新的1α-羥基維生素D4的應用的製作方法

2023-05-09 11:48:01 2

專利名稱：新的1α-羥基維生素D4的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物活性維生素D4化合物，更具體地說，本發明涉及新的1α-羥基維生素D4和在其合成中使用的新的中間體，新的1，25二羥基維生素D4和新的1，24二羥基D4。
本發明還涉及一種藥物組合物，它含有藥物有效量的新1α-羥基維生素D4化合物，本發明還涉及施用藥物有效量的該新化合物來控制鈣代謝異常的方法。
維生素D在動物和人體的鈣代謝調節中具有重要的作用是已知的(見Harrison的Principals of Internal MedicinePart Eleven「Disorders of Bone and Mineral Metabolism，Chapter 335」，E.Braunwald等人，(eds)，Mc Graw-Hill，New York，1987，pp.1860-1865)，最為普遍已知的維生素D的二種形式是維生素D3和維生素D2。維生素D3在動物和人體的皮膚中內源合成，而維生素D2是由植物提供的維生素D的形式。維生素D2不同於維生素D3之處在於它在C22和C23之間具有一個雙鍵並且還含有一個C24-甲基。在人和大鼠中，維生素D3和維生素D2具有相等的生物效力。
維生素D4(還被稱為輻照的22，23-二氫麥角甾醇或22，23-二氫維生素D2或22，23-二氫麥角鈣化醇)與維生素D3不同之處在於它含有一個C24甲基。維生素D4於1936年第一次被報導，見Grab，W.，Z.Physiol.Chem.，24363(1936)；McDonald，F.G.，J.Biol.Chem.，114IVX(1936).另見Windaus，A和Traut-mann，G.，Z.Physiol.Chem.，247185-188(1937)。這些參考文獻對該維生素生物活性水平的報導有一些不一致，提出在大鼠中，維生素D4是維生素D3的活性的三分之一或四分之三，而在雞中是維生素D3活性的十分之一或五分之一。
在1968年，Deluca等人對維生素D4生物活性作了比較確定的研究，Deluca等人在Arch. Biochem.Biophys.，124122-128(1968)中證實了維生素D4的活性比維生素D3較小。Deluca等人報導，根據他們所掌握的，維生素D4在大鼠中的活性是維生素D3或維生素D2的三分之二，在雞中是維生素D3的活性的五分之一。
Deluca等人提及了這樣的事實「自從維生素D4第一次被Windhaus和Trautmann描述以來，維生素D4的合成一直很少使用」並且評述」這可能是由於維生素D4僅具有學術意義」。
就申請人已知的，自Peluca等人的報導以來維生素D4仍然「僅具學術意義」，因為申請人未察覺有任何進一步的研究。事實上，「The Merck Index」關於維生素D4的陳述是「它的生物學活性似乎值得懷疑」。Merck Index，S.Budavari(ed.)，第11版.，Merck Co.，Rahway，N.J.，(1989)，第1579頁#9930。
自Deluca等人揭示了維生素D3的活性形式，1，25-二羥基維生素D3(美國專利3,697,559)，和它的合成前體，1α-羥基維生素D3(美國專利3,741,996)以來，大部份興趣集中到了開發這些活性維生素D3代謝物的治療用途。遺憾的是作為治療劑有很大前途的組合物D3代謝物由於這些藥劑很大的毒性卻未能充份發揮它的作用。例如，毒性限制了維生素D3、它的活性形式及類似物防止骨損失或使損失的骨再生的效力。很多研究指出，在該藥劑對骨損失的預防或再生有效時所需的劑量下，出現了高鈣血和高鈣尿的問題。據報導，1α-羥基維生素D3在每日劑量為2μg/天(在一些研究中表明該劑量對預防骨損失有效)時引起約67％的病人出現毒性反應。因此需要一種低毒性的生物有效的維生素D代謝物使這種藥能實際上成為一種治療藥物。
