一株對多主棒孢菌具備抑制作用的鏈黴菌及其應用的製作方法

2023-06-20 13:24:42 3

本發明屬於農作物防治
技術領域：
，具體涉及一株對多主棒孢菌具備抑制作用的鏈黴菌及其應用。
背景技術：
：多主棒孢菌(Corynesporacassiicola)，隸屬於半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色菌科、棒孢屬，是一種寄主範圍廣泛的世界性分布的植物病原真菌，是該屬內發現最早、寄主範圍最廣的種。能侵染熱帶及亞熱帶地區近380個屬內的530種植物，包括黃瓜、番茄、棉花、豇豆、大豆、木瓜、菸草和橡膠等(Smith,2008)。該病菌主要危害植物的葉片，形成典型具黃色暈圈的壞死斑，也可侵染根、莖、花和果實，嚴重時造成落葉、落果等現象。1958年在印度首次報導了由多主棒孢菌引起的橡膠樹棒孢黴落葉病(RamakrishnanandPilla，1961)，20世紀50-80年代該病害在亞太和非洲的主要產膠地區相繼發生，但是由於該病害的發生僅限於苗圃和幼小的植株上且為害不大，一直作為一種次要病害而未引起人們的關注。但是近年來病害調查發現，由多主棒孢菌引起的植物病害已經對世界上多類經濟作物生產造成了嚴重影響，並造成巨大經濟損失，如在南美地區多主棒孢菌引起口紅花、一串紅、一品紅、水黃楊和黃瓜、番茄、辣椒等園藝作物的棒孢葉斑病；在美國中西部地區，主要引起大豆、豇豆和芝麻等作物的棒孢葉斑病，番茄種植地損失達11800千克/公頃(Perneznyetal.，1996)，據估計，一旦發生嚴重的棒孢黴落葉病的為害，橡膠樹產量損失將近20％；另外，在巴西、菲律賓、奈及利亞、印度以及韓國和日本等亞洲國家也有棒孢葉斑病的報導(Chee，1990)。在我國，魏景超最早於1950年在黃河下遊地區發現豇豆棒孢葉斑病，但由於豇豆種植面積有限，並未引起重視。20世紀90年代初，我國河南、遼寧等地黃瓜、茄子蔬菜栽培地受到多主棒孢的普遍侵染，造成了一定的經濟損失。1994年的調查發現，黃瓜棒孢葉斑病在遼寧省瀋陽、瓦房店和丹東等地普遍發生，但未擴展蔓延。但近幾年，該病的危害呈明顯的上升趨勢，2005年至今，該病在山東、河北、北京、遼寧、吉林、河南、雲南、海南等19個省市區大暴發，主要危害黃瓜、番茄、茄子、菜豆等蔬菜，每年發生面積超過1000萬畝，損失超過50億。而以保護地黃瓜危害最為嚴重，一般病田葉發病率為10％-25％，嚴重時可達60％-70％，甚至100％，由於棒孢葉斑病在我國蔬菜和橡膠種植區危害嚴重，並已經造成了重大經濟損失，嚴重製約了我國蔬菜和橡膠產業的發展。如果該病不能得到有效的控制，將對我國黃瓜、番茄和茄子等重要蔬菜和橡膠產業造成毀滅性的打擊。目前，化學防治仍然是防治該病害的主要手段，其具有使用範圍廣、見效快、使用方便，能及時有效的控制如作物棒孢葉斑病這種突發性的病害。國外早先已經開展了防治橡膠棒孢葉斑病殺菌劑的篩選與應用研究，推薦較好的藥劑有多菌靈、甲基硫菌靈和代森錳鋅。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在日本已經應用於蔬菜棒孢葉斑病的防治，2006年日本就將啶醯菌胺登記為防治黃瓜棒孢葉斑病的藥劑，並取得了良好的防治效果(Miyamotoetal.，2009)。雖然化學藥劑在作物棒孢葉斑病的防治中起到了重要的作用，但是由於其頻繁的使用，也產生了抗藥性的問題，早在1979年，日本西部大分縣黃瓜棒孢葉斑病已經成為當地黃瓜生產的重要病害，最初使用苯並咪唑類殺菌劑進行防治取得了良好的效果，但是由於抗藥性的產生防效開始下降(Hasama，1991)。