一種微膠囊及其製備方法
2023-07-01 04:18:51 2
專利名稱：一種微膠囊及其製備方法
技術領域：
本發明涉及生物兼容性微膠囊及其製備方法，尤其涉及兩性蛋白質和酯(或脂) 形成的微膠囊，屬於生物技術領域。
背景技術：
微膠囊是從上個世紀80年代後期起為人所關注的一種藥用輔料，是用成膜材料 把固體或液體藥物包裹起來，形成微小的粒子。它可以改變藥物劑型，從而完善藥物傳遞途徑。在中國專利申請公開說明書CN1072449A中，確認了蔗糖脂肪酸酯能夠為水、脂兩 相牽合搭橋，從而完善了油脂固化的研究，可代替氫化加氫手段實現植脂粉生產，為消除由 於氫化加氫手段所產生的反向脂肪酸對人類的危害，提供了良好的解決途徑。選擇理想 的酯類，在食品和藥物加工過程中具有重要性，今後藥界對新型輔料需求會越來越高。以
環糊精、麥芽糊精和改性澱粉為代表的多醣類，由於其化學結構的特點，在進行藥物包 裹時，溫度的變化會影響包裹的效果。以脂質體為代表的微膠囊由於其雙分子層的特點， 被包裹藥物的包囊率，一周後明顯下降，顯示單純的脂類微膠囊的不穩定性。上個世紀90 年代初的專利報告中顯示出兩性蛋白質微膠囊對藥物包裹的威力。在中國專利申請公開 說明書 CN1091679A、CNl 114421Α、CN1162642A 和 CN1482248A 中表明了小麥醇溶蛋白的 35KD-55KD條帶的兩性蛋白質的分子中疏水胺基酸殘基佔有全分子的40%以上，具有明顯 的脂類特性和包裹特性。兩性蛋白質具有類脂的特性，它溶於某種有機溶劑，如乙醇、二氧六環等。本發明 中所述兩性蛋白質的「兩性」概念採用的是Amphiphilic的概念，與大量生物化學教科書中 所用的兩性Isoelectric Zwitterion是有區別的。兩性Amphiphilic概念的由來可追溯到 一篇作者為 Neumann, R 的文章"Preparatian and characterazation of long chain amino acid and peptide vesicle membranes，， (1987, Elsevier Science Publishers B.V.出 版，第338-349頁)。該文章中報導，長鏈C18脂肪酸通過羰二亞胺與某胺基酸偶聯後，改變 了原來某胺基酸的性質，使其增加了原胺基酸不存在的疏水性，作者將之稱為具有疏水和 親水雙重性質的新型胺基酸(胺基酸脂肪酸酯)——Amphiphilic Amino Acid(兩性氨基 酸)。本發明所選用的天然蛋白質在其35KD-55KD的組成成分中，由於含有40%以上的疏 水胺基酸，從而使其產生了能溶於有機溶劑的類似脂類的特性。故該蛋白質區別於一般蛋 白質。實驗中充分顯示了該蛋白質具有與胺基酸脂肪酸酯相類似的Amphiphilic (兩性) 性質，故本發明採用兩性蛋白質的概念，作為其成膜成為囊泡的認識基礎和依據。本發明是在中國發明專利ZL 03100825. 9基礎上的後續研究。在ZL 03100825.9 中，將中國春小麥麥粉通過LH-20柱層析純化、疏水相互作用層析純化和SDS-PAGE等常規 純化手段和分子量鑑定，發現11條蛋白質電泳帶，它們的分子量範圍分布於66KD 略小 於14KD範圍，其中有的條帶有能夠形成囊泡的特徵。選擇其中可呈囊泡的六個組分A、B、 C、D、E、F重新製成組合蛋白，該組合蛋白各組分的分子量及組成該組合蛋白的比例關係為A :66KD, 1. 0 2. 0 ;B 略小於 66KD，0. 1 1. 0 ;C :14. 4KD 略大於 14. 4KD, 1. 0 2. 0 ； D 20. IKD 略小於 20. 1KD, 1. 0 2. 0 ;E 略小於 14. 4KD, 2. 0 3. 0 ;F :35KD 55KD,
