一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重pcr檢測引物組、試劑盒及方法

2023-06-02 06:47:41

專利名稱：一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重pcr檢測引物組、試劑盒及方法
技術領域：
本發明屬於生物檢測領域，具體涉及一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測引物組、試劑盒及方法。
背景技術：
鱧科魚類(Channidae)是我國重要的淡水經 濟魚類，在我國分布廣泛，其肉質細嫩，味道鮮美，具有較高的營養價值，其中斑鱧(Channa maculata)和烏鱧(Channa argus)和以斑鱧為母本，烏鱧為父本雜交獲得雜交鱧(Channa maculata早X C. argus )均是我國重要的養殖品種，也是我國外貿出口的重要淡水經濟魚類。隨著我國池塘鱧科魚類高密度養殖的發展，養殖鱧科魚類病害的問題越來越嚴重，導致鱧科魚類發病病原包括嗜水氣單胞菌、諾卡氏菌、舒伯特氣單胞菌等。鱧內臟類結節病是近年來新暴發的鱧科魚類細菌性病，該病的特點是病魚體表無明顯變化，肝、脾、腎等內臟組織出現白色類結節症狀，死亡率可達45%以上，通過分離鑑定確定該病的致病菌為舒伯特氣單胞菌。自2009年首次報導以來，鱧內臟類結節病在全國範圍內均有發生，近幾年該病導致湖北省養殖烏鱧、廣東省養殖斑鱧和雜交鱧大面積死亡，造成嚴重的經濟損失。由於該病與鱧科魚類另一主要疾病諾卡氏菌引起的結節病症狀相似，養殖過程中容易誤診，錯過最佳治療時機。因此，研發一種能快速、準確地檢測致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的方法對於實驗室進一步研究該菌及其致病機理具有極其重要的意義。

發明內容
針對現有技術所存在的問題，本發明的一個目的在於提供一組能快速、準確地對致病性鱧源舒伯特氣單胞菌進行檢測的雙重PCR檢測引物組。本發明的另一個目的在於提供一種能快速、準確地對致病性鱧源舒伯特氣單胞菌進行檢測的雙重PCR檢測試劑盒。本發明的另一個目的在於提供一種能快速、準確地對致病性鱧源舒伯特氣單胞菌進行檢測的雙重PCR檢測方法。本發明所採用的技術方案為
一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測引物組，包括檢測促旋酶的B亞單位基因(gyrB)的引物對和檢測溶血素基因(hlyA)的引物對，序列分別如下gyrB引物對
上遊引物TCAACTCCGCTGTCTCTAACCTG (SEQ ID NO. I),
下遊引物GCACCCTTACGGCAAGTCATC (SEQ ID NO. 2)； hlyA引物對
上遊引物CAGGCTTCCAGCACTGAATACT (SEQ ID NO. 3),
下遊引物CCAGTCCCACCACTTCACCT (SEQ ID NO. 4)。
一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測試劑盒，包括上述的檢測引物組、10 XPCR buffer、dNTP、MgCl2、Taq DNA聚合酶、陽性質控品、陰性質控品。所述陽性質控品為含有gyrB基因序列(GenBank登錄號JQ319030)的T載體克隆和含有hlyA基 因序列(GenBank登錄號JX996182)的T載體克隆，陰性質控品為無菌ddH20。一種檢測致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR方法，包括以下步驟
1)從待檢鱧的組織器官分離細菌；
2)以分離菌株為模板，使用分別根據舒伯特氣單胞菌的促旋酶的B亞單位基因(gyrB)、溶血素基因(hlyA)基因序列設計合成的兩對引物，在同一反應體系中進行雙重PCR擴增，得到擴增產物，其中引物序列如下
gyrB引物對
上遊引物TCAACTCCGCTGTCTCTAACCTG (SEQ ID NO. I),
下遊引物GCACCCTTACGGCAAGTCATC (SEQ ID NO. 2)； hlyA引物對
上遊引物CAGGCTTCCAGCACTGAATACT (SEQ ID NO. 3),
下遊引物CCAGTCCCACCACTTCACCT (SEQ ID NO. 4)；
3)擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，然後根據電泳結果進行判定，其中gyrB擴增產物長601 bp，hlyA 擴增產物長 375 bp。 所述雙重PCR反應體系為待檢囷液I旲板或陽性質控品或陰性質控品2 μ I,10Xbuffer 2. 5 μ I, Taq DNA 聚合酶(5 U/ μ L) O. 125 μ L, MgCl2 (250 mmol/L) I. 5μ L,gyrB 上下遊引物(20ymol/L)各 O. 4μ L，hlyA 上下遊引物(20 μ mol/L)各 0· 5 μ L，dNTP(2· 5mmol/L) 2μ L，ddH20 補齊至 25 μ I。所述雙重PCR 反應條件為95°C 5min ；94°C 30s, 55-58°C 30s, 72°C 30s，反應30-35 次循環；72°C IOmin0優選的，退火溫度為56°C。優選的，反應循環數為30次。本發明是以促旋酶的B亞單位基因(gyrB)和溶血素基因(hlyA)為靶基因設計了兩對針對致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的高度特異性引物。gyrB基因是單拷貝的看家基因，平均鹼基替換率為每100萬年變化O. 7°/Γθ. 8%，比16S rDNA的每5000萬年變化1%的速度要快，而且不發生水平轉移，並普遍存在於各種細菌中。本發明人通過前期實驗驗證gyrB基因比16S rRNA在區分和鑑定舒伯特氣單胞菌及其近緣種上具有更顯著的優勢。hlyA基因最早是Aoki等(1991)從罐裝牛奶中分離的嗜水氣單胞菌ATCC7966菌株中克隆出來的。該基因在嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌等氣單胞菌屬菌株中均有分布。舒伯特氣單胞菌在毒力基因方面的研究還很少，目前僅有Chen等(2012)從感染斑鱧的舒伯特氣單胞菌中克隆了 hlyA基因；本發明人所在實驗室從患病鱧中分離的舒伯特氣單胞菌中克隆了 hlyA基因(Genbank登陸號JX996182)。研究發現氣單胞菌屬模式菌株嗜水氣單胞菌基因表達的溶血素對宿主的破壞力非常強，所以對於毒力嗜水氣單胞菌的早期預測及防治變得尤為重要。Micheal等(1999)對臨床和環境(其中包括魚源)中的A. hydrophila進行研究，96%菌株呈hlyA陽性，認為所有的毒力嗜水氣單胞菌株是hlyA陽性。
本發明經多次篩選後，以鱧源舒伯特氣單胞菌的gyrB基因和hlyA基因為靶基因，設計了兩組高特異性的檢測引物，並由其建立起的雙重PCR檢測試劑盒、檢測方法敏感性強、特異性高，可以快速、準確地檢測致病性鱧源舒伯特氣單胞菌。同時避免了反覆培養、冗長的一系列生化反應，節約時間、勞動能力和成本。


