一步法反轉錄pcr檢測和分型伊波拉病毒5種亞型的引物、探針及試劑盒的製作方法

2023-05-29 12:09:21

一步法反轉錄pcr檢測和分型伊波拉病毒5種亞型的引物、探針及試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種一步法反轉錄PCR檢測和分型伊波拉病毒5種亞型的引物、探針及試劑盒,引物和探針的核苷酸序列如圖1-圖8,試劑盒包括樣品DNA模板或者定量標準試劑、PCR緩衝液、FRET-上遊引物、FRET-下遊引物、的6-FAM探針、LCRed640探針、商業化Taq酶、dNTP、商業化反轉錄酶、商業化RNA酶抑制劑。本發明依據伊波拉病毒5種亞型中保守區間巧妙地設計1條上遊引物、1對探針和5條針對五種伊波拉病毒亞型的下遊引物，從而可以同時檢測5種亞型的伊波拉病毒。
【專利說明】-步法反轉錄PCR檢測和分型伊波拉病毒5種亞型的引物、 探針及試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】，特別涉及一種基於伊波拉病毒保守區間、可以對埃博 拉病毒5種亞型進行檢測和分型的引物、探針及試劑盒。

【背景技術】
[0002] 伊波拉病毒病（Ebola virus disease, EVD)是由伊波拉病毒（Ebola virus，ElBOV) 引起的一種傳染性強、死亡率極高的急性出血性、人與非人靈長類動物共患的傳染病。因 1976年在非洲剛果民主共和國（前薩伊）北部的伊波拉河（Ebola)沿岸首次暴發流行 而得名。EVD的主要特徵是發熱迅速，頭痛和肌肉疼痛，之後產生咽喉腫痛，噁心，嘔吐腹瀉 以及腹痛，將近一半病人會出現出血症狀。此病發病急，病程短，死亡率高達30% -90%，是 一種烈性病毒性傳染病。EVD目前呈現地方性流行，主要流行於非洲大陸，我國尚未有本病 的報導。EBOV已經通過非人靈長類動物試驗證實可以通過接觸傳播和空氣傳播。因此，自 然界各種因素都有可能造成EVD的爆發。EVD的病原體為EB0V，在分類上屬於絲狀病毒科 (Filoviridae)、伊波拉病毒屬（Ebolavirus)成員，為單股負鏈非節段RNA病毒。目前埃 博拉病毒有5種不同的亞型：伊波拉薩伊型（Zaire ebolavirus)，伊波拉蘇丹型（Sudan ebolavirus)，伊波拉本迪布焦型（Bundibugyo ebolavirus)，伊波拉塔伊森林型（Tai Forest ebolavirus)，伊波拉萊斯頓型（Reston ebolavirus)。目前伊波拉病毒的常用檢測 方法有：
[0003] (1)電鏡檢測。取病人或猴的病料接種於Vero-98等細胞，37°C培養6-7天後鏡 檢。或者，取病人或猴的病變臟器用電子顯微鏡直接觀察病毒的形態結構。電鏡檢測方法 需要固定、脫幹、墊入、分割和染色等步驟，耗時相對較長，而且伊波拉病毒與馬爾堡病毒同 為絲狀病毒科，具有相似的形態，容易產生誤診，同時對操作人員要求也較高。
[0004] (2)血清學檢測。血清學試驗多採用免疫螢光技術，另外還建立了固相間接免疫酶 試驗、放射免疫試驗、酶聯免疫吸附試驗和蝕斑減少中和試驗等方法。血清學檢測方法的基 礎是抗原抗體的特異反應。如檢測抗原，除了要求抗體為單抗或多抗，是特異的外，還要求 待測抗原上必須存在有能與所用抗體結合的抗原決定簇，如果因為基因突變導致某些位點 的不表達，或者結合位點因為某些原因被封閉或阻斷，都會影響抗體與抗原的結合，造成假 陰性結果；如檢測抗體，則要求所用包被抗原應儘可能包含所有的特異抗原決定簇，同時又 儘可能不含有非特異的成分，這一點往往由於技術水平的限制而難以完全做到。另外，不同 伊波拉病毒亞型以及伊波拉病毒和絲狀病毒科其他病毒之間存在交叉反應。因此，從某種 意義上來說，血清學實驗的假陽性和假陰性是不能完全避免的，從而影響了實驗的準確性。