本發明的新化合物1α-羥基維生素D4、1，25-二羥基維生素D4和1，24-二羥基維生素D4是維生素D4的生物活性形式。本發明人發現維生素D4的活性形式具有比以往報導的維生素D4的生物測定為基礎所預計的大得多的生物學效力。本發明人還發現該生物活性新化合物的毒性比按它們的生物效力預計的要小。這種高活性與低毒性的結合使本發明的化合物在鈣代謝紊亂的治療中成為有用的治療劑。本發明的新化合物，可用作為由於鈣的異常代謝所導致的疾病的藥物組合物的活性化合物。
為了研究本發明的新化合物，必須研究它的生產方法。已合成了一種α-羥基維生素D4並且在合成過程中還產生了新的中間體。1，25-二羥基維生素D4和1，24-二羥基維生素D4已作1α-羥基維生素D4的代謝生物產物被分離出來。
在審視了下面本發明的詳細說明和附圖後，將會獲知本發明的其它優點，並對其特異的適應性、組合物的種類以及其物理和化學特性，更加充分的了解。
在下文中將結合附圖描述本發明，附圖中類似的符號全部指類似的成分。


圖1說明維生素D4合成的製備步驟；圖2說明以維生素D4為起始原料的1α-羥基維生素D4合成的製備步驟。
本發明提供了合成的1α-羥基維生素D4(1α-OH-D4)化合物以及維生素D4的甲苯磺醯化和環化衍生物。
在此所使用的術語「生物活性」意指化合物的生化性質，例如影響代謝，如影響血清鈣濃度，或與適合的受體蛋白，如維生素D受體蛋白的結合。
一方面，本發明包含通式(I)的生物活性化合物及其鹽、水合物和溶劑化物。 其中R1是H或者OH，R2是H或者OH在通式(I)的那些化合物中優選的是R1和R2均為H；R1＝OH和R2＝H；以及R1＝H和R2＝OH的那些化合物。
另一方面，本發明涉及式(I)化合物的製備。1α-羥基維生素D4即式(I)中R1和R2為H的化合物的合成是按照圖1和2表示的方案完成的。正如在圖1中所看到的，使用麥角甾醇作為合成起始物質。採用相似於Barton等人(JCS Perkin I 1976，821-826)的方法，使麥角甾醇在一個六步驟的方法中使側鏈發生飽和，產生22，23-二氫麥角甾醇(VII)，然後按照Windaus等人(Z，Phy-siol.Chem.1937，147185)的方法輻照該22，23-二氫麥角甾醇，產生維生素D4(22，23-二氫麥角鈣化醇)(IX)。正如在圖2中看到的，使用相似於Paaren等人，(J.Org.Chem.1980，453253)所描述的方法，使維生素D4在一個四步驟法中羥基化，生成1α-羥基維生素D4。
具體地說，(a)將麥角甾醇乙醯化成3β-乙酸酯，(b)然後將該乙酸麥角醇酯的5，6雙鍵進行羥基滷化反應，形成6α-氯-5α-羥基衍生物。(c)還原該氯代醇並再乙醯化成5α-羥基(即5α醇)衍生物，(d)將該5α醇氫化以使其側鏈飽和，(e)還原所得到的3β-乙醯氧麥角甾-7烯-5α-醇成為22，23乙酸脫氫麥角醇酯，(f)再還原生成22，23脫氫麥角甾醇，(g)輻照該22，23脫氫麥角甾醇形成維生素D4，(h)然後將維生素D4甲苯磺醯化生成3β-甲苯磺醯基維生素D4。(i)該甲苯磺酸酯通過溶劑分介反應被置換產生6-甲氧基-3，5-環維生素D4。(j)將該環維生素D4進行烯丙基氧化以形成1α-羥基環維生素衍生物。(k)該1α-羥基維生素隨後被溶劑分解並進行Diels-Alder型反應，除去5-甲氧基基團並從5，6反式-1α-羥基維生素D4中分離出1α-羥基維生素D4(5，6-順式)。
1α-羥基維生素D4的代謝物1，24二羥基維生素D4和1，25二羥基維生素D4是通過與人肝細胞一起孵育該1α羥基衍生物，培養該細胞，並回收1，24二羥基或1，25二羥基維生素D4而合成的，採用維生素D受體蛋白結合試驗測定這些代謝物的生物活性。
已發現式(I)的化合物具有有價值的藥理學活性，即用作鈣代謝尤其是血清鈣濃度的控制劑。具體地說，式(I)化合物在維生素D缺乏的大鼠體中增加血清鈣濃度。還發現式(I)的化合物具有低毒性，這增加了它們的藥理特性。當用LD50試驗測定時，式(I)化合物的毒性與相應的維生素D2化合物相似而低於相應的維生素D3化合物。因此，本發明的化合物可用於各種臨床和獸醫領域，特別是用於治療鈣和磷的異常代謝。
