用於抑制LeY糖抗原合成的巖藻糖基轉移酶Ⅳ的RNA幹涉序列及重組幹涉質粒的製作方法

2023-06-11 00:31:51 2

專利名稱：用於抑制LeY糖抗原合成的巖藻糖基轉移酶Ⅳ的RNA幹涉序列及重組幹涉質粒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種特異的DNA序列及根據該序列構建的重組幹涉質粒。
背景技術：
惡性腫瘤是一種較為難治的疾病，尚無理想的治療方法。目前，對腫瘤的 治療策略主要是採取外科手術、放射治療和化學治療等綜合手段，但每一種方法仍具有局 限性並可產生一定程度的毒副作用。發明內容本發明的目的在於提供一種依據腫瘤特異糖抗原合成及腫瘤生長、浸 潤、轉移等分子機制所構建的，用於抑制LeY腫瘤寡糖抗原合成的巖藻糖基轉移酶I和IV 的RNA幹涉序列及重組幹涉質粒。本發明主要是應用RNAi (RNAi，RNA interference) 技術以腫瘤的特異糖抗原為靶位點，抑制細胞表面Lewis Y(LeY)腫瘤寡糖抗原的合成。 LeY分子結構為Fuc α 1 — 2Gal β — 4(Fuc α 1 — 3)GlcNAc),即通過設計併合成LeY腫 瘤寡糖抗原的關鍵酶巖藻糖基轉移酶KFucosyltransferase I，簡稱FUT1)和巖藻糖 基轉移酶IAKFucosyltransferase IV，簡稱FUT4)基因的幹涉序列，並採用分子克隆 重組技術構建重組FUTl幹涉質粒(pSilencer-4. I-FUTISiRNA)和重組FUT4幹涉質粒 (pSilencer-4. l_FUT4SiRNA)，用於抗腫瘤藥物應用。本發明的技術方案如下1.設計併合成FUTl和FUT4基因的幹涉序列應用DNASTAR軟體分析了 GenBank中全部的人的FUT1/FUT4基因的同源序 列，FUT1/FUT4基因的編碼序列的全長分別為1098bp和1218bp，從SiRNA設計軟體 獲得的用於抗腫瘤生長的重組FUT1/FUT4的幹涉質粒的DNA模板序列中各選取7條 作為形成幹涉序列的模板DNA序列，長度均為19bp。其中，所設計的FUTl基因的幹 涉序列為FUT1-1 TGGCCGGTTTGGTAATCAG ；FUT1-2 :AGACTTTGCCCTGCTCACA ；FUT1-3 GAGGAGTACGCGGACTTGA ；FUT1-4 CAGATCCGCAGAGAGTTCA ； FUT1-5 CGGCATGGAGTGGTGTAAA ； FUT1-6 :TGGCCTTCCTGCTAGTCTG ；FUT1-7 TTCGCCTTTCCTCCCCTGC 這些序列在 FUTl 基因中 的位置如圖1所示。所設計的FUT4基因的幹涉序列為FUT4-1 GCCTGGCAAGTAACCTCTT ； FUT4-2 :GTAACCTCTTCAACTGGAC ； FUT4-3 CGGACGTCTTTGTGCCTTA ； FUT4-4 CATGTGACCGTGGACGTGT ；FUT4-5 :GTTCTACCTGGCTTTCGAG ；FUT4-6 :CTCGTACCTGCTTTTCCTC ； FUT4-7 :GCGGAGGCAGCGCTGCCTG。這些序列在FUT4基因中的位置如圖2所示。2.構建重組FUTl幹涉質粒和構建重組FUT4幹涉質粒①根據SiRNA設計軟體獲得用於抗腫瘤生長的重組FUT1/FUT4的幹涉質粒的DNA 模板序列，它是以上述FUT1/FUT4基因的調控區和編碼區的序列進行幹涉質粒的構建。②根據pSilencer-4. l-CMV-neo (Ambion，Inc)載體結構信息設計插入載體的 FUT1/FUT4幹涉質粒的DNA模板序列，即以幹涉載體的多克隆酶切位點(Hindlll、BamH I)為基礎，設計與幹涉載體有相同粘性末端的FUTl/FUT4SiRNA模板的DNA序列，分別構 建 7 個 FUTl 幹涉質粒pSilencer-4. 1-FUT1 -1 /FUT1-2/FUT1-3/FUT1-4/FUT1-5/FUT1 -6/