[0005] (3)分子生物學檢測。此類檢測方法以PCR檢測為主，尤其是反轉錄PCR(reverSe transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)技術的發展，為快速、準確地檢測埃 博拉病毒以及其他傳染病提供了更可靠的診斷方法。RT-PCR方法可以在病毒感染的各個 時期（尤其是抗體產生初期）的各種臨床樣品中檢測到病毒核酸，這就為傳染病尤其是像 伊波拉病毒病這種烈性傳染病的預防、診斷和控制奠定了基礎。但目前為止，仍然沒有一種 RT-PCR方法可以同時檢測和分型所有5種伊波拉病毒亞型。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種高度靈敏、特異、快速檢測和分型伊波拉病毒5種亞型 的引物、探針及試劑盒，同時確保此系統不擴增其它非伊波拉病毒的微生物，尤其是與其 相近的其他病原體，如馬爾堡病毒（Marburg virus)等。
[0007] 為實現上述目的，本發明採用以下技術方案：
[0008] 本發明的原理和最核心的思路是發明一種高度靈敏、特異、快速檢測和分型埃博 拉病毒5種亞型的方法體系，同時確保此系統不擴增其它非伊波拉病毒的微生物，尤其是 與其相近的其他病原體，如馬爾堡病毒（Marburg virus)等。本發明選擇伊波拉病毒保守的 區域設計引物（1條上遊引物和5條針對五種伊波拉病毒的下遊引物）和探針（1條6-FAM 探針和1條LCRed640探針）。總體的思路是：巧妙地設計RT-PCR的引物和探針，可以特 異地擴增伊波拉5種亞型（薩伊型、蘇丹型、萊斯頓型、塔伊森林型和本迪布焦型）的核 酸，並可依據其高解析度熔解曲線或瓊脂糖凝膠電泳中目的條帶大小的不同區分5種亞型 的伊波拉病毒。因此，此系統不僅能快速、特異的檢測到所有亞型伊波拉病毒，而且能根據 RT-PCR熔解曲線Tm值的差異區分伊波拉病毒的5種亞型（薩伊型、蘇丹型、萊斯頓型、塔 伊森林型和本迪布焦型）；同時，對於僅有普通PCR儀的診斷實驗室也可以根據PCR產物在 瓊脂糖凝膠電泳中目的條帶大小的不同區分5種亞型：伊波拉病毒薩伊型（255bp)、蘇丹 型（211bp)、本迪布焦型（192bp)、塔伊森林型（166bp)、萊斯頓型（146bp)。
[0009] 從GenBank (www. ncbi. nlm. nih. gov)獲取如下伊波拉病毒5個亞型的全基 因序列後，用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法對所有序列進行比 對：Bundibugyo ebolavirus KC545396, Bundibugyo ebolavirus NC_014373, Reston ebolavirus JX477166, Reston ebolavirus NC_004161, Sudan ebolavirus KC545390, Sudan ebolavirus NC_006432,Tai Forest ebolavirus FJ217162,Tai Forest ebolavirus NC_014372, Zaire ebolavirus KC242801，Zaire ebolavirus NC_002549。據此，設計的引 物和探針的核苷酸序列如下（圖I-圖8):
[0010] 上遊引物：5 ' -CGGACACACAAAAAGAAAGAAG-3 '
[0011] 6-FAM 探針：5 ' -6FAM-TAGTTAYTCGCACACAAWARRK-磷酸-3 '
[0012] LCRed640 探針：5 ' -GAGGAAAATTDTTAATCTTCCTC-LCRed640-3 '
[0013] Z-下遊引物（EB0V 薩伊型）：5' -GAACTTGTGATGTGATAAGACCTA-3'
[0014] S-下遊引物（EB0V 蘇丹型）：5 ' -AAAGGCAAAGCAATACGACC-3 '
[0015] R-下遊引物（EB0V 萊斯頓型）：5 ' -CATGTTGATGGTAATTGGTAATAG-3 '
