一種白介素－2和腸毒素a融合基因及其製備的製作方法

2023-04-26 10:13:31

專利名稱：一種白介素－2和腸毒素a融合基因及其製備的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因重組技術，具體說是一種白介素-2(IL-2)和腸毒素A(SEA)融合基因及其製備。
背景技術：
IL-2是一種激活T-細胞產生在淋巴細胞間作用淋巴因子；人類IL-2是一條由133個胺基酸殘基組成的多肽鏈(Rene Devos，Geert Plaetinck，HildeCheroutre，Guus Simons，Wim Degrave，Jan Tavernier，Erik Remaut and WaltrFiers，Molecular cloning of human interleukin 2 cDNA and its expression inE.coli.，Nucleic Acids Research，1983，11(13)4307-4323)；最近幾年IL-2用於腫瘤治療的研究使人們重視了它的人工置備。
SEA是一種單亞基蛋白質，其前體由257個胺基酸組成，包括N端24個殘基構成的信號肽；前體經信號肽酶加工後轉變為成熟SEA，其分子量為27KD(Marsha JB，John J.Mekalanos.Nucleotide Sequence of the type AStaphylococcal enterotoxin Gene.J.Bacteriol.1988；170(1)34-41)。最近幾年用於抗腫瘤的導向藥物研究；有IL-2和綠膿桿菌毒素製得融合基因的報導(Lorberboum-Galski H，Garsia RJ，Gately M，Brown P S，Clark R E，WaldmannTA，Chaudhary V K，FitzGerald D J，Pastan I.IL2-PE664Glu，a new chimericprotein cytotoxic to human-activated T lymphocytes.J Biol Chem.1990；265(27)16311-16317.)。有關白介素-2和腸毒素A融合基因的研究還未見報導。

發明內容
本發明的的目的是提供一種新的、其表達可用於抗腫瘤靶向藥物的白介素-2和腸毒素A融合基因及其製備。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案如下白介素-2和腸毒素A融合基因，具有序列表SEQ ID NO1中鹼基序列。
白介素-2和腸毒素A融合基因的製備方法，以天然SEA基因和突變的IL-2基因為基礎，通過連接物(linker)5′ggtggtggtggtggtggtacc3′製得融合基因；IL-2基因在融合基因的5′端，SEA基因在融合基因的後邊，即IL-2的C端通過肽連接物與SEA的N端相連接。
以天然的SEA基因為模板，採用引物SEA-F 5′ACGGTACCAGCGAGAAAAGCGAAG 3′和SEA-R 5′CGGAAGCTTCTATTAACTGGTATATAAATAGATAGCAAT 3′通過PCR技術擴增出SEA基因片段；以突變的IL-2基因為模板，採用引物IL-2-F 5′ACTGATTACATATGGCTCCGACTTC 3′和IL-2-R 5′ACGGGTACCACCACCACCACCACCAGTCAGAGTAGAGATG 3′通過PCR技術擴增出IL-2基因片段。
突變後的IL-2基因鹼基序列(詳見，中國專利申請號03111487.3)如下1 GCTCCGACTT CTAGCTCTAC CAAGAAAACC30 CAGCTGCAGC TGGAACACCT GCTGCTGGAT60 TTACAGATGA TTCTGAACGG TATCAACAAC90 TACAAGAACC CGAAACTGAC CCGTATGCTG120 ACCTTCAAGT TTTACATGCC GAAGAAAGCT150 ACCGAACTGA AACATCTTCA GTGTCTAGAA180 GAAGAACTCA AACCTCTGGA GGAAGTTCTG210 AACCTGGCTC AGAGCAAAAA CTTTCACCTG240 CGTCCGCGTG ACTTAATCAG CAATATCAAC270 GTAATAGTTC TGGAACTGAA AGGTTCTGAA300 ACCACCTTCA TGTGCGAATA TGCTGATGAG330 ACAGCAACCA TTGTAGAATT TCTGAACCGT360 TGGATTACCT TCTCTCAGTC TATCATCTCT390 ACTCTGACT-3′為表達和藥用需要天然IL-2和SEA基因進行了適當突變，SEA的第227位的天冬氨酸突變成了丙氨酸，IL-2的125位半胱氨酸突變為丙氨酸。