3FUT1-7；7 個 FUT4 的幹涉質粒pSilencer-4. 1-FUT4-1 /FUT4-2/FUT4-3/FUT4-4/FUT4-5/ FUT4-6/FUT4-7。每條鏈的5、末端含有HindIII或BamH I的酶切位點(下劃線標出)。具 體序列如下FUTl-I (5，-3，)GATCCTGGCCGGTTTGGTAATCAGTTCAAGAGACTGATTACCAAACCGGCCAGGAAGCTTCCTGGCCGGTTTGGTAATCAGTCTCTTGAACTGATTACCAAACCGGCCAGFUT1_2(5，-3，)GATCCAGACTTTGCCCTGCTCACATTCAAGAGATGTGAGCAGGGCAAAGTCTGGAAGCTTCCAGACTTTGCCCTGCTCACATCTCTTGAATGTGAGCAGGGCAAAGTCTGFUT1_3(5，-3，)GATCCGAGGAGTACGCGGACTTGATTCAAGAGATCAAGTCCGCGTACTCCTCGGAAGCTTCCGAGGAGTACGCGGACTTGATCTCTTGAATCAAGTCCGCGTACTCCTCGFUT1_4(5，-3，)GATCCCAGATCCGCAGAGAGTTCATTCAAGAGATGAACTCTCTGCGGATCTGGGAAGCTTCCCAGATCCGCAGAGAGTTCATCTCTTGAATGAACTCTCTGCGGATCTGGFUT1_5(5，-3，)GATCCCGGCATGGAGTGGTGTAAATTCAAGAGATTTACACCACTCCATGCCGGGAAGCTTCCCGGCATGGAGTGGTGTAAATCTCTTGAATTTACACCACTCCATGCCGGFUT1_6(5，-3，)GATCCTGGCCTTCCTGCTAGTCTGTTCAAGAGACAGACTAGCAGGAAGGCCAGGAAGCTTCCTGGCCTTCCTGCTAGTCTGTCTCTTGAACAGACTAGCAGGAAGGCCAGFUT1_7(5，-3，)GATCCTTCGCCTTTCCTCCCCTGCTTCAAGAGAGCAGGGGAGGAAAGGCGAAGGA
AGCTTCCTTCGCCTTTCCTCCCCTGCTCTCTTGAAGCAGGGGAGGAAAGGCGAAGFUT4_1(5，-3，)GATCCGCCTGGCAAGTAACCTCTTCTCAAGAGAAAGAGGTTACTTGCCAGGCGGAAGCTTCCAGCCTGGCAAGTAACCTCTTTCTCTTGAGAAGAGGTTACTTGCCAGGCGFUT4-2(5:3~)GATCCGTAACCTCTTCAACTGGACTTCAAGAGAGTCCAGTTGAAGAGGTTACGGAAGCTTCCGTAACCTCTTCAACTGGACTCTCTTGAAGTCCAGTTGAAGAGGTTACGFUT4_3(5，-3，)GATCCCGGACGTCTTTGTGCCTTATTCAAGAGATAAGGCACAAAGACGTCCGGGAAGCTTCCCGGACGTCTTTGTGCCTTATCTCTTGAATAAGGCACAAAGACGTCCGGFUT4_4(5，-3，)GATCCCATGTGACCGTGGACGTGTTTCAAGAGAACACGTCCACGGTCACATGGGAAGCTTCCCATGTGACCGTGGACGTGTTCTCTTGAAACACGTCCACGGTCACATGGFUT4_5(5，-3，)GATCCGTTCTACCTGGCTTTCGAGTTCAAGAGACTCGAAAGCCAGGTAGAACGGAAGCTTCCGTTCTACCTGGCTTTCGAGTCTCTTGAACTCGAAAGCCAGGTAGAACG
