快速檢測重金屬脅迫下核仁蛋白質定位的免疫螢光方法
2023-06-08 16:11:56 2
專利名稱：快速檢測重金屬脅迫下核仁蛋白質定位的免疫螢光方法
技術領域：
本發明屬於細胞生物學技術領域，涉及一種快速檢測重金屬脅迫下核仁蛋白質變 化的定位方法。更具體的說是一種檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁B23蛋白質定位的免 疫螢光方法。該方法為研究重金屬毒害植物細胞機理提供新的技術支持。
背景技術：
近年來隨著現代工業的迅速發展，礦山開採和礦石的冶煉，化肥和農藥的不合理施 用,"三廢"和城市生活垃圾的排放，汙泥農用等都導致了環境汙染問題日益嚴重，尤其是 含有重金屬(As、 Cd、 Co 、 Cr 、 Cu、 Hg、 Mn、 Ni 、 Pb、 Zn等)的汙染物通過各 種途徑進入環境，並且通過食物鏈危害動物和人體健康，導致大氣和水環境質量的進一 步惡化。目前，全球性的重金屬汙染狀況日益嚴重，如何控制和減輕重金屬對環境的汙 染和危害，已成為環境、土壤及相關學科科學家們關注的熱點課題。 一些研究表明了低 濃度重金屬對植物的生長有積極的刺激作用，但當細胞中重金屬濃度過高，則對植物的 生長產生毒害作用，引起植物生理、生化的變化；抑制植物生長；損傷細胞結構；影響 植物正常生長發育。
核仁(nucleolus)是細胞核內高度緊密的結構，它是rDNA轉錄和核糖體亞基組裝的 場所。核仁不僅是細胞內通訊和核糖體RNA加工的中心，而且在細胞周期，細胞增殖 和衰老中起重要的調控作用； 一般來說，核仁的化學成分主要由DNA、 RNA、蛋白質 和酶類等組成。其中以蛋白質為主，佔乾重的80%。 RNA約佔乾重的10。/。，它多與蛋 白質結合，以核蛋白的形式存在。利用蛋白質組學方法已鑑定了 350中核仁蛋白，這些 蛋白質與核仁的功能密切相關。目前，重金屬脅迫下能夠誘導損傷核仁的結構，影響核 仁蛋白功能的報導已引起相關領域科學家的關注。人們利用生理生化方法、分子生物學 和細胞生物學手段，從不同角度研究重金屬對核仁蛋白質合成、分布及功能的影響。其 中，硝酸銀染是特異顯示核仁中酸性非組蛋白的一種染色方法，常用於研究核仁蛋白質 的定位。發明人利用此技術研究了不同重金屬(Cd、 Cr 、 Cu、 Hg、 Mn、 Ni 、 Pb、 Zn、 Al)脅迫對大蒜、洋蔥、蠶豆及玉米等植物幼苗根尖細胞核仁的影響，這些研究結果表蛋白物質外溢到細胞質中。其他學 者的研究也得到相同的結果，李曉玲、張義賢用不同濃度氯化鎳處理對綠豆和大麥後， 通過銀染的方法也觀察到N產能夠誘導綠豆和大麥根尖細胞核仁銀染蛋白顆粒數量明 顯增加。因此，利用銀染技術研究對重金屬對植物細胞核仁結構的影響，具有一定的科 學價值。
但是，銀染技術只能鑑定重金屬脅迫後，從細胞核外溢到細胞質中的銀染顆粒是核 仁蛋白，不能鑑定是哪些種核仁蛋白受到重金屬脅迫的影響，對深入研究重金屬毒害機 理有一定的局限性。
近些年來，螢光免疫分析技術的發展尤為迅速，已在生命科學領域中廣泛地用於測 定生長因子、蛋白質定位、核酸分析、神經遞質等方面研究。核仁蛋白B23是真核細胞 核仁的重要的蛋白組份之一，在核糖體前體的加工、裝配和運輸、維持核仁的結構、功 能和調節細胞生長等方面具有重要作用。但是，利用免疫螢光技術研究重金屬脅迫對核 仁周期過程中B23蛋白質的功能和動態變化的影響尚未見文獻報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁B23蛋白質定位的免疫 螢光方法，為研究逆境脅迫下細胞中蛋白質定位及變化特徵提供了簡易、準確、快速的 方法。