[0016] T-下遊引物（EB0V 塔伊森林型）：5' -GGAATGGGGTACTTCTGAACA-3'
[0017] B-下遊引物（EB0V 本迪布焦型）：5' -GCCAATTCTCAGTGTTGGTATT-3'。
[0018] 本發明還提供了一種一步法反轉錄PCR檢測和分型伊波拉病毒5種亞型的試劑 盒，其技術方案如下：
[0019] 一種一步法反轉錄PCR檢測和分型伊波拉病毒5種亞型的試劑盒，包括樣品DNA 模板或者定量標準試劑、PCR緩衝液、FRET-上遊引物、FRET-下遊引物、的6-FAM探針、 LCRed640探針、商業化Taq酶、dNTP、商業化反轉錄酶、商業化RNA酶抑制劑。
[0020] 本發明還提供了一種一步法反轉錄PCR檢測和分型伊波拉病毒5種亞型的方法， 其技術方案如下：
[0021] 用上述的引物和探針，特異地擴增伊波拉5種亞型的核酸，伊波拉5種亞型分別為 薩伊型、蘇丹型、萊斯頓型、塔伊森林型和本迪布焦型，並可依據其高解析度熔解曲線或 瓊脂糖凝膠電泳中目的條帶大小的不同區分5種亞型的伊波拉病毒。
[0022] 本發明伊波拉RT-PCR特異性的確定。
[0023] 本發明的特異性從三個方面得到保證：
[0024] (1)設計的引物和探針經過NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)的BLAST搜索， 確認本發明設計的引物能特異地擴增5種伊波拉病毒亞型（薩伊型、蘇丹型、萊斯頓型、 塔伊森林型和本迪布焦型），而不擴增其它非伊波拉病毒尤其是與其相近種屬病原體的核 酸。通過BLAST確認，RT-PCR探針和引物能特異地擴增和檢測所有伊波拉病毒的核酸，但 不擴增絲狀病毒科的其他病毒核酸；
[0025] (2)本發明檢測載有伊波拉5種亞型（薩伊型、蘇丹型、萊斯頓型、塔伊森林型和 本迪布焦型）DNA序列的五種質粒標準品。結果表明，本發明系統可以特異、高效、穩定地擴 增所有亞型的伊波拉病毒DNA (圖9-圖13);
[0026] (3)觀察以上擴增對象在PCR過程中螢光強度（640nm)的變化，以及PCR擴增產物 在瓊脂糖凝膠電泳的條帶的大小。螢光在640nm波長處出現或增強，顯示陽性；在瓊脂糖凝 膠電泳中，EBOV薩伊型、蘇丹型、萊斯頓型、塔伊森林型和本迪布焦型分別顯示255、211、 192、166和146鹼基對（bp)的條帶大小（圖9-圖13,圖16);
[0027] 本發明伊波拉RT-PCR靈敏度的確定。
[0028] 由金斯瑞（金斯瑞生物科技，中國南京）合成伊波拉病毒5個亞型（薩伊型、蘇 丹型、萊斯頓型、塔伊森林型和本迪布焦型）目的片段的DNA序列。依據合成物的分子量和 絕對重量，計算合成物所含的基因拷貝的絕對數目。隨後，對合成物進行稀釋，製備每10 μ 1 合成物的稀釋試劑含10, 〇〇〇拷貝、1，〇〇〇拷貝、100拷貝、10拷貝、1拷貝的基因。用本發明 系統擴增含不同基因濃度的稀釋液，來確定本發明檢測此基因的靈敏度。結果顯示，此發明 可以在反應系統中擴增單拷貝的目的基因（圖9-圖13)。
[0029] 本發明中反轉錄PCR體系效率的確定。
[0030] 從雞胚尿囊液中提取禽流感病毒（HlNl)RNA後，對其進行梯度稀釋後，選取 KT3-KT8進行反轉錄PCR擴增。結果表明，本發明的反轉錄PCR體系可以檢測到反應體系 中KT 7拷貝的禽流感病毒RNA分子（圖15)。
[0031] 本發明的有益效果是：
