一種選育高產wf16616的寄生彎頸黴突變株的方法
2023-06-02 12:03:21 1
專利名稱：一種選育高產wf16616的寄生彎頸黴突變株的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及一種選育高產WF16616的寄生彎頸黴突變株的方法。
背景技術：
WF16616 (FR190293)是 1998 年從真菌寄生彎頸黴(Tolypocladium parasiticumN0.16616)的發酵培養液中分離得到的一種脂肽類物質，其分子式為C51H82N8O21S,經過結構修飾改造可以得到一種新型棘白菌素類抗真菌藥物米卡芬淨(Micafungin, MFG, FK-463)。WF16616(FR190293)及 FK463 結構式如下:
權利要求
1.種選育生產WF16616的寄生彎頸黴突變菌株的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 1)將野生型寄生彎頸黴(Tolypocladiumparasiticum)的單孢子懸浮液進行紫外誘變，即將單孢子懸浮液用紫外光照射，然後避光塗布在固體平板上倒置培養至長出菌落，隨機挑取單個菌落進行發酵，檢測發酵產物中WF16616的含量，從中篩選出產量較高的突變株; 2)將步驟I)得到的WF16616高產突變株的單孢子懸浮液進行NTG(二硝基胍)誘變，即在單孢子懸浮液中加入NTG反應，然後塗布在固體平板上倒置培養至長出菌落，挑取菌落顏色形態變化較大的菌落進行發酵，檢測發酵產物中WF16616的含量，篩選出產量較高的突變株； 3)將步驟2)得到的WF16616高產突變株的單孢子懸浮液進行紫外線和NaCl複合篩選，即將單孢子懸浮液用紫外光照射，然後避光塗布到含有NaCl的固體平板上倒置培養至長出菌落，選取菌落直徑中等的菌落進行發酵，檢測發酵產物中WF16616的含量，篩選出產量較高的突變株； 4)將步驟3)得到的WF16616高產突變株的單孢子懸浮液進行紫外線和發酵產物WF16616複合篩選，即將單孢子懸浮液用紫外光照射，然後避光塗布到含有發酵產物WF16616的固體平板上倒置培養至長出菌落，隨機挑取單個菌落進行發酵，檢測發酵產物中WF16616的含量，從中篩選出產量較高的突變株。
2.權利要求1所述的方法， 其特徵在於，步驟I)所述白色野生型寄生彎頸黴是ATCC52203。
3.權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述紫外誘變的紫外線處理時間為90s 210s。
4.權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟2)所述的NTG加入到單孢子懸浮液後反應終濃度為lmg/ml。
5.權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟2)所述的NTG加入到單孢子懸浮液後反應時間為20 80min。
6.權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟2)所述菌落顏色形態變化較大的菌落是緊密型，純白、棕紅或者綠色的突變株菌落。
7.權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟3)所述的平板上NaCl的濃度為3 7g/L，步驟3)所述的菌落直徑中等的菌落的菌落直徑為3 4mm。
8.權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟4)所述的平板上發酵產物WF16616的濃度為I 5 μ g/mlo
9.權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟3)、4)中，紫外線處理時間為90s 210s。
10.權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟1)-4)中所述單個菌落在搖瓶發酵前先進行抑菌圈實驗，即挑取菌落，劃線於固體平板上，待其長出菌落後，將菌落連同平板一起取出，然後將其轉移到含有白色念珠菌的檢測平板上培養直至檢測平板呈不透明的白色，選擇抑菌圈較大的突變株轉接斜面，進一步搖瓶復篩。
全文摘要
本發明公開了一種選育生產WF16616的寄生彎頸黴突變菌株的方法，包括1)將野生型寄生彎頸黴(Tolypocladium parasiticum)單孢子懸浮液紫外誘變，避光塗布平板，挑取高產菌落；2)將步驟1)所得突變株單孢子懸浮液NTG(二硝基胍)誘變，塗布固體平板，從菌落顏色形態變化較大的菌落挑取高產菌落；3)將步驟2)所得突變株的單孢子懸浮液紫外線和NaCl複合篩選，避光塗布含NaCl的平板，從直徑中等的菌落中挑取高產菌落；4)將步驟3)所得突變株的單孢子懸浮液紫外線和WF16616複合篩選，避光塗布含WF16616的平板，挑取高產菌落。本發明的方法具有突變和篩選的方向性以及選擇的高效性，所得突變株的菌落顏色由野生型的白色變為綠色，發酵產物WF16616產量高，效價高達550-600mg/L，具有工業化價值。
文檔編號C12N1/20GK103087937SQ20111034182
公開日2013年5月8日 申請日期2011年11月2日 優先權日2011年11月2日
發明者胡海峰, 王利軍, 閆濤玲, 朱寶泉 申請人:上海醫藥工業研究院, 中國醫藥工業研究總院