提高小麥×玉米雜交授粉成功率的溫水浸泡柱頭法的製作方法
2023-06-02 12:05:01
本發明屬於小麥品種選育技術領域，尤其涉及一種提高小麥x玉米雜交授粉成功率的溫水浸泡柱頭法。
背景技術：
小麥×玉米遠緣雜交生產小麥單倍體，經染色體加倍形成純合小麥雙單倍體新品系，是縮短小麥育種純合年限的有效手段，其中，成胚率低是制約其應用的主要障礙。受親本、環境和操作流程影響，在單倍體生產諸環節中，各種文獻報導的成胚率變幅最大，後續的成胚、胚拯救、染色體加倍、育苗等均不是最大的限制因素。提高成胚率，是雙單倍體生產的關鍵步驟。
影響成胚率的主要因素是受精和激素誘導。據報導，優化後的激素誘導技術，可使成胚率接近受精率，目前報導的最高受精率為10-30%。受精過程涉及花粉和柱頭的相互識別和花粉管伸長等過程，因此認為，小麥x玉米遠緣雜交過程中的關鍵步驟是擾亂識別機制，提高受精率。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題就是提供一種提高小麥×玉米雜交授粉成功率的溫水浸泡柱頭法。
為解決上述問題，本發明採用的技術方案包括下列步驟：
第一步，小麥去雄
小麥開花前1-2天手工去雄，保留穗中部10個小穗、每個小穗外側2個小花，套袋隔離外來花粉；
第二步，授玉米粉
授玉米粉前1-2小時，將去雄的小麥穗浸入已經調好水溫在50-58度的水浴鍋中7-15秒，取出自然風乾，待柱頭恢復蓬鬆絨毛狀態後，授以新鮮玉米粉；
第三步，成胚
授粉後第二天，以75ppm2,4-二氯苯氧乙酸+50ppm2,5-二氯-6-甲氧基苯甲酸水溶液處理已經授粉的小麥穗，15-18天後，在解剖鏡下剝取其中幼胚，進入幼胚拯救程序。
其附加技術特徵為：所述水浴鍋的水溫為54度，去雄的小麥穗浸入已經調好水溫在54度的水浴鍋中10秒。
本發明所提供的提高小麥×玉米雜交授粉成功率的溫水浸泡柱頭法，是以小麥與玉米等其它禾本科植物雜交為手段，以謀求獲得小麥單倍體或遠緣雜交種為目的的育種操作。小麥x玉米雜交屬科內種間遠緣雜交，存在對異源花粉的識別機制，常規條件下的成功率低。溫水殺雄和溫水誘導多胚實驗中，溫水處理作為殺雄手段或誘導多胚的方法，難以掌握，效果不好。但有一個意外收穫，溫水處理後，小麥x玉米遠緣雜交的成胚率明顯提高。經初步驗證，其機制為，溫水洗脫了小麥柱頭上的可溶性糖，洗脫量12.5±5.8ug糖/mg幹柱頭，較常溫水的洗脫量6.2±3.2ug/mg提高2倍，降低了小麥柱頭對玉米花粉的識別能力。而溫水對可溶性蛋白質的洗脫僅為常溫水的1.05倍，超過56度或者15秒鐘可殺死小麥柱頭。本發明所提供的提高小麥×玉米雜交授粉成功率的溫水浸泡柱頭法，利用超過室溫的最佳溫度為54度的溫水處理去雄後的小麥穗10秒鐘，大大提高小麥×玉米雜交授粉成功率。
具體實施方式
下面結合具體實施方式對本發明提高小麥×玉米雜交授粉成功率的溫水浸泡柱頭法做進一步詳細說明。
實施例1
本發明提供的提高小麥×玉米雜交授粉成功率的溫水浸泡柱頭法，包括下列步驟：
第一步，小麥去雄
小麥開花前1天手工去雄，保留穗中部10個小穗、每個小穗外側2個小花，套袋隔離外來花粉；
第二步，授玉米粉
