dcf-1基因剔除小鼠模型、其構建方法及其應用的製作方法

2023-06-10 13:14:46 1

專利名稱：dcf-1基因剔除小鼠模型、其構建方法及其應用的製作方法
dcf-l基因剔除小鼠模型、其構建方法及其應用技術領域本專利涉及一種dcf-l基因剔除小鼠模型、其構建方法及其應用。 發明背景神經幹細胞(Neural stem cell, NSC)是一類可以自我更新複製，並具有分化成為神經 元和膠質細胞潛能的細胞。與神經幹細胞分化相關的dcf-1基因的高表達有助於幹細胞維持 未分化狀態，而沉默dcf-1基因的表達可以加速神經幹細胞的分化過程。小鼠已成為研究人類疾病的一種重要模式生物。Cre-loxP系統，己經能夠較為容易的實 現基因的敲除從而構建基因剔除小鼠模型。動物行為學及組織化學的迅速發展，realtimePCR 之類的高新技術手段在實驗室中運用，給予了我們從一個生物整體的角度研究基因功能的良 好平臺。 發明內容本發明的目的之一在於提供一種與神經幹細胞分化相關的dcf-1基因剔除小鼠模型。 本發明的目的之二在於提供該模型的構建方法。 本發明的目的之三在於提供該模型在篩選抗焦慮藥物中的應用。 本發明的目的之四在於提供該模型在製備促進5-羥色胺祌經元發育藥物中的應用。 為達到上述目的，本發明採用如下技術方案 一種與神經幹細胞分化相關的dcf-1基因剔除小鼠模型。一種構建上述的dcf-1基因剔除小鼠模型的方法，其特徵在於該方法的具體步驟為利用Cre-loxP系統，將打靶載體電擊轉化胚胎幹細胞，使其與基因組發生同源重組。再將胚胎 幹細胞移植入胚胎，產生在dcf-1基因的兩側帶有loxP位點的後代，將這些後代與表達Cre 重組酶的小鼠雜交，就會產生dcf-1基因剔除小鼠模型。上述的dcf-1基因剔除小鼠模型在篩選抗焦慮藥物中的應用。上述的dcf-1基因剔除小鼠模型在製備促進5-羥色胺神經元發育藥物中的應用。 本發明通過Cre — loxP系統，構建了確為可靠的dcf-1基因剔除小鼠模型。然後通過動物行為學實驗，發現dcf-1基因的剔除會導致小鼠產生焦慮情緒。為了更好的研究dcf-1基因與焦慮之間的關係，本發明使用了 realtime PCR技術和組織化學等手段，進一步發現dcf-l基因的剔除會影響5-羥色胺神經元的發育成熟。


圖1為dcf-l基因剔除小鼠構建圖，圖中標示小鼠的基因組結構，鑑定方法以及鑑定結 果。其中A-D分別為野生型小鼠、打靶載體、dcf-1 loxP小鼠和dcf-l剔除小鼠的基因組結 構。E為在基因組水平證實剔除的發生。F為在表達水平證實剔除的發生。圖2為dcf-1基因剔除小鼠的行為學實驗結果，顯示了嚴重的焦慮傾向。A為進入開放 臂和中央區域的次數。B為在開放臂停留的時間。圖3為dcf-l基因剔除小鼠5-羥色胺神經元考察結果，結果顯示5-羥色胺神經元數量明 顯減少。A為5-羥色胺神經元標誌物Pet-l的表達量，C-D分別為野生型、dcf-l+/-和dCf-l-/-小鼠的中縫背核切片。
具體實施方式
實施例一dcf-l基因剔除小鼠模型的構建dcf-l基因的剔除可以利用Cre-loxP系統來實現。將打靶載體電擊轉化胚胎幹細胞，使 其與基因組發生同源重組。再將胚胎幹細胞移植入胚胎，產生在dcf-l基因的兩側帶有loxP 位點的後代。將這些後代與表達Cre重組酶的小鼠雜交，就會產生dcf-1基因剔除小鼠。通 過基因組PCR， RT-PCR，本發明驗證了此模型中確實發生了 dcf-l基因的缺失，結果如圖1 所示。實施例二 dcf-1基因的功能研究1. 行為學研究本發明對dcf-l基因剔除小鼠進行高架十字迷宮行為學測試。先將小鼠放在 迷宮的中央區域，然後觀察小鼠在5分鐘內的行為，包括進入進入開放臂和中央區域的次數 以及在開放臂區域停留的時間。結果如圖2所示，WT小鼠進入中央區域的次數與Cfcf"+/-和(^/^-/-小鼠的沒有明顯的區別，說明它們在迷宮中穿梭的頻率基本相當，選擇進入開放臂 還是封閉臂的機會也基本相等；但是野生型進入開放臂的次數高於後兩種基因型，WT小鼠 在開放臂停留的時間也明顯長於cfc/^+Z-和01(;/4-/-小鼠。結果表明dcf-l基因剔除小鼠物 行為的異常符合公認的焦慮行為特徵。2. 5-羥色胺神經元考察本發明針對5-羥色胺神經元的標誌物Pet-1進行realtime PCR，同 時將dcf-l基因剔除小鼠的腦組織切片並染色，發現dcf-l基因剔除小鼠的5-羥色胺神經元 數量明顯減少，結果如圖3所示。神經元考察的結果表明dcf-l基因敲除導致小鼠5-HT神 經元明顯減少，是小鼠產生焦慮行為的原因。
權利要求
1.一種與神經幹細胞分化相關的dcf-1基因剔除小鼠模型。
2. —種構建根據權利要求l所述的dcf-l基因剔除小鼠模型的方法，其特徵在於該 方法的具體步驟為利用Cre-loxP系統，將打靶載體電擊轉化胚胎幹細胞，使 其與基因組發生同源重組。再將胚胎幹細胞移植入胚胎，產生在dcf-l基因的兩 側帶有loxP位點的後代，將這些後代與表達Cre重組酶的小鼠雜交，就會產生 dcf-l基因剔除小鼠模型。
3. —種根據權利要求1所述的dcf-1基因剔除小鼠模型在篩選抗焦慮藥物中的應 用。
4. 一種根據權利要求1所述的dcf-1基因剔除小鼠模型在製備促進5-羥色胺神經元 發育藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種與神經幹細胞分化相關的基因dcf-1及其應用。通過同源重組，胚胎幹細胞移植以及Cre-loxP系統，我們得到dcf-1基因剔除小鼠，並且發現該基因的剔除會導致小鼠產生焦慮情緒。藉助realtime PCR和組織化學等手段，我們還發現dcf-1基因剔除會導致Pet-1表達量下調，影響5-羥色胺神經元的發育。
文檔編號C12N15/85GK101574074SQ200910053359
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月18日 優先權日2009年6月18日
發明者婕 吳, 文鐵橋, 譚智昊 申請人:上海大學