3. 5-5. 0。其中組分F中疏水性胺基酸殘基佔該組分蛋白質分子組成的40%以上。
發明內容
本發明的目的在於提供一種兩性蛋白質和酯(或脂)類形成的間層膜結構的微膠 囊，可用於水溶性和脂溶性各類物質的包裹，廣泛應用於生物、醫藥、食品各領域。本發明的微膠囊具有間層膜結構，其囊壁為間層，分別是兩性蛋白質形成的內層 囊壁(內膜)和酯或脂類形成的外層囊壁(外膜)。上述微膠囊，其中所述兩性蛋白質優選為春麥麥粉蛋白，該春麥麥粉蛋白中疏水 性胺基酸殘基佔所屬蛋白質分子組成的40%以上。上述微膠囊，其中所述酯類包括蔗糖脂肪酸酯、甘油酯等；所述脂類包括磷脂類化 合物，例如大豆磷脂、卵磷脂、磷脂醯膽鹼。本發明的微膠囊可以通過如下方法製備1)製備兩性蛋白質微膠囊；2)將兩性蛋白質微膠囊和酯(或脂)類以兩性蛋白質酯(或脂)類重量比為 0. 1 10的比例放入旋轉瓶中，並在濃度為15% 40%的乙醇存在下進行旋轉，獲得所述
微膠囊。上述步驟1)兩性蛋白質微膠囊的製備可參見中國發明專利ZL94100552.6和 ZL03100825. 9說明書中的描述，具體通過如下步驟獲得兩性蛋白質微膠囊1-1)將春麥麥粉溶於50% 90%乙醇溶液中，抽提4 10小時，通過kphadex LH-20柱層析純化，取其中蛋白質分子量為35KD 55KD的部分；1-2)將步驟1-1)獲得純化部分放入旋轉瓶中旋轉，在瓶中形成一薄層膜，該薄層 膜稱為固態兩性蛋白質載體；1-3)將待包裹的物質以液體狀態加入旋轉瓶中，經過旋轉，兩性蛋白質載體由固 相轉化成懸浮態的球形微膠囊，微膠囊中包裹了待包裹的物質。當然，兩性蛋白質微膠囊的製備並不局限於採用春麥麥粉蛋白，製備過程也不應 局限於上述步驟1-1) 1-3)，可利用其他現有技術來製備本發明所需的兩性蛋白質微膠
^ ο可包裹物質的分子量範圍很廣，一般的藥物分子量在0. 4KD IX IO6KD,都可以用 本發明的微膠囊進行包裹，但並不局限於該分子量範圍，小於0. 4KD的分子(如水分子)和 大於IXlOfiKD的分子(如一些抗體)也能被包裹。可包裹的物質種類多樣，可以是脂類，如 食用油、大蒜油、藿香油、肉桂油、磷脂類物質；也可以是酯類，如蔗糖脂肪酸酯、甘油酯等； 還可以是水溶性藥物，如染料、標記抗體、酶體系等。亦可製成細胞內尋靶和細胞外尋靶的 抗體探針和酶探針。在上述步驟2)間層膜結構的獲得需要介導物乙醇的參與，乙醇的濃度為佔全部 溶液體積的15% 40%。本發明的蛋白質和酯(或脂)類間層膜結構微膠囊同時具備了蛋白質微膠囊和脂 類微膠囊的優點，可廣泛應用於生物、醫藥、食品各領域，製備各種藥物或保健品。蛋白質微