在另一方面，本發明帶來了一種控制鈣代謝的方法，例如用於治療由於肝衰竭、腎衰竭、胃腸道衰竭等引起的異常鈣代謝。式(I)的化合物可用於預防或治療維生素D缺乏疾病和相關疾病，例如腎性骨營養不良、皮脂溢、抗驚厥劑致骨軟化、血磷酸鹽過少致抗維生素D佝僂病、骨質疏鬆，包括絕經後的骨質疏鬆、老年骨質疏鬆、類固醇誘導骨質疏鬆、以及以骨質損失為特徵的其他疾病狀態、假缺乏性(維生素D有關的)佝僂病、營養和吸收障礙佝僂病、甲狀旁腺機能減退、手術後甲狀旁腺機能減退、自發性甲狀腺機能減退、假甲狀旁腺症以及酒精中毒所繼發的骨軟化和骨質減少。式(I)的化合物中，最好是其中的R1或R2是OH，例如1α，24二羥基維生素D4，對於治療皮膚過度增生如牛皮癬很有價值。
式(I)的化合物可用作為藥物組合物的活性成份，在用於例如鈣的異常代謝所導致的疾病時，該組合物與已知的維生素D3的活性形式的類似物相比具有較少的付作用和低毒性，這些藥物組合物組成了本發明的另一方面。
本發明的藥理活性化合物可以按照藥學常規方法加工成為給患者例如包括人的哺乳動物施用的成品藥劑。例如式(I)的化合物可用於與常規的賦形劑，例如不與該活性化合物發生有害反應的、適合於內服(口服)的、非腸道用、或局部用的藥用載體物質混合。
適用的藥用載體包括(但不限於)水、鹽溶液、乙醇、阿拉伯膠、植物油(例如玉米油、棉籽油、花生油、橄欖油、椰子油)、魚肝油、油狀酯如多乙氧基醚、聚乙二醇、明膠、碳水化合物(如乳糖、直鏈澱粉或澱粉)，硬脂酸鎂、滑石、矽酸、粘性石蠟、脂肪酸單甘油酯和二甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
這些藥物製劑可被滅菌並且如果需要的話與輔助劑如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、溼潤劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩衝劑、著色劑、調香劑和/或一種或幾種其他的活性物質例如維生素D3或D2和它們的1α-羥基化代謝物、共軛雌激素或它們的等同物、抗雌激素、降鈣素、二磷酸鹽、鈣補充劑、維生素B12、百日咳毒素和硼。
特別適合於非腸胃道使用的製劑是可注射的滅菌溶液最好是油或水的溶液，以及懸浮劑、乳劑或植入劑包括栓劑，安瓿是合宜的單位劑型。
特別適合於內服使用的是片劑、糖衣丸、液體、滴劑、栓劑、錠劑、粉劑或膠囊劑。如果需要甜賦形劑可使用糖漿、酏劑或類似物。
也可例如通過微型膠囊、多層包衣等配備持續或直接釋放的組合物，例如脂質體或者用不同的降解包衣保護該活性化合物的那些製劑。如微膠囊，多層包衣等。
於局部用時，可使用適當的非噴霧的粘性體、半固體或固體形式，它包含適用於局部用的和動力學粘度最好大於水的可相容載體。適宜的配製物包括(但不限於)溶液劑、懸浮劑、乳劑、霜膏劑、油膏劑、粉劑、搽劑、藥膏、氣霧劑、透皮吸收貼敷膏等，如需要，可將它們滅菌或與輔助劑例如防腐劑、穩定劑、及乳化劑、溼潤劑等混合。
對於直腸給藥，將化合物製備成一種含有栓劑基質如可可豆脂或其他的甘油三酯的藥物組合物。為了延長貯存期，組合物中最好含有抗氧化劑例如抗壞血酸、丁基化羥基苯甲醚或氫醌。
本發明藥物組合物口服使用較好，一般將本發明的化合物調製成在每單位劑型的藥用載體中含有大約0.5μg至大約25μg的單位劑量形式。本發明化合物的劑量一般是0.01至0.5μg/Kg/天，優選大約0.04至大約0.3μg/Kg/天。
應當理解，事實上在具體病例中活性化合物的優選量是根據所使用的具體的化合物的效力、特定的組合物的配方、使用形式和被治療的特定的部位及器官而變化。例如，特定病人的具體劑量取決於年令、體重、健康的一般狀況、性別、飲食、給藥時限以及形式、排出速率和結合使用的藥物以及被治療對象特定疾病的嚴重程度。給定宿主的劑量可用常規的考慮因素確定，例如將主題化合物與已知藥劑的活性進行常規對照，例如通過適當的常規的藥理學規範方法。
此外，本發明的化合物還可以有益地用於獸藥組合物中，例如用於治療或預防低血鈣的家畜的飼料組合物中。一般來說，將本發明的化合物分散在飼料中，使得這樣的飼料的正常消耗提供給動物大約0.01至大約0.5μg/Kg/天的本發明化合物。