[0032] 本發明選擇伊波拉病毒保守的區域設計引物（1條上遊引物和5條針對五種埃博 拉病毒的下遊引物）和探針（1條6-FAM探針和1條LCRed640探針）。總體的思路是：巧 妙地設計RT-PCR的引物和探針，可以特異地擴增伊波拉5種亞型（薩伊型、蘇丹型、萊 斯頓型、塔伊森林型和本迪布焦型）的核酸，並可依據其高解析度熔解曲線或瓊脂糖凝膠 電泳中目的條帶大小的不同區分5種亞型的伊波拉病毒。因此，此系統不僅能快速、特異的 檢測到所有亞型伊波拉病毒，而且能根據RT-PCR熔解曲線Tm值的差異區分伊波拉病毒的 5種亞型（薩伊型、蘇丹型、萊斯頓型、塔伊森林型和本迪布焦型）；同時，對於僅有普通 PCR儀的診斷實驗室也可以根據PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳中目的條帶大小的不同區分5 種亞型：伊波拉病毒薩伊型（255bp)、蘇丹型（211bp)、本迪布焦型（192bp)、塔伊森林型 (166bp)、萊斯頓型（146bp)。
[0033] 1)本發明可以特異性地檢測所5種伊波拉病毒亞型。伊波拉病毒在分類上屬於 絲狀病毒科、伊波拉病毒屬成員，為單股負鏈非節段RNA病毒。目前伊波拉病毒分成5種不 同的亞型：EBOV薩伊型，EBOV蘇丹型，EBOV本迪布焦型，EBOV塔伊森林型，EBOV萊斯頓 型。大部分亞型的伊波拉病毒都有一定的致病性，因此,能夠同時檢測到伊波拉病毒所有型 很重要。同時，檢測到所有的種可以更方便的發現新的伊波拉的種或株，並及時的更新埃博 拉病毒的分類，從而更好地認識該病原體。另外，本發明體系不會擴增其他引起與伊波拉病 毒病有相似臨床症狀其他傳染病的病原體，如登革熱、基孔肯雅熱等，從而可以更好地採取 治療和控制措施。
[0034] 2)本發明極具高靈敏度。在病毒感染的早期或恢復期，機體內病毒的含量相對較 低，這就需要靈敏度、準確度更高的檢測方法，從而能夠及時、快速地診斷、監控和控制傳染 病（尤其像伊波拉病毒病這種急性烈性傳染病）。本發明反轉錄PCR體系可以檢測到單拷 貝的質粒核酸（載有伊波拉病毒5種亞型的DNA核酸），同時可以有效地擴增最低KT 7流 感病毒HlNl的RNA核酸（從雞胚尿囊液中製備的RNA核酸標準品）。
[0035] 3)本發明可以對5種亞型的伊波拉病毒進行分型。不同型別病毒的毒力差異很 大，其中伊波拉薩伊型毒力最強，人感染後死亡率可達80 %以上；伊波拉蘇丹型次之，人 的感染死亡率在50%左右；伊波拉本迪布焦型的致死率超過30% ;伊波拉塔伊森林型對非 人靈長類動物有致死性，對人感染性很弱；伊波拉萊斯頓型目前還沒有感染人的報導。因 此，確定伊波拉病毒亞型從而採取相應的治療和控制措施，將對流行地區伊波拉病毒病的 預防和爆發地區本病的快速診斷和及時控制具有重大意義。
[0036] 4)本發明操作便捷、適合於檢測大量樣本。由於伊波拉病毒病是一種傳染性和死 亡率極高的急性烈性出血性傳染病。人感染伊波拉病毒後，發病急，病程短，死亡率高。本 發明可以快速、準確地檢測到5種亞型伊波拉病毒，並能根據RT-PCR熔解曲線Tm值的不同 快速地區分伊波拉病毒的5種亞型（薩伊型、蘇丹型、萊斯頓型、塔伊森林型和本迪布焦 型）；同時也可以根據PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳中目的條帶大小的不同區分5種亞型：埃 博拉病毒薩伊型（255bp)、蘇丹型（211bp)、本迪布焦型（192bp)、塔伊森林型（166bp)、萊 斯頓型（146bp)。因此，在伊波拉病毒病暴發時，能夠快速、準確對大量臨床樣品進行檢測並 確診感染的伊波拉病毒亞型。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1是本發明的反轉錄PCR的上遊引物；反轉錄PCR上遊引物序列：5'_CGGACACAC AAAAAGAAAGAAG-3'（22bp)。此引物序列與EBOV塔伊森林型和薩伊型完全吻合，而與EBOV 本迪布焦型、萊斯頓型和蘇丹型都有1個錯配鹼基。
[0038] 圖2是本發明的反轉錄PCR的6-FAM探針；反轉錄PCR的6-FAM探針序列：5'-6-F AM-TAGTTAYTCGCACACAAWARRK-phosphate-3'（22bp)，此序列為圖中獲得序列的對稱鏈核苷 酸序列。此探針序列中有4種兼併鹼基Y、W、R和K，其中兼併鹼基Y可以同時擴增T和C 鹼基，兼併鹼基W可以同時擴增A和T鹼基，兼併鹼基R可以同時擴增A和G鹼基，兼併鹼 基K可以同時擴增G和T鹼基。因此，此探針序列和5種伊波拉病毒亞型完全吻合。