4膠囊來源廣泛、製備方便，相對於脂類微膠囊，剛性好，通透性和穩定性更佳，不僅可以包裹 水溶性藥物，還可以包裹脂溶性藥物。基於兩性蛋白質的親水性和疏水性雙重特性，蛋白質 微膠囊在適宜的條件下與酯(或脂)類相結合，在囊壁表面再形成一層同心圓的酯或脂的 外膜。酯或脂質外膜能保護內層的蛋白質膜不被胃蛋白酶水解，從而使得該間層膜結構微 膠囊適用於口服。此外，蛋白質微膠囊不僅具有良好的穩定性和通透性，而且經低溫冷凍幹 燥後可壓成鱗片狀，吸水後又可以復原，仍保持蛋白質微膠囊的脫水-吸水-泡的穩定性( Dehydration-Rehydration-Vesicles,即DRV特性)。冷凍乾燥處理後的蛋白質微膠囊可 保存一年以上，基於此特性，可以先將藥物包裹於蛋白質微膠囊中冷凍保存，臨用前再與酯 (或脂)類混合製備間層膜結構微膠囊服用，大大延長了藥物的保存期限。
圖1是對本發明的蛋白質和酯間層膜結構微膠囊用氨基黑和蘇丹III染色後，在 光學顯微鏡下拍到的照片。
具體實施例方式下面結合附圖，通過實施例對本發明做進一步說明。一、載藥兩性蛋白質微膠囊的製備1、原料中國春麥粉，購自中國農業科學院品資所，和由農林科學院作物研究所、 北京市種子公司贈。LH-20柱疏水相互作用層析等技術純化，發現所得春麥有 11條蛋白質電泳條帶，其分子量範圍分布於66KD到略小於14KD，其中有的條帶有能夠形成 囊泡的特徵。選擇其中可呈囊泡的六個組分，重新製成組合蛋白。該組合蛋白的六個組分 A、B、C、D、E、F分子量及組成該組合蛋白的比例關係為=A :66KD，1.0 2. O ;B 略小於66KD， 0. 1 1. O ;C :14. 4KD 略大於 14. 4KD, 1. O 2. O ;D :20. IKD 略小於 20. 1KD, 1. O 2. O ； E 略小於14. 4KD，2. O 3. O ;F :35KD 55KD，3. 5-5. O。其中組分F中疏水性胺基酸殘基 所佔該組分蛋白質分子組成的40%以上。純化所得兩性蛋白質的濃度為％ig/ml 15mg/ ml。該六個組分經過冷凍乾燥處理後，可保存一年以上。2、兩性蛋白質醇溶液的製備獲取中國純系品種春麥粉10 15g，溶於50 500ml的50% 90%乙醇溶液中，抽提4 10小時，繼續通過kphadex LH-20柱層析純 化，取分子量為35KD 55KD部分進行下述試驗。3、吸取上述兩性蛋白質醇溶液0. 1 1. 0ml，放入旋轉瓶中，用水泵抽掉保護液， 於是旋轉瓶中形成一個極薄層膜，稱為固態兩性蛋白質載體。4、將0. 1 1. Oml藥液加入到旋轉瓶中，經過旋轉，使兩性蛋白質載體由固相轉化 成懸浮態的球形微膠囊，此時，藥液便被微膠囊包裹成顆粒態狀存在。二、藥物包裹比測試方法可包裹的藥物的分子量為0. 4KD 1 X 106KD。可包裹的藥物種類有脂類，如食用 油、磷脂類；酯類，如蔗糖脂肪酸酯、甘油酯等；水溶性藥物，如染料、標記抗體、酶體系等。測試方法有A.顯微鏡測試法用顯微鏡計算微膠囊數目(個)/mg兩性蛋白質微膠囊。B.膜片過濾法用膜片過濾，如Whatman N03層析厚濾紙、GF/C、GF/B。
C.比色計算法用包裹前藥物總OD減去包裹後剩餘OD的計算方法D.凝膠過濾法如kpharoge 4B、Sephadex G25等常用介質。藥物包裹計算和回收率計算a 包裹前待使用的藥物總量，t 藥物包裹率c/ab 包裹後剩餘藥物總量，r 回收率b+c/ac 包裹的藥物總量a_b三、間層膜結構微膠囊的製備1、原料包括上述兩性蛋白質、酯類(如蔗糖脂肪酸酯、甘油酯)或脂類(包括磷 脂類，如大豆磷脂、卵磷脂、磷脂醯膽鹼)。2、製備間層膜結構微膠囊程序為1)首先製備兩性蛋白質微膠囊或包藥兩性蛋白質微膠囊2)將步驟1)製備的微膠囊與酯類或脂類混合併常溫下通過旋轉瓶旋轉，製備蛋 白質和酯(或脂)間層膜結構微膠囊。其中，兩性蛋白質酯(或脂)重量比(mg/mg)為1. 0 0. 1 0. 1 1. 0 ；製備間層膜結構微膠囊要求有介導物乙醇的加入，乙醇濃度為15% 40% ；操作溫度為室溫並且通風。製備得到的蛋白質和酯(或脂)間層膜結構微膠囊如圖1所示，該圖是在光學顯 微鏡(放大10X40倍)下的兩張照片，可以看到微膠囊呈雙層膜結構外膜成分為酯，被蘇 丹III染成紅色；內膜成分為兩性蛋白質，用氨基黑染成藍色。