下面的例子僅構成說明而不以任何方式限制說明書的其他部份。在下面的例子中，所有的溫度均採用攝氏度(除非另有標示)，所有的份數和百分數均按重量計。質子核磁光譜(1H NMR)是用帶有計算機3000的IBM Sy-200(200mHz)和BrukerAm 400(400mHz)在CDCl3溶液中用CHCl3作為內標進行記錄的。紅外光譜是用該溴化鉀(KBr)片或液體樣品，用付立葉轉換(Fourier transform(FTIR))進行記錄的。質譜是用FinniganMAT-90質譜儀在20eV/CI下進行記錄的。溶點在Hoover-Thomas(毛細管)Uni-Melt和Fisher-Johns熔點儀(滑動蓋型)中進行。
例11α-羥基維生素D4的合成將100克(0.25摩爾)麥角甾醇溶解在600毫升無水吡啶和68毫升(0.7摩爾)乙酸酐中，使麥角甾醇(II)轉化成乙酸麥角甾醇酯(III)。在室溫攪拌該溶液過夜，然後加入1.2升冰冷卻該溶液，促使產生沉澱。用每次400毫升的水洗沉澱五次，然後用400毫升CH3CN洗一次。將所得產品空氣中乾燥，生成79克(71％)的乙酸麥角甾醇酯，呈白色晶體並且有如下特徵熔點(m.p.)169-171℃；H1NMR(400MHz，CDCl3)，δppm2.05(3H，S，3β-CH3CO)，4.65-4.75(1H，m，3α-H)5.15-5.25(2H，m，22-H和23-H)，5.4(1H，α，6-H)，5.6(1H，d，7-H)；FTIR[KBr]1734cm-1(C＝O伸展)968cm-1(C-H彎曲)。
將乙酸麥角甾醇酯(III)(26gm，0.062M)溶解於2.5升新蒸餾過的脫氧甲苯中，在氮氣氛下，在-78℃將溶於240ml幹CH2Cl2中的9ml(0.111mol)鉻醯氯在30分鐘內加到該溶液中。在-78℃將該反應系統再攪拌15分鐘，然後加入一份硼氫化鈉在乙醇中的飽和溶液62毫升，再於-78℃攪拌15分鐘後，將反應液傾倒到3N鹽酸(3升)和苯(3升)所形成的兩相系統中，分離出有機層，並用水(2升)洗，再用鹽溶液(2×1升)洗兩次，用無水MgSO4脫水。過濾所得脫水的溶液並真空濃縮，用CH3CN(280毫升)處理所得到的粗結晶產品，並過濾這樣形成的漿體產生12.5克(41％)白色結晶3β-乙醯氧基-6α-氯化麥角甾-7，22-二烯-5α醇(IV)，具有如下特徵m.p190-192℃；1H NMR(400NMz，CDCl3)，δppm 2.05(3H，s，3β-0Ac)，4.65(1H，d，6β-H)，5.1(1H，s，7-H)，5.1-5.3(2H，m，22-H和23-H)；FTIR[KBr]1732cm-1(C＝O伸展)968cm-1(C-H彎曲)，3437cm-1(O-H伸展)。
在室溫下氮氣中將3β-乙醯氧基-6α-氯代麥角甾-7，22-二烯-5α-醇(IV)(21.4克，0.044摩爾)的無水THF(900毫升)溶液緩慢地加到攪拌著的氫化鋰鋁(2.66克，0.07摩爾)在無水THF(750毫升)的懸浮液中，將該混合物回流三小時後冷卻至0℃。用飽和的Na2SO4溶液將過量的氫化物分解，通過無水Na2SO4過濾並蒸發所得濾液得到一固體，直接用乙酸酐(110毫升)和無水吡啶(220毫升)在0℃進行處理。減壓除去溶劑生成乙酸鹽(12.75克61％)，3β-乙醯氧麥角甾-7，22-二烯-5α-醇(V)，它具有下列特徵M.P.229-232℃，FTIR(KBr)1736cm-1(C＝O伸展)，3460cm-1(O-H伸展)，972cm-1(C-H彎曲)。
在H2氣(15psi)氛下，將3β-乙醯氧麥角甾-7，22-二烯-5α-醇(V)(2.5克，0.0055摩爾)與新製備的PtO2(0.5克)在乙酸乙酯(820毫升)中振搖16小時。過濾除去催化劑，蒸發濾液，將得到的粗製乙酸酯溶解在CH2Cl2中並在矽膠上進行層析。用CH2Cl2洗脫，得到基本上純的3β-乙醯氧麥角甾-7-烯-5α-醇(VI)(2.15克，85％)，呈白色結晶物，並且具有如下特徵m.p.228-232℃，1H NMR(400MHz，CDCl3)，δppm 2.05(3H，s，3β-OAc)，5.05-5.20(2H，m，3α-H和7H)；FTIR(KBr)1736cm-1(C＝O伸展)，3462cm-1(O-H伸展)。
