析濃縮並精純化rh-UTI將上述rh-UTI流出液用冰醋酸下調pH至3.8，上經過50mM的醋酸-醋酸鈉，pH3.8平衡後的SP-Sepharose FF或CM-Sepharose FF，增加NaCl濃度至0.6M，就可以洗脫出介質上結合的rh-UTI蛋白，此步獲得的rh-UTI純度不低於98.7％。
實施例3重組人尿胰蛋白酶抑制劑的性質確證按照實施例2中的方法製備的rh-UTI依據SFDA的質檢標準要求進行了蛋白酶抑制活性、比活性、蛋白純度、分子量測定、等電點、N-端-C-端測序等方面的研究檢測，以確定其基本性質。
1.h-UTI的蛋白酶抑制活性-比活性測定1.1.對胰蛋白酶抑制作用的分析用benzoyl-L-arg-p-NA作底物，按照Geiger等的方法(GeigeFritz，Methods ofEnzymatic Analysis，Vol V，3rded.，Bergmeyer(ed.)，Verlag Chemie，Weinheim，p.121，1984)進行，釋放出的p-NA用分光光度計在405nm波長檢測。酶和抑制劑在添加底物之前預溫15分鐘。結果表明rh-UTI能有效抑制胰蛋白酶的活性。
1.2.對彈性蛋白酶抑制作用的分析人的彈性蛋白酶購自上海生物工程公司，底物選擇MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA(Sigma)，按照Nakajima等描述的方法(Nakajima etal.，J.Biol.Chem.，254，4027，1979)，測定rh-UTI對彈性蛋白酶的抑制率達到95％。
1.3.對腸激酶抑制作用的分析腸激酶有識別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-X-R序列，其中的X是目的蛋白(X-R)的N-端第一個胺基酸殘基，可以是除Pro外的任意胺基酸。我們用pET32a載體表達的硫氧環蛋白-人睫神經營養因子(Trx-CNTF)融合蛋白作為底物，該融合蛋白的Trx和CNTF之間插入有腸激酶識別序列。購買天普公司的商品化注射用烏司他丁，按0.5萬、4萬和8萬位添加到酶切反應液中，每隔4小時取樣，電泳檢測Trx-CNTF融合蛋白被腸激酶切割的情況，電泳結果表明，天然的UTI對腸激酶的活性沒有任何抑制作用，甚至高達8萬單位的UTI也沒有抑制作用，這正是本項目採用融合表達，並選擇腸激酶切割融合蛋白這一設計思路的基礎。
1.4凝血酶抑制作用的分析首先配製濃度為0.2mg/ml的人纖維蛋白原，5ATU/ul的人凝血酶作測定用。人凝血酶為絲氨酸蛋白酶，添加至人纖維蛋白原中可以切割纖維蛋白原，將其轉變成纖維蛋白，進而聚集凝固成纖維蛋白凝塊。向人纖維蛋白原溶液中分別添加1萬、3萬、6萬和10萬單位的烏司他丁或rh-UTI後，再加入人凝血酶，發現纖維蛋白原均在1～2分鐘內凝固。可見，烏司他丁和rh-UTI對凝血酶沒有抑制作用。
1.5.rh-UTI的比活性測定參照Iketa等測定方法(Iketa，K.，Agric Biol Chem，42(4)309～312，1978)測定，用注射用烏司他丁作藥品作對照品，最終測得rh-UTI的比活為2,500U/mg，同天然烏司他丁(2,000～3,000U/ml)沒有明顯區別。
2.蛋白純度、分子量測定、等電點以及N-端-C-端測序測定採用HPLC法和SDS-PAGE還原和非還原電泳的方法檢定純度，通過本專利中描述的工藝製備出的rh-UTI的純度不低於98.7％。HPLC的採用十八烷基鍵合矽膠為填充劑，理論塔板數不低於2000的色譜柱。以A相(0.1％三氟醋酸-水溶液)、B相(0.1％三氟醋酸-乙腈溶液)為流動相，在室溫條件下，進行梯度洗脫(0～70％B相)，檢測波長280nm。按歸一化法計算，主峰面積顯示純度達99.92％，保留時間為10.49分鐘；SDS-PAGE電泳顯示分子量約為23～24kDa，質譜測定分子量為24kDa；等電聚焦測定pI為4.4～5.0之間。N-端測序結果為Ala-Val-Leu-Pro-Gln-Glu-Glu-Glu-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gln-Leu-，C-端測序結果為--Glu-Leu-Leu。
實施4重組人尿胰蛋白酶抑制劑的活性測定和藥效試驗根據李濤等建立急性胰腺炎動物模型的方法(中國比較醫學雜誌13(6)358～361，2003)，採用膽總管末端結紮法建立Wistar大鼠急性胰腺炎模型，具體過程如下1.方法Wistar大鼠66隻，隨機挑6隻為正常組，其餘60隻在手術顯微鏡下進行膽總管末端結紮，建立實驗性急性胰腺炎動物模型，將60隻模型動物隨機均分為三組rh-UTI治療組、烏司他丁治療組和非治療組。觀察組織病理變化，並檢測血清澱粉酶和血糖的變化。
2.實驗結果血清澱粉酶和血糖變化比較(x±S)(與正常組比P＜0.05，治療組間P＜0.01)