本發明人結合實驗室前期工作，發明了一種檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁B23蛋 白質定位的免疫螢光方法。該技術的主要原理是將免疫學方法(抗原抗體特異結合)與熒 光標記技術結合起來，研究特異蛋白抗原在細胞內分布的方法。由於螢光素所發的螢光 可在螢光顯微鏡下檢出，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含 量。特別是本發明涉及的壓片方法的改革，能夠提高觀察細胞數目，可適用於其它細胞 生物學研究。為達到上述目的，本發明提供如下的技術方案-
一種檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁B23蛋白質定位的免疫螢光方法，其特徵在 於，按如下的步驟進行-
(1) 切取重金屬處理後的植物根尖分生組織細胞，於4M多聚甲醛中固定l-2h;經 PBS緩衝液洗；
(2) 採用2.5%纖維素酶+2.5%果膠酶酶液於37'C溫箱酶解；經PBS緩衝液洗滌後壓片；
(3) 將植物根尖轉至離心管中，滴加PBS緩衝液，手搖震蕩至多數細胞游離狀態， 用滴管吸取約0.1-0.2ml樣品液，均勻塗於載玻片上分散成單個細胞，標記後自然風乾 後備用；
(4) 將(3)得到的載玻片放在l%TritonX-100浸泡15-20分鐘；經PBS緩衝液洗滌；
(5) 在(4)得到的載片上滴入15-2(^1配好的一抗，蓋上蓋玻片，37'C溫箱孵育lh-1.5 h;再經PBS緩衝液洗滌；
(6) 再將(5)得到的載片上滴入15-2(Hil配好的二抗，蓋上蓋玻片，37。C溫箱孵育 45min-lh;經PBS緩衝液洗滌；
(7) 再將(6)的載玻片上滴加15-20plDAPI，蓋上蓋玻片；經PBS緩衝液洗滌；
(8) 用濾紙吸乾多餘PBS，滴加5-10pl防淬滅劑於載玻片材料上，蓋上蓋玻片，用 指甲油將蓋玻片四周封好，l-2h後在螢光顯微鏡下觀察。
本發明所述的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁B23蛋白質定位的免疫螢光方法，其 中步驟(2)中酶解所用時間是指在鏡檢時如果觀察到大部分細胞均分散開，成一層 球形原生質體，其中少量細胞的細胞質已經解體，只剩下細胞核時，即結束酶解。
本發明所述的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁B23蛋白質定位的免疫螢光方法，其 中步驟(2)中所述的壓片是指酶解後直接將樣品製成懸浮液狀態，然後，均勻地滴 在載玻片上，不蓋載玻片，自然風乾後備用。
本發明所述的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁B23蛋白質定位的免疫螢光方法，其 中的一抗為鼠抗B23單克隆抗體，其濃度為0.5mg/ml。
本發明所述的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁B23蛋白質定位的免疫螢光方法，其 中的二抗為FITC—兔抗鼠IgG其濃度為0.75mg/ml。
本發明所述的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁B23蛋白質定位的免疫螢光方法，其 中DAPI (4， 6—二胺一2苯基吲哚一二鹽酸)的濃度為lpg/ml。
本發明所述的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁B23蛋白質定位的免疫螢光方法，其 中的1。/oTritonX-100為聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)。