2006年7月，啶醯菌胺在日本作為日本防治黃瓜棒孢葉斑病的登記藥劑，隨後對其敏感性進行了監測，在對438個黃瓜棒孢葉斑病的菌株抗藥性的檢測中發現，214株對啶醯菌胺產生抗藥性，抗性頻率高達49％(MIC>30μg/ml)，其中189個菌株為中抗菌株(EC501.1-6.3μg/ml)，25個菌株為超高抗菌株(EC50>24.8μg/ml)(Miyamotoetal，2009)。針對我國作物棒孢葉斑病對微管蛋白抑制劑多菌靈和乙黴威抗藥性也有相關進的系統研究。研究表明我國多主棒孢菌對多菌靈抗性頻率極高，而對多菌靈和乙黴威雙抗頻率較低。對採自我國12個地區，18個寄主的163株多主棒孢菌對多菌靈和乙黴威的敏感性進行分析，145個菌株對多菌靈具有抗藥性，抗性頻率高達89.0％。僅18個菌株對多菌靈敏感，佔供試菌株的11.0％。24個菌株對多菌靈和乙黴威具有雙重抗藥性，雙抗頻率為14.7％(Huangetal.，2013)。從研究中可知，儘管多菌靈沒有作為棒孢葉斑病的登記藥劑，但實際上已經產生非常嚴重的抗藥性。放線菌(Actinomycetes)是自然界一種非常重要的微生物類群，屬於原核生物的一個類群。放線菌目(Actinomyeetales)。其在自然界中非常豐富，在作物病害防治方面具有巨大的使用價值和經濟價值，其產生的代謝產物(尤其是抗生素)在作物病害防治中發揮了重大作用，抗生素具有高效、低毒、易降解、無殘留、對環境友好等特點，這是化學農藥沒有的，近年來，國內外均不斷發現新的抗生素種類，如井岡黴素、春雷黴素、寧南黴素、武夷黴素和中生菌素等。但目前分離到的放線菌僅為實際種類的0.1-1％，因此其具有很大的應用和開發空間，目前還沒有放線菌活菌製劑及其產生的抗生素防治棒孢葉斑病的報導。開發出防治作物棒孢葉斑病的新型殺菌劑具有重大的實踐意義。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種對多主棒孢菌具備抑制作用的鏈黴菌，所述的鏈黴菌為產褐黃色鏈黴菌(Streptomycesphaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958，保藏編號為：CCTCCNO：M2015768。該菌株對多主棒孢菌具備抑制作用，可用於植物棒孢葉斑病的防治。本發明的另一個目的在於提供了鏈黴菌HEBRC-45958的製備方法，方法簡單，易行，利用該方法製得的發酵液，有效物質含量高，具備良好的生產前景。本發明的最後一個目的在於提供了鏈黴菌HEBRC-45958在製備防治植物棒孢葉斑病藥物中的應用。為了達到上述目的，本發明採取以下技術方案來實現。一株對多主棒孢菌具有良好抑制作用鏈黴菌，從武漢東湖磨山採集的土壤中分離，經16srDNA鑑定後屬於產褐黃色鏈黴菌(Streptomycesphaeoluteichromatogenes)，已於2015年12月23日送至中國典型培養物保藏中心進行保藏，分類命名：產褐黃色鏈黴菌(Streptomycesphaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958；保藏編號為CCTCCNO：M2015768；地點：中國，武漢，武漢大學。產褐黃色鏈黴菌(Streptomycesphaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958在ISP-2培養基上生長良好，菌落褐黃色，孢子表面光滑。產褐黃色鏈黴菌HEBRC-45958的製備方法，包括：將產褐黃色鏈黴菌HEBRC-45958種子液按3-10％(V/V)的接種量轉入發酵培養基中。