在0℃在氮氣氛中，將在無水吡啶(170毫升)中的重蒸亞硫醯氯(9.7毫升)加到在無水吡啶(800毫升)中的化合物3β-乙醯氧麥角甾-7-烯-5α-醇(VI)(12.0克，0.0262摩爾)中。2.5小時後，用冰冷的H2O(1.5升)稀釋該溶液並用二份乙醚(2.5升＋1.5升)提取，用NaHCO3溶液(1.0升×2)，然後用1N HCl(1.5升×2)和水(1升)洗滌合併的醚提取液。然後用MgSO4將該醚溶液脫水，過濾之後，減壓蒸乾產生的粗製品，用CH3CN(100毫升)轉化成漿料，過濾收集該產品並用CH3CN重結晶，產生4.5克(39％)白色結晶乙酸22，23-二氫麥角甾酯(VII)，它具有如下特性m.p.144-147℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)，δppm 2.05(3H，s，3β-OAc)，4.65-4.75(1H，m，3α-H)，5.4(1H，d，6-H)，5.6(1H，d.7-H)；FTIR(KBr)1734cm-1(C＝O伸展)。
乙酸22，23-二氫麥角甾酯(VII)(4.8克，0.011摩爾)一次加入室溫下攪拌著的氫化鋰鋁(2.5克，0.066摩爾)在無水乙醚1.1升的懸浮液中。在室溫下攪拌該反應物二小時，加入5N NaOH使過量的氫化鋰鋁失效並加入H2O(500毫升)。用四份250毫升的乙醚提取該水溶液，合併乙醚提取液並用鹽水(1升)洗滌該合併的有機層。然後用Na2SO4乾燥，減壓蒸去乙醚得到化合物22，23-二氫麥角甾酵(VIII)(4.1克，94％)，呈白色結晶體，並具有下列特性m.p.147-150℃；1H NMR(400 MHz，CDCl3)，δppm 3.6-3.7(1H，m，3α-H)，5.4(1H，d，6H)，5.6(1H，d，7-H)；FTIR[KBr]3400cm-1(O-H伸展)。
將22，23-二氫麥角甾醇(VIII)(2.0克，5.0毫摩爾)溶解在乙醚和苯(4∶1，600毫升)的溶液中，在氬氣氛下在水冷卻的石英容器中隨著攪拌進行輻照(Hannovia immersion燈，450瓦)三小時。真空濃縮該溶液，產生一種膠狀固體，將它再溶解在100毫升乙醇中並在氬氣氛下加熱回流八小時。然後，在真空中濃縮，將殘留物吸附到矽酸柱上並用30％乙酸乙酯在己烷中的溶液提洗，以1.2g(60％)的產量得到維生素D4(22，23-二氫麥角鈣化醇(IX)，它具有如下特徵1H NMR(400MHz，CDCl3)，δppm 0.55(3H，s，18-H3)0.78(6H，dd，26-H3和27-H3)0.87(3H，d，21-H3)0.93(3H，d，28-H3)3.94(1H，m，3-H)4.82(1H，m(尖峰)，19-H)，5.04(1H，m(尖峰，19-H)6.04(1H，d，7-H)6.24(1H，d，6-H)。
在0℃，向攪拌著的維生素D4(IX)(3.0克，7.5毫摩爾)在10毫升的無水吡啶的溶液中加入新重結晶的對甲苯磺醯氯(3.6克，19毫摩爾)。在5℃攪拌反應混合物24小時，然後將混合物傾到至冰和飽和NaHCO3(100毫升)中攪拌使之驟冷。用CH2Cl2(3×300毫升)提取該水懸浮液，合併所得到的有機提取液，用10％HCl(3×200毫升)、飽和的NaHCO3(3×200毫升)和飽和NaCl(2×200毫升)洗滌，用MgSO4乾燥，真空濃縮得到3.5克(84％)新的中間化合物維生素D4甲苯磺酸酯(X)，它具有下列特性1H NMR400MHz，CDCl3)，δppm 0.54(3H，s，18-H3)0.78(6H，dd.26-H3和27-H3)0.87(3H，d，21-H3)，0.96(3H，d.28-H3)2.45(3H，s.CH3(甲苯磺酸酯)4.68(3H，m，3-H)4.82(1H，m(尖峰)，19-H)5.04(1H m(尖峰)，19-H)，5.95(1H，d7-H)，6.09(1H，d，6-H)7.34和7.79(4H，d，芳香族的)。