本發明所述的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁B23蛋白質定位的免疫螢光方法，其 中的防淬滅劑為10Xlml。本發明所述的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁B23蛋白質定位的免疫螢光方法，其 中的重金屬為As、 Cd、 Co 、 Al、 Cr 、 Cu、 Hg、 Mn、 Ni 、 Pb或Zn。優選As、 Cd、 Co 、 Al、 Cr 、 Cu、 Hg特別優選Cd、 Pb和Al。
本發明的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁B23蛋白質定位的免疫螢光方法，其中所 述的植物細胞包括洋蔥、蠶豆、大蒜和小麥根尖細胞中核仁B23蛋白質的變化。
本發明的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁B23蛋白質定位的免疫螢光方法，能夠對 重金屬脅迫後，細胞內核仁B23蛋白質的變化進行精確定位。
本發明用到的用於固定樣品的多聚甲醛試劑屬危險化學品，請注意適當防護。多聚 甲醛在冷水中不易溶解，配製時要放置在通風櫥中，9(TC攪拌加熱至溶解(呈透明色)， 冷卻至室溫後，倒入棕色瓶中，4'C保存待用。
本發明酶解所需的時間，要根據樣品酶解的具體情況而定。根據本發明人的經驗， 在鏡檢時觀察到大部分細胞均分散開，成一層球形原生質體，其中少量細胞的細胞質已 經解體，只剩下細胞核時結束酶解，獲得的效果最佳。酶解後直接將樣品製成懸浮液狀 態，然後，均勻地滴在載玻片上，不用蓋蓋玻片，自然風乾後備用。這種方法減去了常 規壓片中蓋片和揭片兩個步驟，避免了在這兩個步驟的操作中對細胞的損傷。
更加詳細的實驗步驟如下
以植物根尖為實驗材料，待根生長長度約1.5 cm左右時，進行不同重金屬脅迫實驗。
(1) 切取重金屬處理後的根尖分生組織細胞，於4%多聚甲醛中固定1-2h。
(2) PBS緩衝液(pH7.0)中洗3次(每次10分鐘)。
(3) 2.5%纖維素酶+2.5%果膠酶，37。C溫箱酶解，根據細胞酶解情況確定時間。
(4) PBS緩衝液洗3次(每次10分鐘)。
(5) 將根尖轉至0.5ml的離心管中，滴加PBS緩衝液少量(適樣品多少而定)，蓋 離心管蓋，手搖震蕩至多數細胞游離狀態。用滴管吸取約0.1-0.2ml樣品液，均勻塗於 載片上分散成單個細胞，不蓋蓋玻片，用記號筆在載片的無樣品面標記，自然風千後備 用。
(6) 將要標記的切片放在1% TritonX-100聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)浸泡20 分鐘。(7) PBS緩衝液洗3次(每次10分鐘)。
(8) 用濾紙吸乾多餘的PBS緩衝液，滴一滴(2(Hil)配好的一抗(與B23核仁蛋白結 合)至載玻片的樣品處，蓋上蓋玻片，37^溫箱孵育111-1.511。需要強調的是購買的 抗體要儘快分裝，分裝可以最大程度地降低反覆凍融對抗體活性的損害，同時也降低了 由於多次從同一管中吸取抗體造成的汙染可能性。
(9) PBS緩衝液中洗3次(每次10分鐘)。
(10) 用濾紙吸乾多餘的PBS緩衝液，滴一滴(20pl)配好的二抗(與一抗結構的熒 光素)至載玻片的樣品上，蓋上蓋玻片。37'C溫箱孵育45min-lh。
(11) PBS緩衝液中洗3次(每次10分鐘)。
(12) DAPI (DNA染料)染色用濾紙吸乾多餘的PBS緩衝液，滴一滴(20 pl)DAPI
蓋上載玻片。
(13) PBS緩衝液中洗3次(每次10分鐘)。
(14) 用濾紙吸千多餘PBS，滴一滴(10pl)防淬滅劑於載玻片材料上，蓋上蓋玻片， 用指甲油將蓋玻片四周封好，lh後可在螢光顯微鏡下觀察。