溫度為28℃，發酵罐的攪拌速度200-500轉/分，發酵培養基的裝量為罐體容積的60％-80％；發酵4-6天即可；所述的發酵培養基的配方包括：甘露醇1-3％、大豆蛋白腖1-3％、酵母粉0.3-0.5％、碳酸鈣0.3-0.5％、氯化鈉0.3-0.8％；pH值6.5-7.5，其餘為水，以上均是質量比。優選的，所述的鏈黴菌HEBRC-45958種子液的製備方法包括:將斜面保存菌種在ISP-2平板活化，挑取接種至100毫升種子培養基中，在28℃，130-160轉/分的搖床上培養3-4天；既得種子液。所述的種子培養基的配方與發酵培養基相同。產褐黃色鏈黴菌HEBRC-45958在製備防治植物棒孢葉斑病藥物中的應用，包括將該菌株的發酵液或是發酵液稀釋後直接噴灑於植物葉部和/或莖部，或是與其他有效成分製成複合製劑以防治多種植物病害，優選的，發酵液與水按1：20-1:100(體積比)稀釋。只要是由多主棒孢菌引起的棒孢葉斑病均可用本發明提供的產褐黃色鏈黴菌HEBRC-45958製備的製劑進行防治。所述的植物包括但不限於黃瓜、番茄，茄子和橡膠樹。與現有技術相比，本發明具有以下優點：(1)首次報導鏈黴菌應用於防治植物棒孢子葉斑病，其與現有殺菌劑無交互抗藥性。(2)與目前使用化學合成殺菌劑防治相比，由於其來自於自然環境，具有高效、低毒、不汙染環境和不易產生抗藥性等優點。附圖說明圖1為HEBRC-45958菌株在ISP-2培養基上的孢子及菌落形態。左圖為菌株HEBRC-45958顯微鏡(1000X)觀察照片，右圖為菌株HEBRC-45958的平板菌落形態。圖2為HEBRC-45958與多主棒孢菌(C.cassiicola)對峙培養。圖3為顯微鏡下對照和處理菌絲形態。圖4為HEBRC-45958發酵液對番茄棒孢葉斑病防治效果。圖5為HEBRC-45958發酵液對茄子棒孢葉斑病防治效果。具體實施方式為了更好地解釋本發明，以下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但本發明的內容不僅僅局限於以下實施例。本發明所述技術方案，如未特別說明，均為本領域的常規技術，所述試劑或材料，如未特別說明，均來源於商業渠道。實施例1：一株對多主棒孢菌具有良好抑制作用鏈黴菌，從武漢東湖磨山採集的土壤中分離，經16srDNA鑑定後屬於產褐黃色鏈黴菌(Streptomycesphaeoluteichromatogenes)，已於2015年12月23日送至中國典型培養物保藏中心進行保藏，分類命名：產褐黃色鏈黴菌(Streptomycesphaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958；保藏編號為CCTCCNO：M2015768；地點：中國，武漢，武漢大學。在本發明中，產褐黃色鏈黴菌(Streptomycesphaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958或被稱為HEBRC-45958。形態特徵：在ISP-2培養基上生長良好，菌落褐黃色，孢子表面光滑(圖1)。菌株生理生化特性：表1HEBRC-45958菌株碳源利用+：陽性，-：陰性實施例2：產褐黃色鏈黴菌HEBRC-45958的製備方法，包括：將斜面保存菌種在ISP-2平板活化，挑取接種至100毫升種子培養基中，在28℃，160轉/分的搖床上培養4天；既得種子液。所述的種子培養基的配方與發酵培養基相同。將鏈黴菌HEBRC-45958種子液按5％(V/V)的接種量轉入發酵培養基中。