將在無水CH2Cl2(10毫升)中的維生素D4甲苯磺酸酯(X)(3.5克，6.3毫摩爾)溶液滴加到攪拌著的NaHCO3(17.0克，202毫摩爾)在甲醇(200毫升)的懸浮液中。在氬氣氛下，將反應混合物回流過夜，然後冷到室溫，並在真空中濃縮到大約50毫升，用乙醚(600毫升)烯釋該反應濃縮物，用水(3×300毫升)洗滌，MgSO4乾燥，並在真空中濃縮。將殘留物通過矽膠柱並用10％乙酸乙酯的己烷溶液提洗，得到新的中間化合物3，5環維生素D4(XI)(重油)，產量1.5克(58％)，具有下列特徵1H NMR(400MHz，CDCl3)，δppm0.56(3H，s，18-H3)0.78(6H，dd26-H3和27-H3)，0.87(3H，d.21-H3)，0.94(3H，d，28-H3)，3.28(3H，s，OCH3)4.2(1H，d，6-H)，4.91(1H，m(尖峰)19-H)，4.98(1H，d，7-H)，5.08(1H，m(尖峰)，19-H)。
將無水叔丁基氫過氧化物在甲苯(3M)(2.6毫升，7.8毫摩爾)中加至在三頸燒瓶中攪拌著的二氧化硒(0.22克，2毫摩爾)在無水CH2Cl2(150毫升)的懸浮液中。混合物在氬氣中攪拌三小時。然後加入吡啶(0.3毫升，3.7毫摩爾)，然後加入環維生素D4(X1)(1.5克，3.6毫摩爾)在CH2Cl2(50毫升)中的溶液，攪拌30分鐘後，加入10％NaOH水溶液(200毫升)，然後用乙醚(500ml)稀釋反應混合物，分離兩相。有機相用10％NaOH(3×200毫升)、水(2×200毫升)和飽和NaCl溶液(2×200毫升)洗滌、在MgSO4中乾燥並真空濃縮。將殘留物吸收到矽膠柱上，用30％乙酸乙酯的己烷溶液提洗，得到0.45克(29％)新的中間化合物1α-羥基3，5-環維生素D4(XII)(油)，並具有下列特徵1H NMR(400MHz，CDCl3)，δppm0.54(3H，s，18-H3)0.78(6H，dd.26-H3和27-H3)0.86(3H，d，21-H3)0.95(3H，d，28-H3)3.26(3H，s，OCH3)4.2(1-H，d.6-H)，4.22(1H，m，1-H)，4.95(1H，d，7-H)，5.18(1-H，α，19-H)5.25(1H，d，19-H)。
在氬氣中，將1α-羥基3，5-環維生素D4(XII)(0.45克，1.05毫摩爾)在二甲基亞碸(4.5毫升)與冰醋酸(3.6毫升)形成的溶液中加熱到50℃持續1小時。然後將反應混合物傾入冰和飽和的NaHCO3溶液(100毫升)中，用乙醚(3×200毫升)提取，合併醚提取液，用飽和的NaHCO3溶液(3×200毫升)，水(3×200毫升)和飽和NaCl溶液(3×200毫升)洗滌，用MgSO4乾燥，真空濃縮，得到含有5，6-順式和5，6-反式1α-羥基維生素D4(根據1H NMR大約為4∶1)的混合物，產量為0.4克(92％)。將5，6-順式和5，6-反式1α-羥基維生素D4的混合物(0.4克，0.97毫摩爾)溶解在醋酸乙酯(25毫升)中，用新重結晶的馬來酐(0.08克，0.8毫摩爾)處理。在氬氣中，將反應混合物加熱到35℃，保持24小時。真空中蒸發該溶劑，將粗製混合物在矽膠柱上進行層析，使用醋酸乙酯和己烷(1∶1)作為提洗液，得到維生素D4的新的活性形式，5，6-順式1α-羥基維生素D4(XIII)，產量90毫克(23％)，具有下列特徵m.p.128-130℃；IR ν max(Neat)3400cm-1(OH伸展)；1H NMR(400MHz，CDCl3)，δppm 0.55(3H，s，18-H)0.79(6H，dd.26-H3和27-H3)0.87(3H，d，21-H3)0.94(3H，d，28-H3)，4.24(1H，m，3-H)，4.44(1H，m，1-H)，5.02(1H，m(尖峰)，19-H)，5.34(1H，m(尖峰)，19-H)，6.02(1H，d7-H)，6.4(1H，d，6-H)；質譜[CI]m/e(相對強度)415(M＋1，41％)397，(M＋1-OH 100％)，379(27％)，135(22％)。
例21α-羥基維生素D4的生物試驗給雄性斷奶的大鼠(HOltzman株，Holtzman公司，Madison，Wisconsin)飼餵含有充份的鈣(0.47％)和磷(0.3％)但缺乏維生素D的食料三至四周，這樣的食料導致以低血清鈣和不良生長為特徵的極度維生素D缺乏。在這樣的飲食四周後，鼠的血清鈣值低於7毫克/分升。然後將鼠分成四組，在14天內每一天均給予在載體如椰子油中的1α-羥基維生素D4或者僅給載體(對照)，在最後給藥的24小時後，處死鼠並用通常實驗室技術測定血鈣，所得結果在表1中給出。