(15) 螢光顯微鏡觀察核仁B23蛋白用藍光450 490 nm (FITC)激發呈綠色熒 光。DNA (細胞核和染色體)用紫外光355 425 nm (DAPI)激發呈藍色螢光。
本發明所用到主要試劑的配置及保存
(1) 一抗鼠抗B23單克隆抗體(mouse monoclonal anti-B23 antibody),購自Sigma (美國)公司。 一抗濃度為0.5mg/ml，每個包裝為0.2ml。購買後按每管10 分裝於
1.5ml離心管中，-20°<:保存。待用時解凍。使用前用PBS緩衝液(pH7.4)稀釋至1.5 ml即可(相當於稀釋了 150倍)，4'C保存。
(2) 二抗FITC—兔抗鼠IgG (Fluorescein-conjugated rabbit anti-Mouse IgG(H+L))， 購自Sigma (美國)公司。原裝進口為凍乾粉，2.0ml;進口分裝為液體，0.1ml (另加 O.lml甘油)。按每管10pL分裝於0.5ml離心管中，-20°。避光保存。待用時解凍，用 PBS buffer (pH7.6)稀釋至0.5 ml即可(相當於稀釋了50倍)，4 。C避光保存待用
(3) DAPI (4， 6—二胺一2苯基B引哚一二鹽酸)DAPI主要染核酸中DNA,儲 存液用無離子水配成lmg/ml濃度，4'C避光保存備用，使用終濃度為lpg/ml， 4'C避光 保存。紫外光激發，細胞核和染色體呈藍色螢光。(4)磷酸鹽緩衝液(PBS緩衝液)
NaCl0.14 mM 0細2g/L
KC1 2.7 mM 0.2013g/L
Na2HP04 8.0 mM 2.8651g/L
NaH2P04 1.5 mM 0.2041g/L 加無離子水至1L，用0.1 MNaH2P04調pH至7.0
(5)固定劑4 %多聚甲醛(paraformaldehyde in PBS buffer ):購自Sigma (美國)公 司。稱多聚甲醛白色粉末lg，量取25ml PBS buffer於燒杯中，蓋蓋兒，放置在通風櫥 中，9(TC攪拌加熱至溶解(呈透明色)，冷卻至室溫後，倒入棕色瓶中，4"C保存待用。 固定劑4%多聚甲醛，主要是殺死細胞，維持細胞在活體時的結構狀態。
(6) 酶液(2.5%Cellulase纖維素酶+2.5。/oPectolase果膠酶)購自Yakult Honsha (日 本)公司。 一般配製5ml酶液，分別稱0.125gCellulase和0.125gPectolase，於5ml無 離子水中，充分溶解後，分裝於4支1.5ml的離心管中，-24'C保存備用。主要作用去除 細胞壁(纖維素和果膠)。
(7) l%TritonX-100聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)購自上海化學試劑公司。一 般配25ml，取0.25ml Triton X-l00加到25mlPBS buffer中，現用現配。這是一種優異 的表面活性劑、潤溼及洗滌劑，破細胞膜，即在細胞膜上打孔，使抗體進入。
(8) 抗螢光淬滅封片液(Antifade mounting medium):購自上海傑美基因公司。
(9) 指甲油市場購置。 本發明的實驗中應注意的幾個問題-
(1) 抗體的活性決定了使用效果，如果抗體保存得當，大部分抗體活性都可以維 持數月甚至數年。因此，買來的抗體要儘快分裝，分裝可以最大程度的降低反覆凍融對 抗體活性的損害，同時也降低了由於多次從同一管中吸取抗體造成的汙染可能性。
(2) 酶解是本實驗關鍵的步驟之一，酶解時間依細胞具體情況而定。根據我們的 經驗，在鏡檢時如果觀察到大部分細胞均分散開，成一層球形原生質體，其中少量細胞 的細胞質己經解體，只剩下核時結束酶解。