3.結論rh-UTI組的治療效果同烏司他丁組沒有顯著差異，實驗急性胰腺炎模型的血糖在前48小時仍在正常範圍，但96小時後未治療組的血糖受影響顯著，而rh-UTI和烏司他丁治療組動物的血清胰澱粉酶和血糖均接近正常值。
蛋白質和DNA序列描述SEQ-1序列的資料(1).序列特徵a.長度461bpb.類型核苷酸c.拓撲學線性(2).分子類型人cDNA(3).序列描述SEQ-11 GGTACCGATG ATGATGACAA AGCTGTGCTA CCCCAAGAAG AGGAAGGATC51 AGGGGGTGGG CAACTGGTAA CTGAAGTCAC CAAGAAAGAA GATTCCTGCC
101 AGCTGGGCTA CTCGGCCGGT CCCTGCATGG GAATGACCAG CAGGGTATTTC151 TATAATGGTA CATCCATGGC CTGTGAGACT TTCCAGTACG GCGGCTGCAT201 GGGCAACGGT AACAACTTCG TCACAGAAAA GGAGTGTCTG CAGACCTGCC251 GAACTGTGGC GGCCTGCAAT CTCCCCATAG TCCGGGGCCC CTGCCGAGCC301 TTCATCCAGC TCTGGGCATT TGATGCTGTC AAGGGGAAGT GCGTCCTCTT351 CCCCTACGGG GGCTGCCAGG GCAACGGGAA CAAGTTCTAC TCAGAGAAGG401 AGTGCAGAGA GTACTGCGGT GTCCCTGGTG ATGGTGATGA GGAGCTGCTG451 TAAGCGGCCG CSEQ-2序列的資料(1).序列特徵a.長度143胺基酸b.類型胺基酸c.拓撲學未知(2).分子類型蛋白質(3).序列描述SEQ-21 Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Gly Gly Gln Leu 1516 Val Thr Glu Val Thr Lys Lys Glu Asp Ser Cys Gln Leu Gly Tyr 3031 Ser Ala Gly Pro Cys Met Gly Met Thr Ser Arg Tyr Phe Tyr Asn 4546 Gly Thr Ser Met Ala Cys Glu Thr Phe Gln Tyr Gly Gly Cys Met 6061 Gly Asn Gly Asn Asn Phe Val Thr Glu Lys Glu Cys Leu Gln Thr 7576 Cys Arg Thr Val Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro 9091 Cys Arg Ala Phe Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly 105106 Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn 120121 Lys Phe Tyr Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro 135136 Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu 143SEQ-3序列的資料(1).序列特徵a.長度365基酸b.類型胺基酸
c.拓撲學未知(2).分子類型蛋白質(3).序列描述SEQ-31 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly 1516 Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr 3031 Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu 4546 Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu 6061 Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys 7576 Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Lys Met Ala Asp Cys 9091 Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln Leu 105106 Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 120121 Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Ash Glu Glu Thr Phe