FUT4_6(5，-3，)GATCCCTCGTACCTGCTTTTCCTCTTCAAGAGAGAGGAAAAGCAGGTACGAGGGAAGCTTCCCTCGTACCTGCTTTTCCTCTCTCTTGAAGAGGAAAAGCAGGTACGAGGFUT4_7(5，-3，) GATCCGCGGAGGCAGCGCTGCCTGTTCAAGAGACAGGCAGCGCTGCCTCCGCGGAAGCTTCCGCGGAGGCAGCGCTGCCTGTCTCTTGAACAGGCAGCGCTGCCTCCGCG③特異的序列合成(Takara公司)後，經變性、退火形成55bp (含粘性末端 HindIII, BanH I)的SiRNA模板的雙鏈DNA序列。具體方法是將合成的用於幹擾FUTl/ FUT4基因的SiRNA的模板DNA序列的兩條鏈，分別用10-100 μ 1去離子水或者TE (Tris-HCl EDTA)緩衝液溶解，並測定^Onm的吸光值，計算其DNA濃度。用去離子水或者TE稀釋 (10-500ng/y 1)。吸取稀釋的單鏈樣品加DNA退火緩衝液(含IOmM Tris (pH7. 4), 50mM NaCl，ImMEDTA)於90_98°C變性3_10分鐘，冷卻至37°C並維持1小時，於_20°C溫度保存此 退火產物，備用。④pSilencer-4. 1-FUTl/FUT4SiRNA 重組質粒構建取pSilencer-4. l-CMV-neo (10_500ng)於 37°C進行 HindIII 和 BamH I 雙酶切 1-3 小時，酶切後純化產物與退火產物進行連接。連接反應如下取1-20 μ 1退火產物、1-20 μ 1 載體酶切後純化產物、1-20 μ 1連接酶、1-20 μ 1連接緩衝液，最後加去離子水至10-200 μ 1 於16°c過夜連接。連接產物轉化DH5CI大腸桿菌，利用氨苄青黴素抗性標記篩選陽性克隆 子，小量提取質粒後酶切鑑定，如圖3和圖4。將鑑定正確的克隆子進行大量提取質粒。研究表明腫瘤糖抗原的異常合成是惡性腫瘤增殖、浸潤、轉移的主要原因，並為 其惡性轉化的重要標誌之一。特異的腫瘤糖抗原的合成是由糖基轉移酶的特異性決定的， 並且糖抗原的合成水平與糖基轉移酶基因的表達調控有關。FUT1/FUT4是合成LeY腫瘤寡 糖的關鍵酶。FUTl為α 1，2-巖藻糖化糖基轉移酶(a 1，2_FUT)，與LeY腫瘤寡糖抗原末端 α 1，2巖藻糖基的合成有關，催化合成α 1，2-巖藻糖苷鍵；而FUT4為α 1，3_巖藻糖化糖基 轉移酶(a 1，3_FUT)，催化合成α 1，3_巖藻糖苷鍵。LeY腫瘤寡糖抗原是細胞表面糖複合 物(糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖)中的糖鏈成分，已經發現其在多種腫瘤中合成異常增加，與 腫瘤增殖、浸潤、轉移、臨床分期(分級)及預後密切相關。因此，通過下調FUTl和FUT4表 達水平將以降低LeY腫瘤寡糖抗原的合成量是有效的靶點，該方面的研究目前國內外尚未 見報導。本發明利用RNA幹涉技術，構建重組FUTl和FUT4幹涉質粒，通過抑制腫瘤細胞特 異的巖藻糖基轉移酶的合成和表達，降低LeY腫瘤寡糖抗原的合成，進而抑制腫瘤的生長、 浸潤和轉移。本發明相比現有技術具有如下優點採用本發明構建重組的FUTl和FUT幹涉質粒 為臨床腫瘤的靶向基因治療提供新的思路和手段，它不僅效果明顯而且毒副作用小、安全， 同時患者治療周期短，是一種高效、安全、經濟的抗腫瘤模式。