溫度為28℃，發酵罐的攪拌速度300轉/分，發酵培養基的裝量為20L罐體容積的80％；發酵6天即可；製得的發酵液用於實施例4。所述的發酵培養基的配方包括：：甘露醇2％、大豆蛋白腖1.5％、酵母粉0.3％、碳酸鈣0.5％、氯化鈉0.5％；pH值7，以上均為質量比，其餘為水。實施例3：產褐黃色鏈黴菌(S.phaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958對多主棒孢菌(C.cassiicola)離體抑制效果：將斜面保存HEBRC-45958菌株在ISP-2平板活化，28℃培養4d，用打孔器打取4mm大小菌碟，放置於PDA平板中央。將斜面保存多主棒孢菌(C.cassiicola)在PDA培養基活化5d，打取4mm菌碟在距HEBRC-45958菌碟四周25mm處放置四個，對峙培養7d後觀察抑菌帶。挑取多主棒孢菌(C.cassiicola)與HEBRC-45958對峙邊緣菌絲，在顯微鏡下處理與對照菌絲形態差別。HEBRC-45958與多主棒孢菌(C.cassiicola)對峙產生明顯的抑菌帶，抑菌帶寬度25mm(圖2)，具有強烈的抑制作用，與對照菌絲相比，處理菌絲發生了扭曲、腫脹和變形(圖3)。實施例4：產褐黃色鏈黴菌(S.phaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958防治作物棒孢葉斑病效果：將番茄和茄子種子催芽，分別播種於32孔和72孔穴盤，溫室常規管理，生長20d後用於盆栽試驗。供試病原菌分離自田間發生棒孢葉斑病的的番茄和茄子，並在4℃條件下保存於PDA斜面中。將其活化，在PDA培養基擴繁，28℃光照培養12d，加入無菌水用刷子刷取孢子，使用紗布過濾。血球計數板觀察孢子數，使用無菌水將孢子濃度調節到1×105/ml，加入終濃度為0.1％吐溫80作為分散劑。將實施例2製備的HEBRC-45958發酵液稀釋50倍，噴灑於番茄和茄子葉部至滴水，24h後噴施番茄和茄子棒孢葉斑病菌孢子懸浮液至葉面飽和。以噴施50％啶醯菌胺水分散粒劑作為對照藥劑，有效成分濃度為333.3μg/ml。噴施清水作為空白對照，每個處理三次重複。在人工氣候箱28℃保溼培養。4d後統計對照和各處理病情指數，並計算防效。番茄和茄子棒孢葉斑病病情指數分級標準如下(Ishiietal.，2007)。0級：無病害症狀0.1級：病斑小於葉面積1％0.5級：病斑佔葉面積1％-5％之間1級：病斑佔葉面積6％-10％之間2級：病斑佔葉面積11％-20％之間3級：病斑佔葉面積21％-30％之間4級：病斑佔葉面積31％-40％之間5級：病斑佔葉面積41％-50％之間6級：病斑佔葉面積51％-60％之間7級：病斑佔葉面積61％-70％之間8級：病斑佔葉面積71％-80％之間9級：病斑佔葉面積81％-90％之間10級：病斑大於葉面積90％以上根據表2和3可知，HEBRC-45958發酵液稀釋50倍對番茄和茄子棒孢葉斑病具有良好的防治效果(圖4，5)，防效分別達到88.53％和91.64％，與對照化學藥劑啶醯菌胺防效相當。表2HEBRC-45958對番茄棒孢葉斑病防治效果處理病情指數防效(％)HEBRC-4595811.1188.53啶醯菌胺12.3487.26清水對照96.88-表3HEBRC-45958對茄子棒孢葉斑病防治效果處理病情指數防效(％)HEBRC-459587.3391.64啶醯菌胺9.4189.27清水對照87.67-當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp