獼猴超數排卵和腹腔鏡取卵方法
2023-05-28 21:29:31 1
專利名稱：獼猴超數排卵和腹腔鏡取卵方法
技術領域：
本發明屬於用於動物繁殖的方法，特別是刺激獼猴一次獲得多個成熟卵母細胞的 方法。
背景技術：
獼猴屬於靈長類動物，與人類有著非常接近的遺傳物質，其數量較多，分布較廣， 可避開倫理束縛，成為人類的理想實驗替代品，廣泛應用在臨床前疾病模型研究、藥物篩選 等涉及人類健康的諸多領域。生殖生物學和胚胎工程技術在近10年來發展迅速，轉基因、 核移植、胚胎幹細胞替代治療等方面的研究取得了縱深發展。這些研究的終極目標是提高 人類的健康水平和生活質量。然而，目前的絕大多數研究基於小鼠等小型、低等的哺乳動 物，利用獼猴開展相關研究勢在必行。在常規狀態下，獼猴僅在10月份到次年3月份的生 殖季節出現月經，期間排卵2-3次，每次只排卵1個。超數排卵技術是利用外源激素，刺激動物在一個排卵周期排出比正常情況下更多 的成熟卵子的技術，它和卵子收集技術是體外受精等胚胎工程研究的前提和基礎。靈長類 的超數排卵研究最早是在人上開展的。1970年，英國婦科學家StePtoe及胚胎學家Edwards 開始人超數排卵、體外受精和胚胎移植的研究工作。1976年第一例輸卵管妊娠成功。1978 年StePtoe等報導了世界首例試管嬰兒誕生。在非人靈長類，1973年，Gould等首先報導了 巖石猴體外受精發育到卵裂。隨後，在黑猩猩(Gould等，1983)，獼猴(Bavister等，1984)， 狒狒(Kuehl等，1984)，食蟹猴(Bamaeede等，1984)，絨猴(Lopata等，1988)等均有報導。超數排卵可以一次得到多個質量較好的卵，但總的來看超排效果還不穩定，文獻 報導的非人靈長類的超排成功率仍然很低，而且受年齡、季節和月經的規律性等因素的影 響。超數排卵還可能產生不正常的發育和多黃體功能(季維智等，1993)，超排過程中血液 孕酮和雌激素水平比正常月經周期要高得多；黃體期要比自然月經周期短3-5天。造成這 種異常可能是hCG較長的半衰期使黃體延續，促性腺激素升高。此外，外源激素促性腺激素 的藥理環境和較高的留體激素水平可能抑制了垂體的功能使內源LH在hCG的作用消失後 不足以維持黃體。這些異常都可能影響早期胚胎的發育。獼猴的超數排卵效果非常穩定的 報導尚不多見。另一方面，傳統的獼猴採卵技術基本採用手術方法，剖開動物腹壁，暴露卵巢，然 後用注射器等吸取卵泡，收集卵子。該方法手術創面大，動物容易受感染，動物2-3次手術 後，腹腔內臟器粘連嚴重，很難繼續利用。腹腔鏡取卵多用於大動物和人。St印toe等在人體注射hCG32_36小時後，利用腹 腔鏡採卵獲得近成熟卵母細胞並體外受精成功，成為世界首例試管嬰兒。但腹腔鏡取卵在 獼猴上的應用還不十分成熟。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種獼猴超數排卵和腹腔鏡取卵方法，該方法能夠大幅提高每次獲得的卵子的數量和質量，且操作過程微創，受試動物無痛 苦，可提高獼猴每年的利用次數和利用年限，為進一步開展胚胎工程相關研究提供材料。為實現這樣的目的，本發明用人源重組的超排激素促卵泡激素(FSH)刺激獼猴卵 巢多個卵泡發育，然後利用人絨促性腺素(HCG)使卵泡進一步成熟，約36小時後，利用腹腔 鏡收集超排所得的卵母細胞。本發明包括如下步驟(1)從獼猴月經周期1-5天內開始注射人源重組的超排激素促卵泡激素FSH ；(2)給藥後4天，檢測卵泡發育情況，對卵泡發育均勻、數目合適的獼猴繼續給藥；(3)給藥8天後，注射人絨促性腺素(HCG)；(4)約36小時後，利用腹腔鏡收集卵母細胞、分級、處理。所述的注射人源重組的超排激素促卵泡激素FSH是將70IU的FSH用生理鹽水稀 釋混勻後，根據動物的年齡、體重、重複超排次數、血液雌二醇和孕酮水平決定用藥量，早晚 肌肉注射給藥。所述的給藥4天後，用B型超聲波檢測卵泡發育情況。本發明方法簡單，易於推廣，其體系的特點是1)可以針對不同的獼猴個體制定相應的超數排卵和取卵方案，每次可以獲得平均 40枚左右的卵母細胞，其中，成熟卵母細胞超過20枚；2)每個繁殖季節每隻獼猴可以處理2次，提高了獼猴有限生殖季節的利用效率；3)利用人源重組的超排激素促卵泡激素(FSH)和人絨促性腺素(HCG)避免獼猴對 藥物依賴性，保證每次超數排卵的數量和質量；4)超排取卵的對象可以擴大到2歲-16歲；5)利用微創、快速、高效的腹腔鏡技術取卵，減少了手術對獼猴的損傷，術後沒有
後遺症。利用外源激素誘發獼猴超數排卵和微創、快速高效的取卵技術是開展胚胎醫學研 究的基礎和關鍵技術。發明人利用自身擁有的豐富的獼猴資源，通過近10年的研究和探 索，建立了一套較為完善的獼猴超數排卵和腹腔鏡取卵技術。以下結合實施例對本發明做進一步描述，本發明保護範圍包括但不限於實施例的 內容。
具體實施例方式實施例1 在獼猴的生殖季節觀察獼猴的月經，在月經周期1-5天的任意一天開始注射促卵 泡激素(FSH)；給藥FSH後4天開始，用B型超聲波檢測卵泡發育情況，發育均勻、數目合適 的繼續給藥；給藥8天後注射HCG ；約36小時後，利用腹腔鏡收集卵母細胞，分級、處理。實施例2 對於重複超排的獼猴，在獼猴的生殖季節觀察獼猴的月經，在月經周期1-5天的 任意一天開始注射促卵泡激素(FSH)；將70IU的FSH用生理鹽水稀釋混勻，根據動物的年 齡、體重、重複超排次數、前次超排取卵情況、血液雌二醇和孕酮水平決定用藥量，早晚肌肉 注射給藥；給藥後4天開始，用B型超聲波檢測卵泡發育情況，發育均勻、數目合適的繼續給藥；給藥8天後，注射HCG ；約36小時後，利用腹腔鏡收集卵母細胞；將收集的卵母細胞送到 胚胎操作間進一步分級、處理，開展後續實驗。
權利要求
一種獼猴超數排卵和腹腔鏡取卵方法，其特徵在於包括以下步驟(1)在獼猴月經周期1-5天內開始注射人源重組的超排激素促卵泡激素(FSH)；(2)給藥4天後，檢測卵泡發育情況，對卵泡發育均勻、數目合適的獼猴繼續給藥；(3)給藥8天後，注射人絨促性腺素(HCG)；(4)約36小時後，利用腹腔鏡收集卵母細胞、分級、處理。
2.根據權利要求1所述的獼猴超數排卵和腹腔鏡取卵方法，其特徵在於所述的注射人 源重組的超排激素促卵泡激素(FSH)是將70IU的FSH用生理鹽水稀釋混勻後，根據動物的 年齡、體重、重複利用次數、血液雌二醇和孕酮水平決定用藥劑量，早晚肌肉注射給藥。
3.根據權利要求1或2所述的獼猴超數排卵和腹腔鏡取卵方法，其特徵在於所述的給 藥4天後，用B型超聲波檢測卵泡發育情況。
全文摘要
一種獼猴超數排卵和腹腔鏡取卵技術，屬於用於動物繁殖的方法，特別是刺激獼猴一次獲得多個成熟卵母細胞的方法。本發明用人源重組的超排激素促卵泡激素(FSH)刺激獼猴卵巢多個卵泡發育後，用人絨促性腺素(HCG)使卵泡成熟，並利用腹腔鏡收集卵母細胞。本發明大幅提高了獼猴卵子的數量和質量，操作過程微創，受試動物無痛苦，也提高了獼猴利用次數/年和利用年限，增加了胚胎工程相關研究所需材料。
文檔編號A61D19/00GK101849861SQ20101019867
公開日2010年10月6日 申請日期2010年6月12日 優先權日2010年6月12日
發明者唐向輝, 季維智, 牛昱宇, 王宏, 紀少琿, 陳永昌 申請人:昆明亞靈生物科技有限公司