圖1是本發明FUTl基因的幹涉質粒的DNA模板序列在基因上的位置圖。圖2是本發明FUT4基因的幹涉質粒的DNA模板序列在基因上的位置圖。圖3是本發明FUTl基因的幹涉質粒酶切鑑定分析圖。
圖4是本發明FUT4基因的幹涉質粒酶切鑑定分析圖。圖5是本發明幹涉質粒轉染A431腫瘤細胞後FUTl基因的RT-PCR分析圖。圖6是本發明幹涉質粒轉染A431腫瘤細胞後FUT4基因的RT-PCR分析圖。圖7是本發明FUTl幹涉質粒(FUT1-1和FUT1-2)轉染A431腫瘤細胞後LeY合成 量流式細胞檢測圖。圖8是本發明FOT4幹涉質粒(FOT4-1和FOT4-2)轉染A431腫瘤細胞後LeY合成 量流式細胞檢測圖。圖9是本發明FUTl幹涉質粒(FUT1-1和FUT1-2)轉染A431腫瘤細胞生長抑制作 用的圖。圖10是本發明FUT4幹涉質粒(FUT4-1和FUT4-2)轉染A431腫瘤細胞生長的抑 製作用的圖。圖11是本發明FUTl的不同幹涉質粒對增殖細胞核抗原(PCNA)表達抑制作用的 圖。圖12是本發明FUT4的不同幹涉質粒對增殖細胞核抗原(PCNA)表達的抑制作用 的圖。圖13是本發明影響動物實驗各組小鼠瘤體積的分析圖。圖14是本發明影響動物實驗各組小鼠瘤重量的分析圖。
具體實施例方式例1構建重組FUTl幹涉質粒①根據SiRNA設計軟體獲得用於抗腫瘤生長的重組FUTl幹涉質粒的DNA模板序 列，它是以上述FUTl基因的調控區和編碼區的序列進行幹涉質粒的構建。每條鏈的5、末 端含有HindIII或BamH I的酶切位點(下劃線標出)。具體如下FUTl-I (5，-3，)GATCCTGGCCGGTTTGGTAATCAGTTCAAGAGACTGATTACCAAACCGGCCAGGAAGCTTCCTGGCCGGTTTGGTAATCAGTCTCTTGAACTGATTACCAAACCGGCCAGFUT1_2(5，-3，)GATCCAGACTTTGCCCTGCTCACATTCAAGAGATGTGAGCAGGGCAAAGTCTGGAAGCTTCCAGACTTTGCCCTGCTCACATCTCTTGAATGTGAGCAGGGCAAAGTCTG②根據pSilencer-4. l-CMV-neo載體結構信息設計插入載體的FUTl幹涉質粒 的DNA模板序列，即以幹涉載體的多克隆酶切位點(HindIII、BamH I)為基礎，設計與幹涉 載體有相同粘性末端的FUTlSiRNA模板的DNA序列，分別構建pSilencer-4. 1-FUT1-1和 pSilencer-4. I-FUT1-2 的幹涉質粒。③特異的序列合成(Takara公司)後，經變性、退火形成55bp (含粘性末端 HindIIKBamH I)的SiRNA模板的雙鏈DNA序列。將合成的用於幹擾FUTl基因的SiRNA的 模板DNA序列的兩條鏈，分別用ΙΟΟμΙ去離子水溶解，取Ιμ 去離子水按1 10的體積 比例稀釋，測定260nm的吸光值，計算其DNA濃度(約33 μ g/ml)，用去離子水稀釋至SOng/ μ 1，吸取每條鏈 10 μ 1 力卩 100 μ 1 IXDNA 退火緩衝液(含 IOmM Tris (ρΗ7· 4)，50mM NaCl， ImM EDTA)於98°C變性3分鐘，冷卻至37°C並維持1小時，於_20°C溫度保存此退火產物，