Linker為5′ggtggtggtggtggtggtacc3′相對應的肽為6個甘氨酸和1個蘇氨酸即-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Thr-本發明具有如下優點1.本發明為人工製備的一新基因，屬首次製得的基因，該基因的表達可用於抗腫瘤靶向藥物的研究和藥物。
2.應用本發明，可進一步提供直接用於生產IL-2(125Ala)-SEA(227Ala)的工程菌株。
3.本發明基因的表達提供了一種新的蛋白，較好地利用了IL-2的導向功能，可充分發揮SEA的抗腫瘤作用。


圖1為融合基因在大腸桿菌中表達電泳圖；其中1為中型蛋白標準，2為對照，3為本發明實例工程菌。
具體實施例方式
實施例1白介素-2和腸毒素A融合基因，具有SEQ ID NO1所示的序列(1)SEQ ID NO.1的信息(參見序列表)(a)序列特徵*長度1122鹼基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源白介素-2(human interleukin 2)，腸毒素A(Staphylococcal enterotoxin A)材料菌株和E.coli DH5α、JM109(DE3)為市購獲得；質粒含有該融合基因的質粒，pTE-30a-(+)表達載體，7ZTS載體(參見中國專利申請02109681.3)本實例構建(也可用市購7Z替代)；分子生物學試劑Taq DNA polymerase，Pfu DNA polymerase，dNTP，hind III，Nde I，T4 DNA Ligase皆為美國Promega公司產品，膠回收及質粒提取試劑盒都是上海華舜公司產品，瓊脂糖購自FMC生物製品公司，其餘產品均為國產分析純；儀器Sprint PCR儀是英國Hybaid公司產品，離心機micromax230由IEC(International Equipment Company)公司製造，基因脈衝轉化儀是Bio-Rad產品，DFD電泳儀是北京東方特力科貿中心產品，ShimadzuDual-Wavelength TLC Sanner，CS-930。
製備過程1.融合基因突變和擴增採用PCR方法；參考文獻時成波，呂安國，吳文芳，楊立泉等，改變稀有密碼子提高SEA的表達水平，《生物工程學報》2002，18(4)477-480.
2.融合基因的鑑定1)質粒的提取參照文獻《精編分子生物學實驗指南》和J.薩姆布魯克，E.F.費裡奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆實驗指南》科學出版社1998年版P16-34；2)PCR引物設計及反應條件
根據SEQ ID NO1所示的序列，設計一組引物正向引物IL-2-F 5′ACTGATTACATATGGCTCCGACTTC 3′反向引物SEA-R 5′CGGAAGCTTCTATTAACTGGTATATAAATAGATAGCAAT 3′第一階段97℃，1分鐘；第二階段95℃，40秒；59℃，30秒；72℃，45秒；共30個循環；第三階段72℃，5分鐘；以含融合基因的DNA為模板進行PCR；退火溫度採用50℃；反應體系參考文獻J.薩姆布魯克，E.F.費裡奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆實驗指南》科學出版社1998年版P680；3)PCR產物的回收按上海華舜試劑盒使用說明書操作；4)PCR產物與7ZTS載體的連接將7ZTS載體和PCR產物分別用hindIII和Nde I進行雙酶切，並用試劑盒純化，然後與T4buffur，ddH2O，T4 ligase混合，共10μL，於16℃過夜；次日，於體系中加1μL NaAc，30μL無水乙醇，混勻，-80℃放置20分，室溫下15000rpm離心15分；沉澱用75％乙醇洗4次，室溫涼幹，加入10μL ddH2O溶解，取5μL轉化感受態細胞；感受態細胞(E.coli DH5α)的製備和電擊轉化方法，按(J.薩姆布魯克，E.F.費裡奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆實驗指南》科學出版社1998年版P49-55)中的方法操作；處理後的連接物轉化E.coli DH5α感受態細胞，在選擇平板上挑選5個白色菌落進行鑑定；5個菌體的質粒進行電泳圖譜表明有兩個菌可能是轉化子，進一步用HindIII和Nde□對這兩個菌的重組質粒雙酶切，釋放出約400bpDNA片段；初步證明，這兩個菌即是轉化子；5)DNA序列測定將轉化的感受態細胞接種於1ML LB培養基中，37℃培養1小時，取100μL塗於含Amp IPTG X-Gal的平板上，37℃培養16小時，提取質粒先進行雙酶切初步鑑定。將經過初步鑑定的白色轉化子由平板接種於5ml LB(含50μg/ml Amp)培養液中，培養20小時後取4.5ml發酵液離心，得菌體；用試劑盒提取質粒，準備測序。
對兩個轉化子重組質粒測序結果表明，所克隆的DNA片段含有融合基因的1122bp成熟蛋白基因，其鹼基序列與設計一致。