表1血清鈣濃度的增加化合物 劑量大鼠數量血清鈣濃度(mg/dl)(μg/Kg/天) ±標準偏差對照 - 10 6.1±0.481α-OH-D40.042 8 7.1±0.801α-OH-D4O.250 7 11.6±0.451α-OH-D41.500 9 12.7±0.37表1的數據顯示出1α-羥基維生素D4對於缺乏維生素D鼠能有效增加其血清鈣，並且該應答顯示出劑量依賴性。令人驚奇的是，這樣的應答水平，可以與Wientroub等人所報導的，在相似於以上所描述的實驗條件下，將1，25二羥基維生素D3施用於缺乏維生素D的鼠得到的結果相比擬。(見Wientroub，S.，Prid，P.A.，Reddi，A.H，「The Dichotomy in the Effects of 1，25 dihydroxy vitamin D3and 24，25 dihydroxy vitamin D3on Bone Gamma-Carboxygluta-mic Acid-containing Protein in Serum and Bone in Vitamin D-Deficient Rats.」Calcif Tissue Int(1987)40166-172。
例3毒性試驗採用已知方法測定平均致死劑量(LD50)來評價1α-OH-D4的急性口服毒性。用標準實驗室飲食飼養大鼠8-10周。每種性別的五隻動物給於-次口服劑量的1α-OH-D4。觀察這些動物14天，記錄死亡數。測得的LD50值在雄性中大約為1.0毫克/公斤在雌性中為3.0毫克/公斤。
為了進行比較，申請人發現在同樣條件下1α-羥基維生素D2的LD50在雄性和雌性大鼠中分別為1.7和1.8毫克/公斤。1α-羥基維生素D2的毒性據報導比1α-羥基維生素D3小。Sjoden，G.，Smith，C.，Lindgren，U.，和Deluca，H.F.，Proc.Soc.Experi mental Biol.Med.，178432-436(1985)。
例41，25-二羥基維生素D4的產生和分離本發明的1α-羥基維生素D4與培養的人肝細胞-起保溫，人肝細胞將該化合物代謝成為幾種產物，其中包括代謝物1，25二羥基維生素D4。通過高壓液相色譜分離和純化該1，25代謝物，用氣相色譜-質譜法進行鑑別。鍵合研究證明1，25二羥基維生素D4對於哺乳動物維生素D受體蛋白具有很好的結合親和力，表明它是具生物活性的。所使用的方法相似於Strugnell等人描述的方法(Biochem.Pharm.vol 40333-341(1990))。
例51，24-二羥基維生素D4的產生和分離如例4所描述的方法完成1，24-二羥基維生素D4的產生和分離。將本發明的1α-羥基維生素D4與培養的人肝細胞一起保溫，人肝細胞將該化合物代謝成為幾種產物，其中包括代謝物1，24二羥基維生素D4。通過高壓液相色譜分離和純化該1，24代謝物，用氣相色譜-質譜法進行鑑別。該新的代謝物的結合研究證明該代謝產物對於哺乳動物維生素D受體蛋白具有很好的親和力，表明了該藥物是具生物活性的。
例6高鈣血試驗給雌性大鼠餵食含有0.8％鈣和0.6％磷的商品飼料。將鼠分成四組，各組每日或給予口服在如椰子油這樣的載體劑中的1α-OH-D4或僅給予載體(對照)13星期。在最後-次給藥後24小時後處死鼠，通過標準方法測定它們的血清鈣。
該方法證明在1α-OH-D4劑量高至2.5μg/Kg/天時，血清鈣濃度未受影響或僅有輕微上升。
例7進一步的生物學試驗給雄性斷乳的大鼠餵食缺乏維生素D和低鈣(0.02％)飼料。在四個星期過去後，將鼠分成四組，或靜脈給予在如乙醇之類的載體中的1α-OH D4或者僅給予載體(對照)。給藥後16小時處死鼠，按照Martin和Deluca，Am. J.Physiol.2161352-1359的方法，使用外翻十二指腸囊測量腸內鈣轉移。
下面的方法證明腸內鈣轉移的刺激是劑量依賴性的。