[0039] 圖3是本發明的反轉錄PCR的LCRed640探針；反轉錄PCR的LCRed640探針序列： 5' -GAGGAAAATTDTTAATCTTCCTC-LCRed640-3'（23bp)，此序列為圖中獲得序列的對稱鏈核苷 酸序列。此LCRed640探針序列種有1個兼併鹼基D，兼併鹼基D可以同時擴增G、A和T鹼 基。因此，此LCRed640探針序列與EBOV薩伊型和塔伊森林型完全吻合，而與EBOV蘇丹 型、本迪布焦型和萊斯頓型各有1個錯配鹼基。
[0040] 圖4是本發明的定量反轉錄PCR的EBOV薩伊型下遊引物；反轉錄PCR的EBOV 薩伊型下遊引物序列：5' -GAACTTGTGATGTGATAAGACCTA-3'（24bp)，此序列為圖中獲得序 列對稱鏈的核苷酸序列。此下遊引物序列只與EBOV薩伊型完全吻合，與EBOV蘇丹型有 14個錯配鹼基；與本迪布焦型有16個錯配鹼基；與塔伊森林型有16個錯配鹼基；與萊斯頓 型有15個錯配鹼基。
[0041] 圖5是本發明的定量反轉錄PCR的EBOV蘇丹型下遊引物；反轉錄PCR的EBOV蘇丹 型下遊引物序列：5 ' -AAAGGCAAAGCAATACGACC-3 '（20bp)，此序列為圖中獲得序列對稱鏈的 核苷酸序列。此下遊引物序列只與EBOV蘇丹型完全吻合，與其他伊波拉病毒亞型有10-16 個錯配/缺失喊基。
[0042] 圖6是本發明的定量反轉錄PCR的EBOV萊斯頓型下遊引物；反轉錄PCR的EBOV 萊斯頓型下遊引物序列：5' -CATGTTGATGGTAATTGGTAATAG-3'（24bp)，此序列為圖中獲得序 列對稱鏈的核苷酸序列。此下遊引物序列只與EBOV萊斯頓型完全吻合，與其他伊波拉病毒 亞型有13-15個錯配鹼基。
[0043] 圖7是本發明的定量反轉錄PCR的EBOV塔伊森林型下遊引物；反轉錄PCR的EBOV 塔伊森林型下遊引物序列：5'-GGAATGGGGTACTTCTGAACA-3'（21bp)，此序列為圖中獲得序列 對稱鏈的核苷酸序列。此下遊引物序列只與EBOV塔伊森林型完全吻合，與其他伊波拉病毒 亞型有10-11個錯配鹼基。
[0044] 圖8是本發明的定量反轉錄PCR的EBOV本迪布焦型下遊引物；反轉錄PCR的EBOV 本迪布焦型下遊引物序列：5' -GCCAATTCTCAGTGTTGGTATT-3'（22bp)，此序列為圖中獲得序 列對稱鏈的核苷酸序列。此下遊引物序列只與EBOV本迪布焦型完全吻合，與其他伊波拉病 毒亞型有11-22個錯配/缺失鹼基。
[0045] 圖9是伊波拉病毒薩伊型的擴增曲線㈧和熔解曲線⑶；擴增曲線㈧表明 本發明系統可以檢測到反應體系中單拷貝的伊波拉病毒薩伊型DNA分子，且具有可重複 性；熔解曲線（B)表明本發明系統對於伊波拉病毒薩伊型具有穩定的Tm值。
[0046] 圖10是伊波拉病毒蘇丹型的擴增曲線㈧和熔解曲線⑶；擴增曲線㈧表明本 發明系統可以檢測到反應體系中單拷貝的伊波拉病毒蘇丹型DNA分子，且具有可重複性； 熔解曲線（B)表明本發明系統對於伊波拉病毒蘇丹型具有穩定的Tm值。
[0047] 圖11是伊波拉病毒萊斯頓型的擴增曲線㈧和熔解曲線⑶；擴增曲線㈧表明 本發明系統可以檢測到反應體系中單拷貝的伊波拉病毒萊斯頓型DNA分子，且具有可重複 性；熔解曲線（B)表明本發明系統對於伊波拉病毒萊斯頓型具有穩定的Tm值。
[0048] 圖12是伊波拉病毒塔伊森林型的擴增曲線㈧和熔解曲線⑶；擴增曲線㈧表 明本發明系統可以檢測到反應體系中單拷貝的伊波拉病毒塔伊森林型DNA分子，且具有可 重複性；熔解曲線（B)表明本發明系統對於伊波拉病毒塔伊森林型具有穩定的Tm值。