3.構建融合基因表達的工程菌1)融合基因與PTE-30a-(+)載體的連接及轉化將經測序正確的IL-2突變基因和PTE-30a-(+)載體分別用NdeI和Hind III雙酶切；酶切體系如下DNA 6μl，ddH2O 10μl，K buffer 2μl，NdeI和Hind III各1μl；37℃反應2小時，柱回收；用T4ligase將雙酶切後的產物連接，連接體系如下T4ligase buffer 1μl，T4ligase 1μl，雙酶切PTE-30a-(+)載體1μl，雙酶切PCR產物7μl；將雙切後的目的基因與同樣雙酶切的PTE-30a-(+)表達載體於15℃連接過夜；向連接體系中加入1μl 3M NaAc，30μl無水乙醇，搖勻，-20℃靜置1小時，15000rp離心15分鐘；沉澱用75％乙醇洗4次，室溫乾燥；用10μl ddH2O溶解，取5μl轉化E.coli JM109(DE3)；挑選9個白色轉化子，提取質粒進行雙酶切鑑定；用HindIII and NdeI對質粒雙酶切，產生約1100bp的DNA片段，初步證實了這9個菌株都是轉化子；取9個轉化子中之一菌株質粒進行DNA序列的測定；測序結果表明，融合基因完全按預先設計方式連接到7ZTS載體上，鹼基序列完全正確；2)融合基因的表達分別挑取JM109(DE3)單菌落於LB(含Amp 50μg/ml)中，37℃過夜培養；次日，以1％接種量轉接新鮮LB(含Amp 50μg/ml)；當OD600達到0.6～0.8時，1.0mmol/L的IPTG誘導，於32℃表達10小時；1ml發酵液的菌體離心，用ddH2O洗一次，懸於1倍SDS樣品加樣液，沸水浴煮10分鐘，12000g離心2分鐘，取15μl進行15％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，結果用薄層掃描儀在波長560nm處掃描；在工程菌的細胞全蛋白電泳圖譜中有一明顯表達帶，見圖1，分子量約43000dalton；OD560薄層掃描顯示此表達蛋白佔菌體總蛋白的10％。
本發明基因序列為atggctccga cttctagctc taccaagaaa acccagctgc agctggaaca cctgctgctg gatttacagatgattctgaa cggtatcaac aactacaaga acccgaaact gacccgtatg ctgaccttca agttttacatgccgaagaaa gctaccgaac tgaaacatct tcagtgtcta gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagttctgaacctgg ctcagagcaa aaactttcac ctgcgtccgc gtgacttaat cagcaatatc aacgtaatagttctggaact gaaaggttct gaaaccacct tcatgtgcga atatgctgat gagacagcaa ccattgtagaatttctgaac cgttggatta ccttctctca gtctatcatc tctactctga ctggtggtgg tggtggtggtaccagcgaga aaagcgaaga aataaatgaa aaagatttgc gaaaaaagtc tgaattgcag ggaacagctttaggcaatct taaacaaatc tattattaca atgaaaaagc taaaactgaa aataaagaga gtcacgatcaatttttacag catactatat tgtttaaagg cttttttaca gatcattcgt ggtataacga tttattagta gattttgattcaaaggatat tgttgataaa tataaaggga aaaaagtaga cttgtatggt gcttattatg gttatcaatgtgcgggtggt acaccaaaca aaacagcttg tatgtatggt ggtgtaacgt tacatgataa taatcgattgaccgaagaga aaaaagtgcc gatcaattta tggctagacg gtaaacaaaa tacagtacct ttggaaacggttaaaacgaa taagaaaaat gtaactgttc aggagttgga tcttcaagca agacgttatt tacaggaaaaatataattta tataactctg atgtttttga tgggaaggtt cagaggggat taatcgtgtt tcatacttctacagaacctt cggttaatta cgatttattt ggtgctcaag gacagtattc aaataccctg ttacgtatctatcgtgataa taaaacgatt aactctgaaa acatgcatat tgctatctat ttatatacca gt
SEQUENCE LISTING110 中國科學院瀋陽應用生態研究所屹昌科技集團有限公司120 一種白介素-2和腸毒素A融合基因及其製備130
160 1170 PatentIn version 3.1210 1211 1122212 DNA213 融合基因220