授玉米粉前1小時，將去雄的小麥穗浸入已經調好水溫在50度的水浴鍋中15秒，取出自然風乾，待柱頭恢復蓬鬆絨毛狀態後，授以新鮮玉米粉；
第三步，成胚
授粉後第二天，以75ppm2,4-二氯苯氧乙酸+50ppm2,5-二氯-6-甲氧基苯甲酸水溶液處理已經授粉的小麥穗，15天後，在解剖鏡下剝取其中幼胚，進入幼胚拯救程序。
實施例2
本發明提供的提高小麥×玉米雜交授粉成功率的溫水浸泡柱頭法，包括下列步驟：
第一步，小麥去雄
小麥開花前1.5天手工去雄，保留穗中部10個小穗、每個小穗外側2個小花，套袋隔離外來花粉；
第二步，授玉米粉
授玉米粉前1.5小時，將去雄的小麥穗浸入已經調好水溫在54度的水浴鍋中10秒，取出自然風乾，待柱頭恢復蓬鬆絨毛狀態後，授以新鮮玉米粉；
第三步，成胚
授粉後第二天，以75ppm2,4-二氯苯氧乙酸+50ppm2,5-二氯-6-甲氧基苯甲酸水溶液處理已經授粉的小麥穗，16天後，在解剖鏡下剝取其中幼胚，進入幼胚拯救程序。
實施例3
本發明提供的提高小麥×玉米雜交授粉成功率的溫水浸泡柱頭法，包括下列步驟：
第一步，小麥去雄
小麥開花前2天手工去雄，保留穗中部10個小穗、每個小穗外側2個小花，套袋隔離外來花粉；
第二步，授玉米粉
授玉米粉前2小時，將去雄的小麥穗浸入已經調好水溫在58度的水浴鍋中7秒，取出自然風乾，待柱頭恢復蓬鬆絨毛狀態後，授以新鮮玉米粉；
第三步，成胚
授粉後第二天，以75ppm2,4-二氯苯氧乙酸+50ppm2,5-二氯-6-甲氧基苯甲酸水溶液處理已經授粉的小麥穗，18天後，在解剖鏡下剝取其中幼胚，進入幼胚拯救程序。
附表1為最優溫度篩選實驗。參照穀子溫水殺雄方法，選擇50-60℃溫水處理去雄後1-2天的小麥穗，處理時間10秒，同天授粉不處理的相同組合作對照，材料為應用雜交組合良星99x邯4589。結果表明50-56℃均能是成胚率提高，最佳處理溫度為54℃，效果最好。其中，ck為不處理的對照。水浴鍋溫度控制精度±0.5℃，環境對其波動範圍有一定影響，所以每2℃進行試驗處理。處理時間：上午9點左右，授玉米粉之前1-2小時。58℃處理的已經有部分被燙死，無胚產生，與對照比增長率為-100%，60℃時已完全燙死，無數據。
附表1
附表2為組合間成胚率比較實驗。以恆溫54℃溫水、10秒進行試驗重複，不同組合平均成胚率提高148%，以同天授粉常溫水處理的相同組合作為對照（ck）。
附表2
附表3為可溶性總糖實驗。準備好20株小麥去雄材料，每株去雄20小花。
取20個早1天去雄的柱頭+子房，放入2.0mlep管中，將預先加熱到54度、室溫的水1000ul加入ep管中，用移液器上下吹吸10次，用時10秒，將水吸出，全部轉移到20ml試管中，加入80%（v/v）硫酸配製的2%（g/v）蒽酮試劑4ml，沸水浴加熱5分鐘，同時以100ug/ml標準葡萄糖為標準曲線，水為對照，冷卻後625nm比色，重複10次。表中糖含量為雌蕊經水洗脫下來的糖重量而非雌蕊實際糖含量。
本發明所提供的提高小麥×玉米雜交授粉成功率的溫水浸泡柱頭法，不僅限於上述實施例，凡在本發明基礎上所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。