一種檢測基因組目的區域結構變異的方法
2023-06-02 08:44:46
專利名稱：一種檢測基因組目的區域結構變異的方法
技術領域：
本發明涉及生物基因領域，尤其涉及一種檢測基因組目的區域結構變異的方法。
背景技術：
基因組結構變異最早被定義為大於1Kb的基因組插入、缺失、倒置、轉位等。隨著對人類基因組測序的越來越常規化，基因組結構變異(structural variation, SV)和拷貝數目多樣性(copy number variation CNV)的定義也被拓寬了(如，拓寬到> 50bp)。傳統檢測基因組結構變異的方法主要有兩類一類是基於微陣列晶片雜交為基礎的技術，如比較基因組雜交技術(aCGH)、單核苷酸多態性晶片技術(SNP microarrays) 0該法的原理是將兩個不同的樣本(對照樣本和實驗樣本)分別用不同的螢光標記後，與微陣列晶片進行雜交。通過產生的螢光信號比值來推斷兩個樣本基因組結構的差異。例如，只檢測到一個樣本信號，那麼就可以很明顯的推斷在對照樣本中插入相對於待測樣本就是缺失。但利用該方法只能檢測插入、缺失兩種情況，而對於平衡性結構變異(如倒位、轉位等)的檢測不適用，而且不能具體定位到基因組上精確地位置。另外，對照樣本的選擇對該方法結果的影響也非常大，如果對照樣本本身就存在著相應的變異那就不能檢測出來。另一類是基於高通量測序的計算機分析方法。如配對雙末端測序分析方法 (paired-end sequencing)，測序深度分析方法(read cbpth)、讀長拆分比對方法(split read)，以拼接為基礎的檢測方法(assembly)等。這些方法都是基於高通量測序後，利用相應的計算機算法對數據進行分析。雖然檢測基因組結構變異的方法有很多，這些方法都是以整個基因組為對象進行研究的。而只針對特定感興趣基因組區域的結構變異進檢測的方法目前還不存在。另外基因組結構變異在人類基因組上並不是均勻分布的，而是具有一定的集中性，如HLA (Human Leukocyte Antigen)區域的多態性就在人類基因組多態性中佔有很大比例，因此研究一種可以只針對感興趣的基因組區域進行結構變異檢測的方法具有重要意義。
發明內容
本發明提供一種可以只針對感興趣的基因組區域進行結構變異檢測的方法。—種檢測基因組目的區域結構變異的方法，其特徵在於，所述檢測方法包括以下步驟(1)提取目標基因組的DNA ；(2)將步驟(1)中的基因組DNA片段化至預期尺寸；(3)將步驟O)中片段化後的DNA根據所選取的不同高通量測序方法構建配對雙末端文庫；(4)將步驟C3)構建好的配對雙末端文庫與預先訂製的目的區域的寡核苷酸探針探針晶片雜交，得到富集的目的區域配對雙末端文庫；
(5)將步驟中富集的目的區域配對雙末端文庫進行高通量測序。(6)將步驟(5)的高通量測序結果進行生物信息學分析，預測目的區域的基因組結構變異情況。本發明巧妙地將雙末端文庫構建技術、晶片雜交技術及高通量測序技術充分結合了在一起，從而可以較高靈敏度、高解析度地對任何感興趣的目的區域的結構變異進行檢測。作為本發明檢測基因組目的區域結構變異的方法的優選實施方式，步驟O)中片段化後的DNA片段大小根據所需要的檢測結構變異的精度而定。作為本發明檢測基因組目的區域結構變異的方法的優選實施方式，步驟(3)構建配對雙末端文庫的構建方法由所選取的不同高通量測序方法而定。例如，如果所選取的高通量測序方法為Roche4M測序方法，則按照Roche4M提供的方法構建配對雙末端文庫；如果所選取的高通量測序方法為Illumina測序方法，則按照Illumina提供的相關方法構建配對雙末端文庫。配對雙末端測序分析方法(paired-end sequencing)檢測結構變異的原理是首先構建一個一定跨度範圍的配對雙末端文庫，然後進行高通量測序，將測序得到的配對雙末端序列(paired-end read)利用生物信息學分析方法與參考序列 (reference)進行比對，當配對雙末端序列在參考序列上比對的結果與預期不一致時，則可以推測該位點存在結構變異，並可以根據比對的距離和方向判斷出結構變異的類型。序列捕獲技術(Seq-Cap技術)是通過針對目的區域設計一系列的寡核苷酸探針與全基因組DNA雜交對特定基因組區域進行富集的一種技術。這種策略一方面可以大大降低DNA測序成本，另一方面可以節省研究者的精力和時間從而只專注於感興趣的目的區域。本發明檢測基因組目的區域結構變異的方法(如圖1所示)通過將以上兩項技術巧妙地結合在一起後進行高通量測序，從而實現對感興趣的基因組區域的結構變異的檢測。
圖1為本發明檢測基因組目的區域結構變異的方法的流程圖；圖2為本發明實施例1中，檢測基因組目的區域結構變異的流程圖；圖3為本發明實施例1用DNA7500chip檢測雜交後文庫片段大小的檢測結果圖；圖4為本發明實施例1通過對妨4測序結果對檢測到的一個缺失位點進行PCR驗證的電泳結果圖。
具體實施例方式為使本發明更加容易理解，下面將進一步闡述本發明的具體實施例。實施例1對人類HLA區域基因組結構多態性的檢測(參見圖2)1.從培養的HapMap計劃北京漢族B淋巴細胞(GM18529)中提取基因組DNA。2.按 GS FLX Titanium 3Kb Span Paired End Library Preparation Method Manual構建3Kb基因組配對雙末端文庫
(1)將基因組DNA用hydroshear (SC10, Cycle20)進行片段化，並用膠回收的方法回收3Kb的片段O) DNA片段末端修復。反應體系如下
權利要求
1. 一種檢測基因組目的區域結構變異的方法，其特徵在於，所述檢測方法包括以下步驟(1)提取目標基因組的DNA;(2)將步驟(1)中的基因組DNA片段化至預期尺寸；(3)將步驟O)中片段化後的DNA根據所選取的不同高通量測序方法構建配對雙末端文庫；(4)將步驟C3)構建好的配對雙末端文庫與預先訂製的目的區域的寡核苷酸探針晶片雜交，得到富集的目的區域配對雙末端文庫；(5)將步驟中富集的目的區域配對雙末端文庫進行高通量測序。(6)將步驟(5)的高通量測序結果進行生物信息學分析，預測目的區域的基因組結構變異情況。
全文摘要
本發明提供了一種檢測基因組目的區域結構變異的方法。本發明巧妙地將雙末端文庫構建技術、晶片雜交技術及高通量測序技術充分結合了在一起，從而可以較高靈敏度、高解析度地對任何感興趣的目的區域的結構變異進行檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102286632SQ20111027223
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月14日 優先權日2011年9月14日
發明者付永貴, 周思思, 徐安龍, 李 傑, 賀玲瑜 申請人:中山大學