[0049] 圖13是伊波拉病毒本迪布焦型的擴增曲線㈧和熔解曲線⑶；擴增曲線㈧表 明本發明系統可以檢測到反應體系中單拷貝的伊波拉病毒本迪布焦型DNA分子，且具有可 重複性；熔解曲線（B)表明本發明系統對於伊波拉病毒本迪布焦型具有穩定的Tm值。
[0050] 圖14是伊波拉病毒5種亞型的熔解曲線；烙解曲線表明本發明系統對於伊波拉病 毒薩伊型、蘇丹型、本迪布焦型、塔伊森林型和萊斯頓型具有穩定的Tm值，同時依據Tm值 的不同區分為5種伊波拉病毒亞型（薩伊型、蘇丹型、萊斯頓型、塔伊森林型和本迪布焦 型）。
[0051] 圖15是本發明中反轉錄PCR體系的擴增曲線㈧和熔解曲線⑶；將從雞胚尿囊 液中提取的流感病毒RNA(HlNl)進行梯度稀釋，本發明中的反轉錄PCR可以檢測到KT 7拷 貝，且具有可重複性（A);所有稀釋梯度表現出穩定的熔解曲線（B)。
[0052] 圖16是本發明定量FRET-PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳的條帶；圖中共8條泳道， 其中泳道-1為標準品，泳道-2至泳道-6分別為伊波拉病毒薩伊型（EBOV-Z)、蘇丹型 (EBOV-S)、萊斯頓型（EBOV-R)、塔伊森林型（EBOV-T)和本迪布焦型（EBOV-B)，泳道-7為 陰性對照（NC);泳道-8為本發明擴增5種EBOV亞型質粒混合物的擴增產物。本試驗所使 用的標準品為 20bp DNA Ladder，其條帶大小依次為 20bp，40bp，60bp，80bp，100bp，120bp， 140bp，160bp，180bp，200bp，300bp。本發明PCR產物中，伊波拉病毒薩伊型、蘇丹型、萊 斯頓型、塔伊森林型和本迪布焦型的條帶大小分別為255bp，211bp，192bp，166bp和146bp。

【具體實施方式】
[0053] 下面結合【具體實施方式】及附圖對本發明做進一步說明。
[0054] 1.伊波拉病毒FRET-PCR檢測方法所用引物和探針的核苷酸序列如下：
[0055] 上遊引物：5，-CGGACACACAAAAAGAAAGAAG-3，
[0056] 6-FAM 探針：5 ' -6FAM-TAGTTAYTCGCACACAAWARRK-磷酸-3 '
[0057] LCRed640 探針：5' -GAGGAAAATTDTTAATCTTCCTC-LCRed640-3'
[0058] Z-下遊引物（EB0V 薩伊型）：5' -GAACTTGTGATGTGATAAGACCTA-3'
[0059] S-下遊引物（EB0V 蘇丹型）：5' -AAAGGCAAAGCAATACGACC-3'
[0060] R-下遊引物（EB0V 萊斯頓型）：5' -CATGTTGATGGTAATTGGTAATAG-3'
[0061] T-下遊引物（EB0V 塔伊森林型）：5' -GGAATGGGGTACTTCTGAACA-3'
[0062] B-下遊引物（EB0V 本迪布焦型）：5' -GCCAATTCTCAGTGTTGGTATT-3'。
[0063] 2.製備PCR用的標準定量試劑。
[0064] I) FRET-PCR標準品的製備
[0065] 由金斯瑞（金斯瑞生物科技，中國南京）合成載有伊波拉病毒5種亞型（薩伊 型、蘇丹型、萊斯頓型、塔伊森林型和本迪布焦型）目的DNA序列的質粒。依據合成物的分 子量和絕對重量，計算合成物所含的基因拷貝的絕對數目。隨後，對合成物進行稀釋，製備 每10 μ 1合成物的稀釋試劑含10, 000拷貝、1，000拷貝、100拷貝、10拷貝、1拷貝的目的基 因作為標準品。本發明試劑盒中提供濃度為ι〇4/μ 1的質粒標準品。
[0066] 2)反轉錄PCR標準品的製備
[0067] 用禽流感病毒（HlNl)感染雞胚後收取其尿囊液，用商業RNA提取試劑盒（High Pure RNA Isolation Kit，羅氏，德國）進行RNA核酸提取後，用TE緩衝液（PH 8.0)進行 10_3, 10_4, 10_5, 10_6, 10_7, 10_8梯度稀釋後作為檢測反轉錄PCR系統敏感度的標準品。