④pSilencer-4. I-FUTl重組幹涉質粒構建對pSilencer-4. l-CMV-neo (90ng)於 37°C進行 HindIII 和 BamH I 雙酶切 2 小時， 酶切後回收產物與退火產物進行連接，連接反應如下取2μ 1退火產物、2 μ 1載體酶切後 純化回收產物、2 μ 1連接酶、2 μ 1連接緩衝液，最後加2 μ 1去離子水至10 μ 1於16°C過夜 連接。連接產物轉化DH5ci大腸桿菌，利用氨苄青黴素(Amp)抗性篩選陽性克隆子，小量提 取質粒後酶切鑑定。將鑑定正確的克隆子大量提取質粒。例2構建重組FUT4幹涉質粒①根據SiRNA設計軟體獲得用於抗腫瘤生長的重組FUT4幹涉質粒的DNA模板序 列，它是以上述FUT4基因的調控區和編碼區的序列進行幹涉質粒的構建。每條鏈的5、末 端含有HindIII或BamH I的酶切位點(下劃線標出)。具體如下FUT4_1(5，-3，)GATCCGCCTGGCAAGTAACCTCTTCTCAAGAGAAAGAGGTTACTTGCCAGGCGGAAGCTTCCAGCCTGGCAAGTAACCTCTTTCTCTTGAGAAGAGGTTACTTGCCAGGCGFUT4-2(5:3~)GATCCGTAACCTCTTCAACTGGACTTCAAGAGAGTCCAGTTGAAGAGGTTACGGAAGCTTCCGTAACCTCTTCAACTGGACTCTCTTGAAGTCCAGTTGAAGAGGTTACG②根據pSilencer-4. l-CMV-neo載體結構信息設計插入載體的FUT4幹涉質粒 的DNA模板序列，即以幹涉載體的多克隆酶切位點(HindIII、BamH I)為基礎，設計與幹涉 載體有相同粘性末端的FU1MSiRNA模板的DNA序列，分別構建pSilencer-4. 1-FUT4-1和 pSilencer-4. 1-FUT4-2 的幹涉質粒。③特異的序列合成(Takara公司)後，經變性、退火形成55bp (含粘性末端 HindIII、BamH I)的SiRNA模板的雙鏈DNA序列。將合成的用於幹擾FUT4基因的SiRNA 的模板DNA序列的兩條鏈，分別用50μ1去離子水溶解，取0.5μ1去離子水按1 10的體 積比例稀釋，測定260nm的吸光值，計算其DNA濃度，用去離子水稀釋至lOOng/μ 1，吸取每 條鏈 10 μ 1 力口 46 μ 1 IXDNA 退火緩衝液(含 IOmM Tris (ρΗ7· 4)，50mM NaCl，ImM EDTA)於 90°C變性10分鐘，冷卻至37°C並維持1小時，於_20°C溫度保存此退火產物，備用。④pSilencer-4. l_FUT4SiRNA 重組幹涉質粒構建對pSilencer-4. l-CMV-neo (300ng)於 37°C 進行 HindIII 和 BamH I 雙酶切 3 小 時，酶切後回收產物與退火產物進行連接，連接反應如下取5μ 1退火產物、5μ 1載體酶切 後回收產物、5 μ 1連接酶、5 μ 1連接緩衝液，最後加去離子至50 μ 1於16°C過夜連接。連接 產物轉化DH5ci大腸桿菌，利用氨苄青黴素(Amp)抗性標記篩選陽性克隆子，小量提取質粒 後酶切鑑定。將鑑定正確的克隆子大量提取質粒。以下為本發明的檢測結果1. pSilencer-4. 1-FUT1/FUT4 SiRNA重組質粒轉染 A431 腫瘤細胞，採用 RT-PCR檢 測發現轉染重組質粒的細胞FUT1/FUT4表達明顯下降，如圖5和圖6所示。2. pSilencer-4. 1-FUT1/FUT4 SiRNA重組質粒轉染A431腫瘤細胞後，採用流式細 胞技術檢測發現LeY的合成顯著降低，如圖7和圖8所示。3. pSilencer-4. 