權利要求
1.一種微膠囊，其囊壁為間層，分別是兩性蛋白質形成的內層囊壁和酯或脂類形成的外層囊壁。
2.如權利要求1所述的微膠囊，其特徵在於，所述兩性蛋白質為春麥麥粉蛋白，該春麥 麥粉蛋白中疏水性胺基酸殘基佔所屬蛋白質分子組成的40%以上。
3.如權利要求1所述的微膠囊，其特徵在於，所述酯類為蔗糖脂肪酸酯或甘油酯。
4.如權利要求1所述的微膠囊，其特徵在於，所述脂類為磷脂類化合物。
5.如權利要求4所述的微膠囊，其特徵在於，所述磷脂類化合物為大豆磷脂、卵磷脂或 磷脂醯膽鹼。
6.一種製備權利要求1所述微膠囊的方法，包括下述步驟1)製備兩性蛋白質微膠囊；2)將兩性蛋白質微膠囊與酯或脂類以兩性蛋白質酯或脂類重量比為0.1 10的比 例放入旋轉瓶中，並在濃度為15% 40%的乙醇存在下進行旋轉，獲得所述微膠囊。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述步驟1)又包括下列步驟1-1)將春麥麥粉溶於50% 90%乙醇溶液中，抽提4 10小時，通過S印hadex LH-20 柱層析純化，取其中蛋白質分子量為35KD 55KD的部分；1-2)將步驟1-1)獲得純化部分放入旋轉瓶中旋轉，在瓶中形成一薄層膜，該薄層膜稱 為固態兩性蛋白質載體；1-3)將待包裹的物質以液體狀態加入旋轉瓶中，經過旋轉，兩性蛋白質載體由固相轉 化成懸浮態的球形微膠囊，微膠囊中包裹了待包裹的物質。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述待包裹的物質分子量在0.4KD 1 X IO6KD,為水溶性物質或脂溶性物質。
9.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，步驟2)中所述酯類為蔗糖脂肪酸酯或甘油 酯；所述脂類為磷脂類化合物。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述磷脂類化合物為大豆磷脂、卵磷脂或 磷脂醯膽鹼。
全文摘要
本發明公開了一種微膠囊及其製備方法，所述微膠囊具有間層膜結構，其囊壁為間層，分別是兩性蛋白質形成的內層囊壁(內膜)和酯或脂類形成的外層囊壁(外膜)。其中所述兩性蛋白質優選為春麥麥粉蛋白，該春麥麥粉蛋白中疏水性胺基酸殘基佔所屬蛋白質分子組成的40％以上。將兩性蛋白質微膠囊與酯或脂類在介導物乙醇的存在下於旋轉瓶中進行製備，即可獲得間層膜結構的微膠囊。本發明的微膠囊兼具蛋白質微膠囊和脂質微膠囊的優點，可用於水溶性和脂溶性各類物質的包裹，廣泛應用於生物、醫藥、食品各領域。
文檔編號B01J13/02GK102091584SQ20101059480
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月17日 優先權日2010年12月17日
發明者王素雲 申請人:北京大學