[0068] 3. PCR擴增體系。
[0069] 1)實時螢光定量FRET-PCR
[0070] 20 μ 1的擴增體系包含：10 μ 1的樣品DNA模板或者定量標準試劑、IxPCR緩衝液、 1 μ M FRET-上遊引物、1 μ M FRET-下遊引物、0· 2 μ M 的 6-FAM 探針、0· 2 μ M 的 LCRed640 探 針、2個單位的商業化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0071] 2)反轉錄 PCR
[0072] 20 μ 1的擴增體系包含：10 μ 1的樣品DNA模板或者定量標準試劑、IxPCR緩衝液、 1 μ M FRET-上遊引物、1 μ M FRET-下遊引物、0· 2 μ M 的 6-FAM 探針、0· 2 μ M 的 LCRed640 探 針、2個單位的商業化Taq酶、200 μ M dNTP、0. 14個單位的商業化反轉錄酶、20個單位的商 業化RNA酶抑制劑。
[0073] 4. PCR擴增循環參數。
[0074] DFRET-PCR
[0075] PCR擴增包括：預變性、18個溫度遞減的高嚴謹循環、40個欠嚴謹的螢光獲得 循環、1個持續螢光獲得的熔解循環和1個降溫循環。預變性：lx2min@95°C ;18個溫度 遞減的高嚴謹循環：6xlsec@95°C，12sec@7(TC，8sec(g72t： ;9xlsec@95°C，12sec(g68t：， 8sec@72 °C ;3xlsec@95 °C，12sec@66 °C，8sec@72 °C ;40 個欠嚴謹的螢光獲得循環： 40xlsec@95°C，8sec@52°C (在此收集螢光），30sec@67°C，and30sec@72°C ;1 個熔解循環： lxlsec@95°C，10sec@38°C，@85°C持續收集螢光；降溫循環：lxlsec@38°C。
[0076] 2)反轉錄 PCR
[0077] PCR擴增包括：反轉錄、預變性、18個溫度遞減的高嚴謹循環、40個欠嚴謹的熒 光獲得循環和1個降溫循環。反轉錄：lx30min@55°C ;預變性：lx2min@95°C ;18個溫度 遞減的高嚴謹循環：6xlsec@95°C，12sec@7(TC，8sec(g72t： ;9xlsec@95°C，12sec(g68t：， 8sec@72 °C ;3xlsec@95 °C，12sec@66 °C，8sec@72 °C ;40 個欠嚴謹的螢光獲得循環： 40xlsec@95°C，8sec@52°C (在此收集螢光），30sec@67°C，and30sec@72°C ;降溫循環： lxlsec@38°C。
[0078] 5.瓊脂糖凝膠電泳。
[0079] 配製4%瓊脂糖凝膠，取4μ1 PCR擴增產物，並用SYBR? Safe DNA Gel Stain 染色。在紫外燈下觀察，可以看到伊波拉病毒5種亞型分別在255bp, 211bp, 192bp, 166bp 和146bp處的目的條帶，而且可以區分同時擴增5種伊波拉病毒亞型的PCR產物（圖 16)。實驗中所使用的標準品為 20 bp DNA Ladder(Thermo Scientific 20 bp DNA Ladder, ready-to-use, Fermentas? by Thermo Scientific?,美國），且其條帶大小依 次為 20bp, 40bp, 60bp, 80bp, IOObp, 120bp, 140bp, 160bp, 180bp, 200bp, 300bp。
[0080] 6. PCR結果的判定。