1-FUT1/FUT4 SiRNA重組質粒轉染A431腫瘤細胞，經噻唑藍(MTT)比色法檢測顯示轉染重組質粒的細胞生長顯著降低，如圖9和圖10所示。4. pSilencer-4. 1-FUT1/FUT4 SiRNA 重組質粒轉染 A431 腫瘤細胞，採用 Western blot技術發現PCNA的表達量明顯減少，如圖11和圖12所示。5. pSilencer-4. I-FUT1-1/FUT4-1重組質粒抑制動物模型中腫瘤生長作用(1)用胰酶消化A431腫瘤細胞，離心收集細胞，用生理鹽水製備細胞懸液，並用臺 盼藍法對細胞進行計數，使每0. Iml生理鹽水中含A431細胞個數為2X106。取4_6周齡的 裸鼠(η = 6 8)，每隻鼠右腋皮膚下注射0.1ml腫瘤細胞懸液。對照組等量注射生理鹽 水。(2)實驗分為四組空白組、空載體組、FUTl-I幹涉質粒組和FUT4-1幹涉質粒組。 於注射A431腫瘤細胞懸液次日開始，每隔1天注射幹涉質粒(150 μ g/次/鼠)，共10次。 (3)每日觀察實驗組和對照組鼠的生長狀態、種植腫瘤大小變化，並稱重。實驗持續22天後 處死裸鼠，並測量瘤體積(表1)和測定瘤重量(表2)。表1實驗各組瘤體積的分析
權利要求
1.一種用於抑制LeY腫瘤寡糖抗原合成的巖藻糖基轉移酶IV所構建的重組的巖藻糖 基轉移酶IV幹涉序列FUT4-1，其特徵在於其序列如下GCCTGGCAAGTAACCTCTT。
2.一種用於抑制LeY腫瘤寡糖抗原合成的巖藻糖基轉移酶IV所構建的重組的巖藻糖 基轉移酶IV幹涉質粒，其特徵在於它是以RNA幹涉載體pSilencer-4. I-CMV neo的多克 隆特異酶切位點為基礎，設計與幹涉載體有相同粘性末端的FUT4SiRNA模板的DNA序列，構 建1個FUT4的含FUT4-1幹涉序列的幹涉質粒pSilencer_4. 1-FUT4-1。
3.一種用於抑制LeY腫瘤寡糖抗原合成的巖藻糖基轉移酶IV所構建的重組的巖藻糖 基轉移酶IV幹涉質粒的製備方法，其特徵在於①將合成的用於幹涉FUT4基因的FUT4-1 幹涉序列的模板DNA，用去離子水或者TE緩衝液溶解，測定260nm的吸光值，並計算DNA濃 度，②取溶解後的樣品加入DNA退火緩衝液中，於90-98°C變性3_10分鐘，冷卻後低溫保存 備用，③對RNA幹涉載體pSilencer-4. 1-CMV-neo於37°C進行特異限制性內切酶消化，產生 與幹涉序列匹配的粘性末端，④酶切產物純化後與②中製備保存的產物進行連接，⑤將上 述連接產物轉化感受態細菌並利用載體的抗性標記篩選陽性克隆子，⑥提取質粒後進行酶 切鑑定，⑦用酶切鑑定正確的克隆子製備質粒。
4.一種用於抑制LeY腫瘤寡糖抗原合成的巖藻糖基轉移酶IV所構建的重組的巖藻糖 基轉移酶IV幹涉質粒，其特徵在於該重組的含FUT4-1幹涉序列的巖藻糖基轉移酶IV幹 涉質粒作為製備抗腫瘤藥物應用。
全文摘要
一種用於抑制LeY糖抗原合成的巖藻糖基轉移酶IV的RNA幹涉序列及重組幹涉質粒，其主要內容是設計並篩選出巖藻糖基轉移酶I和IV的各7條FUT1/FUT4 SiRNA模板的DNA序列，分別以RNA幹涉載體(pSilencer-4.1-CMV neo)的多克隆特異酶切位點為基礎構建7個FUT1和7個FUT4的重組幹涉質粒，並應用這些幹涉質粒作為抗腫瘤藥物。這些幹涉質粒具有明顯的抑制腫瘤生長的作用，是一種高效、安全、經濟的腫瘤基因治療模式。
文檔編號C12N15/85GK102094019SQ20101010858
公開日2011年6月15日 申請日期2007年1月15日 優先權日2007年1月15日
發明者劉基巍, 富力, 張振波, 燕秋, 王曉琦, 閆傑 申請人:燕秋