生物樣本的預處理方法、rna的檢測方法及預處理試劑盒的製作方法
2023-06-30 20:33:26
專利名稱：生物樣本的預處理方法、rna的檢測方法及預處理試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及包含RNA的生物樣本的預處理方法、RNA的檢測方法及預處理試劑盒。
背景技術：
作為檢測血液等生物樣本中的病毒的方法，有將病毒的基因進行擴增從而檢測的方法。但是，生物樣本中大多含有基因擴增的抑制物質，因此在基因擴增之前，實施對生物樣本進行預處理而將抑制物質除去或鈍化的操作。預處理方法例如有:通過表面活性劑、促溶劑、加熱等對生物樣本進行處理後，進一步通過固相載體或離子交換樹脂進行純化的方法(專利文獻I 3)。然而，這些方法需要特殊的裝置，並且需要多個操作步驟，因此繁雜。特別是在以RNA為基因的病毒的檢測中，為了通過反轉錄酶使RNA基因成為DNA後進行擴增操作，需要將RNA分解酶(RNase)及反轉錄酶鈍化物質也除去或鈍化，因此在現有的預處理方法中，進一步需要繁雜的操作。例如作為包含RNA病毒的生物樣本的預處理方法，已知添加多胺或硫酸化多糖(專利文獻4)。然而，添加多胺或硫酸化多糖會使預處理更加繁雜化，並且多胺及硫酸化多糖可能和RNA基因及通過反轉錄酶而生成的DNA結合，反而也可能抑制基因擴增。另外，流感病毒為RNA病毒的一種，但是流感病毒是新型還是季節型的判斷在臨床上極為重要。另外，通常使用鼻黏膜作為用以檢測流感病毒的生物樣本。並且，流感病毒的檢測需要在臨床現場進行。因此，期望建立使用人類的鼻黏膜的流感病毒的迅速且簡便的檢測方法，這類需求並不限於流感病毒，也要求針對通常的RNA病毒的檢測，而且不僅要求針對RNA病毒的檢測，也要求針對基因以外的RNA本身的檢測。現有技術文獻專利文獻專利文獻1:特開2009-247250號公報專利文獻2:國際公開W02007/094506號公開文本專利文獻3:特開2006-87394號公報專利文獻4:特開2001-29078號公報
發明內容
發明要解決的問題本發明的目的是提供能夠由包含RNA的生物樣本迅速且簡便地檢測RNA的生物樣本的預處理方法、使用該生物樣本的預處理方法的RNA的檢測方法、及所述生物樣本的預處理方法中所用的預處理試劑盒。解決問題的手段本發明的預處理方法是包含RNA的生物樣本的預處理方法，其特徵在於:所述生物樣本包含乳鐵蛋白(Lactferrin),並對所述生物樣本實施乳鐵蛋白的RNA分解活性抑制處理。
本發明的檢測方法是生物樣本中的RNA的檢測方法，其特徵在於所述生物樣本包含乳鐵蛋白(Lactferrin)，並且包括:對所述生物樣本進行預處理的預處理步驟，及通過擴增而檢測經所述預處理的生物樣本中的所述RNA的RNA擴增檢測步驟，所述預處理步驟通過所述本發明的生物樣本的預處理方法而實施。本發明的預處理試劑盒是包含RNA的生物樣本的預處理試劑盒，其特徵在於:所述生物樣本包含乳鐵蛋白(Lactferrin),所述預處理試劑盒包含乳鐵蛋白的RNA分解活性抑制劑。發明效果本發明者等人首先發現:抑制人類鼻黏膜樣本中所含的以RNA為模板的反轉錄/DNA擴增反應的要素是乳鐵蛋白的RNA分解活性。並且發現，通過僅對人類鼻黏膜樣本實施乳鐵蛋白的RNA分解活性抑制處理(例如乳鐵蛋白的RNA分解活性抑制劑添加處理)，可以抑制RNA分解。進一步發現，作為人類鼻黏膜樣本中所存在的其他反轉錄/DNA擴增反應抑制要素之一，溶菌酶C抑制通過反轉錄酶從RNA向DNA的反轉錄反應。並且發現，通過添加溶菌酶C的反轉錄酶抑制活性抑制劑，可以抑制反轉錄酶的抑制活性。並且通過這些反轉錄/DNA擴增反應抑制要素的抑制處理(添加包含抑制劑的試劑)而對人類鼻黏膜樣本進行處理，其結果是，不經過特別的純化步驟，便可以直接進行RNA基因的擴增，從而完成了本發明。根據本發明，可以迅速且簡便地從包含RNA的生物樣本檢測RNA。