[0081] FRET-PCR擴增對象包括質粒標準品DNA模板、PCR陰性對照（雙蒸水）；反轉錄PCR 擴增對象包括標準品RNA模板、RNA提取的陰性對照和PCR陰性對照（雙蒸水）。此發明有 著高度的特異性，不僅能檢測到5種伊波拉病毒亞型（薩伊型、蘇丹型、萊斯頓型、塔伊森 林型和本迪布焦型）的核酸（圖9-圖13)，而且能夠根據PCR熔解曲線和PCR產物電泳圖 片將其分型（圖14,圖16)。陽性樣品和陽性對照在FRET-PCR的螢光擴增曲線在640nm有 螢光的出現或增強，且熔解曲線中有熔解峰出現。根據RT-PCR熔解曲線Tm值的不同區分 伊波拉病毒的5種亞型（薩伊型、蘇丹型、萊斯頓型、塔伊森林型和本迪布焦型）（圖14); 同時也可以根據PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳中目的條帶大小的不同區分5種亞型：伊波拉 病毒薩伊型（255bp)、蘇丹型（211bp)、本迪布焦型（192bp)、塔伊森林型（166bp)、萊斯頓 型（146bp)(圖 16)。
[0082] 實施例：轉錄方法驗證本發明反轉錄PCR體系
[0083] 由金斯瑞（金斯瑞生物科技，中國南京）合成含有伊波拉病毒扎依爾型目的片 段DNA和T7啟動子的質粒PUC57,用合適的限制性內切酶（Sac I，寶生物，大連）對質粒 進行酶切；通過PCR擴增提高目的DNA濃度；用商業化轉錄試劑盒（MEGAscript? Kit， ambion? by life technologes?，美國）對PCR擴增產物進行轉錄並獲得RNA產物；轉 錄完成後，將轉錄產物直接用於反轉錄PCR進行擴增。
[0084] 1)質粒的稀釋
[0085] 將含有合成質粒的微型離心管4000轉離心2分鐘，然後加入40 μ 1雙蒸水或TE 緩衝液（PH8. 0)配成質粒濃度為IOOng/ μ 1的溶液；
[0086] 2)質粒的酶切
[0087] 用商業化限制性內切酶SacI (Sac I，寶生物，大連）對質粒進行酶切，其反應體系 為20 μ 1，且各試劑成分組成如下表；將各反應液混合後放入37°C環境中孵育1個小時；然 後將反應體系混合液放入56°C環境中加熱20分鐘使限制性內切酶失活，從而終止反應；
[0088]

【權利要求】
1. 一種一步法反轉錄PCR檢測和分型伊波拉病毒5種亞型的引物、探針，其特徵在於： 其核苷酸序列如下： 上遊引物：5 ' -CGGACACACAAAAAGAAAGAAG-3 ' 6-FAM 探針：5' -6FAM-TAGTTAYTCGCACACAAWARRK-磷酸-3' LCRed640 探針：5' -GAGGAAAATTDTTAATCTTCCTC-LCRed640-3' Z-下遊引物（EBOV 薩伊型）：5' -GAACTTGTGATGTGATAAGACCTA-3' S-下遊引物（EB0V 蘇丹型）：5' -AAAGGCAAAGCAATACGACC-3' R-下遊引物（EB0V 萊斯頓型）：5' -CATGITGATGGTAAITGGTAATAG-3' T-下遊引物（EB0V 塔伊森林型）：5' -GGAATGGGGTACTTCTGAACA-3' B-下遊引物（EB0V 本迪布焦型）：5' -GCCAAITCTCAGTGTTGGTATT-3'。
2. -種一步法反轉錄PCR檢測和分型伊波拉病毒5種亞型的試劑盒，其特徵在於：包 括樣品DNA模板或者定量標準試劑、PCR緩衝液、FRET-上遊引物、FRET-下遊引物、的6-FAM 探針、LCRed640探針、商業化Taq酶、dNTP、商業化反轉錄酶、商業化RNA酶抑制劑。
3. -種一步法反轉錄PCR檢測和分型伊波拉病毒5種亞型的方法，其特徵在於：用權 利要求1所述的引物和探針，特異地擴增伊波拉5種亞型的核酸，伊波拉5種亞型分別為扎 伊爾型、蘇丹型、萊斯頓型、塔伊森林型和本迪布焦型，並可依據其高解析度熔解曲線或瓊 脂糖凝膠電泳中目的條帶大小的不同區分5種亞型的伊波拉病毒。
【文檔編號】C12N15/11GK104313191SQ201410655921
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月17日 優先權日:2014年11月17日
【發明者】王成明, 陸光武, 張繼壘 申請人:揚州大學