221 gene222 (1)..(1122)223
400 1atggctccga cttctagctc taccaagaaa acccagctgc agctggaaca cctgctgctg60gatttacaga tgattctgaa cggtatcaac aactacaaga acccgaaact gacccgtatg120ctgaccttca agttttacat gccgaagaaa gctaccgaac tgaaacatct tcagtgtcta180gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtt ctgaacctgg ctcagagcaa aaactttcac240ctgcgtccgc gtgacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact gaaaggttct300gaaaccacct tcatgtgcga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac360cgttggatta ccttctctca gtctatcatc tctactctga ctggtggtgg tggtggtggt420accagcgaga aaagcgaaga aataaatgaa aaagatttgc gaaaaaagtc tgaattgcag480ggaacagctt taggcaatct taaacaaatc tattattaca atgaaaaagc taaaactgaa540aataaagaga gtcacgatca atttttacag catactatat tgtttaaagg cttttttaca600gatcattcgt ggtataacga tttattagta gattttgatt caaaggatat tgttgataaa660tataaaggga aaaaagtaga cttgtatggt gcttattatg gttatcaatg tgcgggtggt720
acaccaaaca aaacagcttg tatgtatggt ggtgtaacgt tacatgataa taatcgattg780accgaagaga aaaaagtgcc gatcaattta tggctagacg gtaaacaaaa tacagtacct840ttggaaacgg ttaaaacgaa taagaaaaat gtaactgttc aggagttgga tcttcaagca900agacgttatt tacaggaaaa atataattta tataactctg atgtttttga tgggaaggtt960cagaggggat taatcgtgtt tcatacttct acagaacctt cggttaatta cgatttattt1020ggtgctcaag gacagtattc aaataccctg ttacgtatct atcgtgataa taaaacgatt1080aactctgaaa acatgcatat tgctatctat ttatatacca gt 112權利要求
1.一種白介素-2和腸毒素A融合基因，其特徵在於具有序列表SEQID NO1中鹼基序列。
2.一種權利要求1所述白介素-2和腸毒素A融合基因的製備方法，其特徵在於以天然SEA基因和突變的IL-2基因為基礎，通過連接物5′ggtggtggtggtggtggtacc3′製得融合基因；IL-2基因在融合基因的5′端，SEA基因在融合基因的後邊，即IL-2的C端通過肽連接物與SEA的N端相連接。
3.按照權利要求2所述融合基因的製備方法，其特徵在於以天然的SEA基因為模板，採用引物SEA-F 5′ACGGTACCAGCGAGAAAAGCGAAG 3′和SEA-R 5′CGGAAGCTTCTATTAACTGGTATATAAATAGATAGCAAT 3′通過PCR技術擴增出SEA基因片段。
4.按照權利要求2所述融合基因的製備方法，其特徵在於以突變的IL-2基因為模板，採用引物IL-2-F 5′ACTGATTACATATGGCTCCGACTTC 3′和IL-2-R 5′ACGGGTACCACCACCACCACCACCAGTCAGAGTAGAGATG 3′通過PCR技術擴增出IL-2基因片段。
全文摘要
本發明涉及基因重組技術，具體地說是白介素－2(IL－2)和腸毒素A(SEA)的融合基因及其製備，它具有序列表SEQ ID NO1中鹼基序列，以天然的SEA基因和突變的IL－2基因為基礎，利用PCR技術，設計適當的連接物，將兩個基因連接起來製得融合基因；該基因能在大腸桿菌中表達。
文檔編號C12P19/34GK1580263SQ0313367
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月13日 優先權日2003年8月13日
發明者吳文芳, 楊立泉, 呂安國, 時成波 申請人:中國科學院瀋陽應用生態研究所, 屹昌科技集團有限公司