(3) 壓片方法也是本實驗成功的關鍵步驟。本發明對傳統的製片方法進行了改革。 酶解後直接將樣品製成懸浮液狀態，然後，均勻地滴在載玻片上，不用蓋蓋玻片，自然風乾後備用。這種方法減去了常規壓片中蓋蓋片和揭片兩個步驟，避免了在這兩個步驟 的操作中對細胞的損傷。
本發明通過免疫螢光定位技術，對重金屬脅迫後的核仁B23蛋白質的變化進行精確 定位。我們利用上述方法已經觀察了在Cd、 Pb和Al脅迫下，洋蔥和蠶豆根尖細胞中核 仁B23蛋白質的變化，取得了很好的結果。本發明的檢測技術具有特異性高、實驗結果 準確等特點。本發明中對常規壓片方法進行了改革，使操作步驟更加簡便易行、大大提 高了觀察細胞數目等優點。該方法為研究重金屬等逆境脅迫下對細胞中蛋白質的影響提 供科學依據。為探討重金屬毒害細胞機理提供了精確的檢測方法，其方法具有廣闊的應 用前景。
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圖1為未經重金屬脅迫的細胞中核仁B23蛋白質的分布。其中Al:綠色螢光顯示 B23蛋白；A2:藍色螢光顯示細胞核(DNA) ; A3:合成圖。
圖2為重金屬脅迫後細胞中核仁B23蛋白質在細胞中的定位。B、 N、 O顯示細胞 核中的B23蛋白在重金屬的脅迫下外溢到細胞質中，並隨著重金屬處理濃度的升高和處 理時間的延長，B23蛋白量逐漸增多。
Bh綠色螢光顯示B23蛋白；B2:藍色螢光顯示細胞核(DNA) ; B3:合成Nl:綠色螢光顯示B23蛋白；N2:藍色螢光顯示細胞核(DNA) ; N3:合成圖； 01:綠色螢光顯示B23蛋白；02:藍色螢光顯示細胞核(DNA) ; 03:合成圖。
具體實施例方式
以下結合實施例用來幫助理解本發明，並且不用於也不應被解釋為以任何方式對 所列出的權利要求中發明的限制。 實施例1
材料培養以蠶豆為例蠶豆主(側)根根長約1.5cm左右時，用10pM、 50pM、 100pM的Cd2+處理24h、 48 h、 72 h。
(1) 切取重金屬處理後的蠶豆植物根尖分生組織細胞，於4%多聚甲醛中固定211; 經PBS緩衝液洗；
(2) 採用2.5%纖維素酶+2.5%果膠酶酶液於37"C溫箱酶解；經PBS緩衝液洗滌 後壓片；
10(3) 將蠶豆植物根尖轉至離心管中，滴加PBS緩衝液，手搖震蕩至多數細胞游離
狀態，用滴管吸取約0.1ml樣品液，均勻塗於載玻片上分散成單個細胞，標記後自然風
幹後備用；
(4) 將(3)得到的載玻片放在l%TritonX-100浸泡15分鐘；經PBS緩衝液洗滌；
(5) 在(4)得到的載片上滴入15^配好的一抗，蓋上蓋玻片，37。C溫箱孵育lh;再 經PBS緩衝液洗滌；
(6) 再將(5)得到的載片上滴入15W配好的二抗，蓋上蓋玻片，37。C溫箱孵育45 min-lh;經PBS緩衝液洗滌；
(7) 再將(6)的載玻片上滴加15plDAPI，蓋上蓋玻片；經PBS緩衝液洗滌；
(8) 用濾紙吸乾多餘PBS，滴加5pl防淬滅劑於載玻片材料上，蓋上蓋玻片，用指 甲油將蓋玻片四周封好，lh後在螢光顯微鏡下觀察。
(9) 螢光顯微鏡觀察及圖像分析處理製片用NIKON公司(日本)HB-10101AF 型螢光顯微鏡觀察，激發光分別為紫外光355 425 rnn (DAPI)和藍光450 490 nm
(FITC) 。 PixeraPro600CLCCD數碼照相。圖像採集為1392x1040象素。圖像的後期 處理利用Photoshop 7.0軟體排版。 實施例2
材料培養以大蒜為例，大蒜不定根根長約1.5cm左右時，用10pM、 50pM、 100 的Pb2+處理24h、 48 h、 72 h。 Pb
實驗步驟
(1) 切取重金屬處理後的根尖約2mm，於4M多聚甲醛中固定2h。
(2) PBS緩衝液(pH7.0)中洗3次(每次10分鐘)。
(3) 2.5%纖維素酶+2.5%果膠酶，37X:溫箱酶解，在酶解過程中隨時鏡檢，直到 有大量的球形原生質體產生結束酶解。