例8對患經絕後骨質疏鬆的，年令為55至75歲的門診病人進行了臨床研究。該研究包括將達120個之多的病人隨機分為三個治療組，研究持續12至24個月。二個治療組接受1α-維生素D4的恆定的劑量(u.i.d；3.0μg/天以上的兩個不同的劑量水平)，另一個組接受配合的安慰劑。所有病人保持飲食鈣的正常攝入(500至800毫克/天)並且不使用補鈣劑。通過比較各組病人治療前後的下列方面來評估其效果(a)通過X射線吸收比色計(DEXA)測量全身的、撓骨的、股骨的和/或脊柱的骨礦物質密度，(b)髂骨嵴的骨活體組織檢查以及(c)血清骨鈣的檢測。安全性是通過比較尿羥基脯氨酸排洩、血清和尿鈣水平、肌酐酸清除率、血脲氮和其他常規檢驗來評估的。
該研究證明了用1α-維生素D4治療的病人比用安慰劑處理的病人顯示明顯高的全身的、撓骨的、股骨的和/或脊柱的骨密度，被治療的病人的血清骨鈣還顯示明顯的升高。進行治療的病人的骨活組織檢查顯示1α-維生素D4刺激正常骨形成。所檢測的安全參數證明，隨著用1α-維生素D4治療，高鈣血或高鈣尿或其他的代謝障礙的發生率微不足道。
例9對經絕後的年令為55至60歲的健康婦女進行了臨床研究。該研究包括將達80個之多病人隨機分為兩個治療組進行持續12至24個月的研究。一個治療組接受1α-維生素D4的恆定劑量(u.i.d.；3.0μg/天以上的劑量水平)而另一組接受相應的安慰劑，該試驗如上面例2所描述的進行。
該試驗證明，用1α-維生素D4治療的病人與基準值相比，全身的、撓骨的、股骨的和/或脊柱的骨密度損失降低。相比之下，用安慰劑處理的病人的這些參考與基準值相比有明顯骨損失。所檢測的安全參數證明該劑量水平長期服用1α-維生素D4是安全的。
例10用患有腎病的發生長期血流滲析的30個男人/或女人進行12個月的雙盲安慰對照臨床試驗。所有的病人先進入八周的對照期，在這期間，它們接受維生素D3的維持劑量(400IU/天)。在對照期後，將病人隨機分為兩個治療組，一組接受1α-維生素D4恆定劑量(u.i.d.，大於3.0μg/天的劑量)而另一組接受相應的安慰劑。該兩個治療組均給予維生素D3維持劑量，保持飲食鈣的正常攝入量並均使用補鈣劑。通過比較該兩組病人治療前後的下列方面來評估其效果(a)直接測量腸內鈣吸收，(b)全身的、橈骨的、股骨的和/或脊柱的骨礦物質密度和(c)血清鈣和血清骨鈣的檢測，通過血清鈣的定期監測評價其安全性。
正如通過使用單同位素法或雙同位素法測定所確定的那樣，臨床數據分析表明了1α-維生素D4明顯地增加血清骨鈣水平和腸的鈣吸收。用該化合物治療的病人表現出血清鈣水平被正常化，與基準值相比，全身的、撓骨的、膠骨的和/或脊柱的骨密度值穩定。對照之下，用安慰劑治療的病人經常出現低鈣血，全身的、撓骨的、股骨的和/或脊柱的骨密度明顯降低，在該治療組觀察到高鈣血發生率很小。
本發明現已以某種具體的方式描述並舉例，該領域的專業人員會知道在上面所描述的內容中可以作出各種改進，包括改變、增加和省略。因此，本發明也企圖包括這些改進內容，並且本發明的範圍僅僅受到法律能夠賦予所附權利要求的最寬解釋的限制。
權利要求
1.如下所示的式(I)化合物作為製備用於治療骨質疏鬆症藥物的應用 式中R1是H或OH，以及R2是H或OH。
2.根據權利要求1的應用，其中所說的化合物是1α-羥基維生素D4。
3.根據權利要求1的應用，其中所說的化合物是1，24-二羥基維生素D4。
4.根據權利要求1的應用，其中所說的化合物是1，25-二羥基維生素D4。
5.根據權利要求1的應用，其中所說的應用包括應用於製備施用於患骨質疏鬆症患者的藥物的式(I)化合物的量是治療該骨質疏鬆症的有效量。
6.根據權利要求1的應用，其中該藥物包含治療有效量的式(I)化合物和生理上可接受的賦形劑。
7.根據權利要求1的應用，其中當該藥物是口服施用的藥物時式(I)化合物的量是0.01至0.5μg/kg/天。
8.根據權利要求1的應用，其中當該藥物是口服施用的藥物時，式(I)化合物的優選量是0.04至0.3μg/kg/天。
9.根據權利要求1的應用，其中所說的該式(I)化合物的量是3.0μg/天。
全文摘要
新的1α-羥基維生素D
文檔編號C07C35/21GK1130507SQ95119400
公開日1996年9月11日 申請日期1995年11月8日 優先權日1990年9月21日
發明者J·C·克努森, C·W·畢曉普, R·M·莫裡亞蒂 申請人:倫納公司