Leu 135136 Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr 150151 Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe 165166 Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro 180181 Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Gly 195196 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His 210211 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Val Leu 225226 Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Gly Gly Gln Leu Val Thr Glu 240241 Val Thr Lys Lys Glu Asp Ser Cys Gln Leu Gly Tyr Ser Ala Gly 255256 Pro Cys Met Gly Met Thr Ser Arg Tyr Phe Tyr Asn Gly Thr Ser 270271 Met Ala Cys Glu Thr Phe Gln Tyr Gly Gly Cys Met Gly Asn Gly 285286 Asn Asn Phe Val Thr Glu Lys Glu Cys Leu Gln Thr Cys Arg Thr 300301 Val Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala 315316 Phe Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val 330331 Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr 345346 Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly 360361 Asp Glu Glu Leu Leu 36權利要求
1.一種由基因工程酵母菌株分泌的融合蛋白，通過純化製備過程後得到具有醫藥用途的重組人尿胰蛋白酶抑制劑(rh-UTI)分子，該分子具有生物學活性、特定的酵母糖基化修飾以及SEQ-2所描述的胺基酸序列組成等特徵；
2.權利要求1中的所述的基因工程酵母菌株可以是Pichia pastoris、Pichia methanolica、Hansenula polymorpha和Saccharomyces cerevisiae等；
3.權利要求1中所述的融合蛋白是由人血白蛋白(HSA)的第一結構域通過含有(His)6和腸激酶切點等序列的肽段與rh-UTI連接形成，其胺基酸序列組成如SEQ-3所描述；
4.權利要求1中所述的純化製備過程具體包括螯合親和層析捕獲、腸激酶酶切融合蛋白和陽離子交換層析精純化等步驟；
5.根據權利要求4，其螯合親和層析介質為Chelating Sepharose FF，捕獲融合蛋白時首選金屬離子Ni2+、Zn2+，最後使用含咪唑的緩衝液選擇性的洗脫目的蛋白；
6.權利要求5中的洗脫緩衝液由20～100mM Na2HPO4-NaH2PO4和20～100mM咪唑組成，pH6.8～8.0；
7.權利要求6中的最適合洗脫緩衝液為50mM Na2HPO4-NaH2PO4，50mM咪唑，pH7.4；
8.權利要求1中所述的特定的酵母糖基化修飾包括N-糖基化和O-糖基化等修飾方式，其糖基化修飾具有酵母的糖鏈特徵和單糖組成；
9.根據權利要求1，rh-UTI不具有對腸激酶和凝血酶的有抑制活性；
10.權利要求1中所述的醫藥用途是指本方法製備的rh-UTI可以用於急性胰腺炎，慢性胰腺炎的急性發作，腫瘤、休克和外科手術中輔助用藥以及防治順鉑化療時對腎功能的損傷等。
全文摘要
從尿液中提取的人尿胰蛋白酶抑制劑(Humanurinary trypsin inhibitor，h－UTI)已經在臨床中得到廣泛地應用。本發明描述如何在甲醇酵母中構造可以分泌表達重組人尿胰蛋白酶抑制劑(Recombinant human urinary trypsin inhibitor，rh－UTI)融合蛋白的工程菌株，以及經過發酵、粗純化、酶切、精純化和一系列性質對比試驗，最終確定了產量、純度及藥效學特徵均合乎規模生產和臨床應用要求的工程菌株以及rh－UTI生產製造工藝。
文檔編號C07K14/81GK1715409SQ200410025560
公開日2006年1月4日 申請日期2004年6月29日 優先權日2004年6月29日
發明者黃秀東 申請人:黃秀東