(4) PBS緩衝液洗3次(每次10分鐘)。
(5) 將根尖轉至0.5ml的離心管中，滴加PBS緩衝液少量(適樣品多少而定)， 蓋離心管蓋，手搖震蕩至多數細胞游離狀態。用滴管吸取約0.2ml樣品液，均勻塗於載 片上分散成單個細胞，不蓋蓋玻片，用記號筆在載片的無樣品面標記，自然風乾後備用。
(6) 將要標記的切片放在1°/。 Triton X-100中抽提20min。(7) PBS緩衝液洗3次(每次10分鐘)。
(8) 用濾紙吸乾多餘的PBS緩衝液，用經PBS稀釋的一抗(鼠抗B23單克隆抗體， 工作濃度l: 150) 37'C孵育lh或4'C孵育過夜。
(9) PBS緩衝液中洗3次(每次10分鐘)。
(10) 用濾紙吸乾多餘的PBS緩衝液，滴一滴(20 pl)配好的二抗(兔抗鼠IgG，工 作濃度l: 50)至載玻片上的樣品處，蓋上蓋玻片，37。C溫箱孵育45min-lh。
(11) PBS緩衝液中洗3次(每次10分鐘)。
(12) DAPI染色用濾紙吸乾多餘PBS緩衝液，滴一滴(20 pl)DAPI，蓋上蓋玻片。
(13) PBS緩衝液中洗3次(每次10分鐘)。
(14) 用濾紙吸乾多餘PBS，滴一滴(10nl)防淬滅劑於載玻片材料上，蓋上蓋玻片， 用指甲油將蓋玻片四周封好，lh後可在螢光顯微鏡下觀察。
(15) 螢光顯微鏡觀察及圖像分析處理製片用NIKON公司(日本)HB-10101AF 型螢光顯微鏡觀察，激發光分別為紫外光355 425 nm (DAPI)和藍光450 490 nm
(FITC) 。 PixeraPro600CLCCD數碼照相。圖像採集為1392x1040象素。圖像的後期 處理利用Photoshop 7.0軟體排版。 實施例3
洋蔥根尖細胞中核仁B23蛋白質的變化
材料培養以洋蔥為例洋蔥不定根根長約1.5cm左右時，用10pM、 50pM、 100 的Al3+處理24h、 48 h、 72 h。 實驗步驟
(1) 切取重金屬處理後的根尖約2mm，於4n/。多聚甲醛中固定2h。
(2) PBS緩衝液(pH7.0)中洗3次(每次15分鐘)。
(3) 2.5%纖維素酶+2.5%果膠酶，37'C溫箱酶解，在酶解過程中隨時鏡檢，直到 有大量的球形原生質體產生結束酶解。
(4) PBS緩衝液洗3次(每次15分鐘)。
(5) 將根尖轉至0.5ml的離心管中，滴加PBS緩衝液少量(適樣品多少而定)， 蓋離心管蓋，手搖震蕩至多數細胞游離狀態。用滴管吸取約0.1ml樣品液，均勻塗於載 片上分散成單個細胞，不蓋蓋玻片，用記號筆在載片的無樣品面標記，自然風乾後備用。
12(6) 將要標記的切片放在1% TritonX-100中抽提20min。
(7) PBS緩衝液洗3次(每次15分鐘)。
(8) 用濾紙吸乾多餘的PBS緩衝液，用經PBS稀釋的一抗(鼠抗B23單克隆抗體, 工作濃度1: 150) 37r孵育lh或4 'C孵育過夜。
(9) PBS緩衝液中洗3次(每次10分鐘)。
(10) 用濾紙吸乾多餘的PBS緩衝液，滴一滴(20 W)配好的二抗(兔抗鼠IgG，工 作濃度l: 50)至載玻片上的樣品處，蓋上蓋玻片，37'C溫箱孵育45 min。
(11) PBS緩衝液中洗3次(每次10分鐘)。
(12) DAPI染色用濾紙吸乾多餘的PBS緩衝液，滴一滴(20 pl)DAPI蓋上蓋玻片。
(13) PBS緩衝液中洗3次(每次10分鐘)。
(14) 用濾紙吸乾多餘PBS,滴一滴(10pl)防淬滅劑於載玻片材料上，蓋上蓋玻片， 用指甲油將蓋玻片四周封好，lh後可在螢光顯微鏡下觀察。
(15) 螢光顯微鏡觀察及圖像分析處理製片用NIKON公司(日本)HB-10101AF 型螢光顯微鏡觀察，激發光分別為紫外光355 425 nm (DAPI)和藍光450 490 nm