圖1是表示本發明的檢測方法的一個實例的圖。圖2是表示乳鐵蛋白及溶菌酶C存在於人類鼻黏膜中的電泳照片。 圖3是表示鐵離子及碳酸根離子對乳鐵蛋白的RNA分解活性的抑制效果的電泳照片。圖4是表示鐵離子及碳酸根離子的熱處理效果的一個實例的電泳照片。圖5是表示通過鐵離子及碳酸根離子對溶菌酶C的反轉錄抑制活性進行抑制的一個實例的圖。圖6是表示鐵離子及碳酸根離子和SDS的協同效應的一個實例的電泳照片。圖7a是表示利用折回引物(turn-back primer)及摺疊引物(foldingprimer)的核酸擴增反應的機理的一個實例的圖。圖7b是表示利用折回引物及摺疊引物的核酸擴增反應的機理的一個實例的圖。圖8是表示因添加氧化鋁而對SDS除去的影響的一個實例的圖。圖9是表示因鐵離子濃度的增加及超濾而對SDS除去的影響的一個實例的圖。圖10是表示Triton X-100對核酸擴增反應中的SDS的核酸擴增抑制的緩和效果的一個實例的圖。圖11是表示可以通過RT-SmartAmp法檢測人類鼻黏膜所含的RNA病毒的圖。
具體實施例方式
本發明的預處理方法中， 優選通過在所述生物樣本中添加乳鐵蛋白的RNA分解活性抑制劑，來對所述生物樣本實施乳鐵蛋白的RNA分解活性抑制處理。
本發明的預處理方法中，優選所述生物樣本包括:動物的鼻黏膜、鼻竇黏膜、氣管黏膜、唾液、來自口腔或咽喉的分泌液、淚、乳汁、膽汁、血液(白細胞)、子宮頸管的黏膜、內外生殖器的黏膜、羊水、或尿。本發明的預處理方法中，優選所述動物為人類。本發明的預處理方法中，優選所述生物樣本包括人類鼻黏膜。本發明的預處理方法中，優選對所述生物樣本進一步實施溶菌酶C (LysozymeC)的反轉錄抑制活性抑制處理。在這種情況下，優選通過在所述生物樣本中添加溶菌酶C (Lysozyme C)的反轉錄抑制活性抑制劑,而對所述生物樣本實施溶菌酶C (Lysozyme C)的反轉錄抑制活性抑制處理。本發明的預處理方法中，優選所述RNA分解活性抑制劑及所述反轉錄抑制活性抑制劑的至少一種包含鐵離子劑及碳酸根離子劑。另外，本發明中，「鐵離子劑」是指可以對所述生物樣本供給鐵離子的物質。同樣，本發明中，「碳酸根離子劑」是指可以對所述生物樣本供給碳酸根離子的物質。
本發明的預處理方法中，優選對添加了所述鐵離子劑及所述碳酸根離子劑的所述生物樣本進行加熱處理。這是因為通過該加熱處理，可以有效地抑制RNA分解活性及反轉錄抑制活性。本發明的預處理方法中，可以在所述生物樣本中進一步添加表面活性劑，例如優選添加極性表面活性劑。為了使基因從病毒粒子中露出，必須使用非離子性表面活性劑除去病毒的被膜，但非離子性表面活性劑有可能抑制本發明的所述鐵離子劑及所述碳酸根離子劑的功能。但是如果是極性表面活性劑，則不會抑制本發明的所述鐵離子劑及所述碳酸根離子劑的功能，而可以除去病毒的被膜。所述極性表面活性劑優選為SDS。另外，SDS可能會抑制基因擴增時的DNA聚合酶，因此優選在基因擴增之前，將鉀鹽或氧化鋁添加至生物樣本使SDS凝聚，並通過離心分離或過濾將SDS除去。本發明的檢測方法中，優選通過使用反轉錄酶的基因擴增方法來實施所述RNA的擴增。所述基因擴增方法優選為使用鏈置換DNA聚合酶的等溫擴增方法。本發明的檢測方法中，使用表面活性劑從病毒粒子使RNA基因流出例如可以使用以下2個步驟中的任一個步驟。步驟B是在基因擴增步驟中添加非極性表面活性劑，通過非極性表面活性劑和基因擴增反應時的加熱的效果，使RNA基因從病毒粒子中溶出的方法。
步驟A:通過表面活性劑破壞預處理過程中的樣品中所含的病毒粒子，使RNA從病毒中溶出，同時通過抑制處理來抑制乳鐵蛋白及溶菌酶C的RNA分解活性及所述反轉錄抑制活性，而將該預處理液供給至核酸擴增的步驟。步驟B:不破壞樣品中的病毒粒子(保持原樣)，通過抑制處理來抑制乳鐵蛋白及溶菌酶C的RNA分解活性及所述反轉錄抑制活性後，供給至包含非極性表面活性劑的核酸擴增反應，通過表面活性劑和熱變性的效果，而使病毒粒子中的RNA基因組溶出，而實施來自病毒基因組的核酸擴增的步驟。所述步驟A中，所述表面活性劑優選使用極性表面活性劑。所述極性表面活性劑優選為SDS。所述步驟B中，所述表面活性劑優選使用不會抑制核酸擴增反應的非極性表面活性劑。本發明的預處理試劑盒優選進一步包含溶菌酶C (Lysozyme C)的反轉錄抑制活性抑制劑。本發明的預處理試劑盒中，優選所述RNA分解活性抑制劑及所述反轉錄抑制活性抑制劑的至少一種包含鐵離子劑及碳酸根離子劑。優選以相互不接觸的狀態包含所述鐵離子劑及所述碳酸根離子劑。接著，對本發明進行詳細地說明。本發明中，生物樣本所含的RNA並無特別限制，包括從生物中取得的全部的RNA、宿主RNA、細菌或真菌的RNA。可以是基因RNA，也可以是基因以外的RNA。在基因RNA的情況下，生物樣本所含的基因RNA優選為RNA病毒，特別優選流感病毒。本發明中，所述生物樣本是包含乳鐵蛋白的樣本。所述生物樣本中，優選包含人類乳鐵蛋白的樣本。已知乳鐵蛋白包含在生物的幾乎所有的外分泌液中。因此，所述生物樣本例如可以列舉:包括動物的來自鼻腔、鼻竇、喉頭、氣管、支氣管、或肺等的上呼吸道黏膜的分泌液、來自口腔或咽喉的分泌液(例如唾液等)、來自消化道黏膜的分泌液、來自內生殖器、外生殖器(例如子宮頸管等)的黏膜的分泌液、來自腎尿路系統的黏膜的分泌液、來自腹腔內黏膜的分泌液、來自胸腔內黏膜的分泌液、來自心包內黏膜的分泌液、來自皮膚的分泌液、淚腺分泌液、乳汁、膽汁、血液(白細胞)、羊水、尿、糞便等的生物樣本。這些中，例如優選來自鼻腔、鼻竇等的黏膜的分泌液、唾液、淚、乳汁、膽汁、血液(白細胞)、來自子宮頸管的分泌液、羊水、尿等樣本，已知這些樣本實際上包含乳鐵蛋白。其中特別優選人類鼻黏膜。另外，所述動物優選人類，但也可以是人類以外的動物。人類以外的動物的實例可以列舉:牛、豬、羊、馬、駱騎、大鼠等。乳鐵蛋白不僅是在如上所述的鼻黏膜中，而且是在各種組織中發現、分泌的蛋白質。在人類的各種組織中，使用根據作為利用下一代序列發生器進行表達解析的方法之一的 CAGE 法(Kanamor1-Katayama M, et al.Genome Res.(2011)5 月 19)得到的數據，來獲得將編碼乳鐵蛋白的蛋白質的RNA表達量為何種程度進行解析、比較的數據，因此作為參考示於表I。其結果可知，乳鐵蛋白的表達量高的組織有各種組織，暗示本發明的預處理方法的可應用性寬廣。
(表 I)
權利要求
1.物樣本的預處理方法，其是包含RNA的生物樣本的預處理方法，其特徵在於: 所述生物樣本包含乳鐵蛋白(Lactferrin), 對所述生物樣本實施乳鐵蛋白的RNA分解活性抑制處理。
2.權利要求1的生物樣本的預處理方法，其特徵在於:通過在所述生物樣本中添加乳鐵蛋白的RNA分解活性抑制劑，來對所述生物樣本實施乳鐵蛋白的RNA分解活性抑制處理。
3.權利要求1或2的生物樣本的預處理方法，其特徵在於:所述生物樣本包括:動物的鼻黏膜、鼻竇黏膜、氣管黏膜、唾液、來自口腔或咽喉的分泌液、淚、乳汁、膽汁、血液(白細胞)、子宮頸管的黏膜、內外生殖器的黏膜、羊水、或尿。
4.權利要求3的生物樣本的預處理方法，其特徵在於:所述動物為人類。
5.權利要求1至4中任一項的生物樣本的預處理方法，其特徵在於:所述生物樣本包括人類鼻黏膜。
6.權利要求1至5中任一項的生物樣本的預處理方法，其特徵在於:進一步對所述生物樣本實施溶菌酶C (Lysozyme C)的反轉錄抑制活性抑制處理。
7.權利要求6的生物樣本的預處理方法，其特徵在於:通過在所述生物樣本中添加溶菌酶C(Lysozyme C)的反轉錄抑制活性抑制劑,來對所述生物樣本實施溶菌酶C(LysozymeC)的反轉錄抑制活性抑制處理。
8.權利要求7的生物樣本的預處理方法，其特徵在於:所述RNA分解活性抑制劑及所述反轉錄抑制活性抑制劑中的至少一種包括鐵離子劑及碳酸根離子劑。
9.權利要求8的生物樣本 的預處理方法，其特徵在於:對添加了所述鐵離子劑及碳酸根離子劑的所述生物樣本進行加熱處理。
10.權利要求1至9中任一項的生物樣本的預處理方法，其特徵在於:進一步在所述生物樣本中添加極性表面活性劑。
11.權利要求10的生物樣本的預處理方法，其特徵在於:所述極性表面活性劑為SDS。
12.測方法，其是生物樣本中的RNA的檢測方法，其特徵在於: 所述生物樣本包含乳鐵蛋白(Lactferrin), 並且包括:對所述生物樣本進行預處理的預處理步驟，及 通過對經所述預處理的生物樣本中的所述RNA進行擴增而進行檢測的RNA擴增檢測步驟， 所述預處理步驟通過權利要求1至11中任一項的生物樣本的預處理方法實施。
13.權利要求12的檢測方法，其特徵在於:所述預處理步驟通過權利要求1至9中任一項的生物樣本的預處理方法實施， 在所述RNA擴增檢測步驟中，在經所述預處理的生物樣本中進一步添加表面活性劑。
14.權利要求13的檢測方法，其特徵在於:所述表面活性劑為非極性表面活性劑。
15.權利要求12至14中任一項的檢測方法，其特徵在於:所述RNA的擴增通過使用反轉錄酶的基因擴增方法而實施。
16.權利要求15的檢測方法，其特徵在於:所述基因擴增方法是使用鏈置換DNA聚合酶的等溫擴增方法。
17.處理試劑盒，其是包含RNA的生物樣本的預處理試劑盒，其特徵在於: 所述生物樣本包含乳鐵蛋白(Lactferrin),並且所述預處理試劑盒包含乳鐵蛋白的RNA分解活性抑制劑。
18.權利要求17的預處理試劑盒,其特徵在於:進一步包含溶菌酶C(Lysozyme C)的反轉錄抑制活性抑制劑。
19.權利要求18的預處理試劑盒，其特徵在於:所述RNA分解活性抑制劑及所述反轉錄抑制活性抑制劑中的至少一種包含鐵離子劑及碳酸根離子劑。
20.權利要求19的預處理試劑盒，其特徵在於:以相互不接觸的狀態包含所述鐵離子劑及所述碳酸根離子劑。
21.權利要求17至20中任一項的預處理試劑盒，其特徵在於:進一步包含極性表面活性劑。
22.權利要求21的預處理試劑盒，其特徵在於:所述極性表面活性劑為SDS。
23.權利要求17至20中任一項的預處理試劑盒，其特徵在於:進一步包含非極性表面活 性劑。
全文摘要
提供能夠迅速且簡便地檢測RNA的預處理方法。通過在包含人類鼻黏膜的生物樣本中添加例如鐵離子及碳酸根離子，來抑制存在於人類鼻黏膜的乳鐵蛋白的RNA分解活性。如果使用經預處理的生物樣本，則可以使用反轉錄酶擴增RNA病毒的基因。鐵離子及碳酸根離子也可以抑制人類鼻黏膜中的溶菌酶C的反轉錄酶抑制。另外優選通過在包含人類鼻黏膜的生物樣本中添加SDS，來除去RNA病毒的被膜。
文檔編號C12N9/36GK103097531SQ201280001834
公開日2013年5月8日 申請日期2012年6月28日 優先權日2011年6月29日
發明者林崎良英, 臼井健悟, 合田砂織, 野村和仁, 川井雄輝 申請人:達納福股份有限公司