(FITC) 。 PixeraPro600CLCCD數碼照相。圖像採集為1392x1040象素。圖像的後期 處理利用Photoshop 7.0軟體排版。
1權利要求
1、一種檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁B23蛋白質定位的免疫螢光方法，其特徵在於，按如下的步驟進行(1)切取重金屬處理後的植物根尖分生組織細胞，於4％多聚甲醛中固定1-2h；經PBS緩衝液洗；(2)採用2.5％纖維素酶+2.5％果膠酶酶液於37℃溫箱酶解；經PBS緩衝液洗滌後壓片；(3)將植物根尖轉至離心管中，滴加PBS緩衝液，手搖震蕩至多數細胞游離狀態，用滴管吸取約0.1-0.2ml樣品液，均勻塗於載玻片上分散成單個細胞，標記後自然風乾後備用；(4)將(3)得到的載玻片放在1％TritonX-100浸泡15-20分鐘；經PBS緩衝液洗滌；(5)在(4)得到的載片上滴入15-20μl配好的一抗，蓋上蓋玻片，37℃溫箱孵育1h-1.5h；再經PBS緩衝液洗滌；(6)再將(5)得到的載片上滴入15-20μl配好的二抗，蓋上蓋玻片，37℃溫箱孵育45min-1h；經PBS緩衝液洗滌；(7)再將(6)的載玻片上滴加15-20μl DAPI，蓋上蓋玻片；經PBS緩衝液洗滌；(8)用濾紙吸乾多餘PBS，滴加5-10μl防淬滅劑於載玻片材料上，蓋上蓋玻片，用指甲油將蓋玻片四周封好，1-2h後在螢光顯微鏡下觀察。
2、 權利要求1所述的檢測方法，其中步驟(2)中酶解所用時間是指在鏡檢時如 果觀察到大部分細胞均分散開，成一層球形原生質體，其中少量細胞的細胞質己經解體， 只剩下細胞核時，即結束酶解。
3、 權利要求1所述的檢測方法，其中步驟(2)中所述的壓片是指酶解後直接將 樣品製成懸浮液狀態，然後，均勾地滴在載玻片上，不蓋蓋玻片，自然風乾後備用。
4、 權利要求1所述的檢測方法，其中所述的PBS緩衝液洗是指採用PBS緩衝液 洗3次，每次10-15分鐘。 '
5、 權利要求1所述的檢測方法，其中的一抗為鼠抗B23單克隆抗體，其濃度為 0.5mg/ml。
6、 權利要求1所述的檢測方法，其中的二抗為FITC —兔抗鼠IgG其濃度為，0.75mg/ml。
7、 權利要求1所述的檢測方法，其中DAPI的濃度為lpg/ml。
8、 權利要求1所述的檢測方法，其中的防淬滅劑為10Xlml。
9、 權利要求1所述的檢測方法，其中的重金屬為As、 Cd、 Co 、 Al、 Cr、 Cu、 Hg、 Mn、 Ni 、 Pb或Zn。
10、 權利要求1所述的檢測方法，其中所述的植物細胞包括洋蔥、大蒜、蠶豆或小麥。
全文摘要
本發明公開了一種檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁B23蛋白質定位的免疫螢光方法。它是切取重金屬處理後的植物根尖分生組織細胞，於4％多聚甲醛中固定1h；採用酶液酶解後；用滴管吸取約0.1ml樣品液，均勻塗於載玻片上分散成單個細胞，標記後自然風乾，放在1％TritonX-100浸泡15分鐘；然後滴入15μl配好的一抗，蓋上蓋玻片，37℃溫箱孵育1h；再滴入15μl配好的二抗，處理後滴加15μl DAPI，最後滴加5μl防淬滅劑於載玻片材料上，蓋上蓋玻片，用指甲油將蓋玻片四周封好，1h後在螢光顯微鏡下觀察。本發明的檢測方法具有特異性高、實驗結果準確，大大提高了觀察細胞數目等特點。該方法為探討重金屬毒害細胞機理提供了精確的檢測方法，其方法具有廣闊的應用前景。
文檔編號G01N21/64GK101650310SQ200910070470
公開日2010年2月17日 申請日期2009年9月17日 優先權日2009年9月17日
發明者劉東華, 張慧敏, 張閃閃, 蓉 秦 申請人:天津師範大學