圖I為特異性試驗電泳圖譜(M為DNA Marker, 1-12依次為WL-2，溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、無乳鏈球菌、諾卡氏菌、遲緩愛德華菌、螢光假單胞菌、柱狀黃桿菌、哈氏弧菌、類志賀鄰單胞菌、大腸桿菌和陰性對照);
圖2為敏感性試驗電泳圖譜(M為DNA Marker, 1-7分別為WL-2的模版菌落個數分別為 3X ο。，3X IoiJxio2Jxio3Jxio4Jxio5Jxio6,8 為陰性對照)；
圖3為病料檢測試驗電泳圖譜(1-21依次為21個待檢測菌株，22為陽性質控品，23為陰性質控品)。
具體實施例方式下面結合具體實施案例進一步描述本發明，但並不局限於此，凡依照本發明公開內容所作出的本領域等同替換，均屬於本發明的保護範圍。引物的設計根據GenBank中WL-2的gyrB基因序列(GenBank登錄號JQ319030)和hIyA基因序列(GenBank登錄號JX996182 )，設計和篩選出兩對特異性片段引物。各引物序列和預期擴增片段長度如下
權利要求
1.一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測引物組，包括檢測gyrB基因的引物對和檢測hlyA基因的引物對，序列分別如下 gyrB引物對 上遊引物TCAACTCCGCTGTCTCTAACCTG (SEQ ID NO. I), 下遊引物GCACCCTTACGGCAAGTCATC (SEQ ID NO. 2)； hlyA引物對 上遊引物CAGGCTTCCAGCACTGAATACT (SEQ ID NO. 3), 下遊引物CCAGTCCCACCACTTCACCT (SEQ ID NO. 4)。
2.一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測試劑盒，其特徵在於，包括權利要求I所述的檢測引物組。
3.根據權利要求I所述的檢測試劑盒，其特徵在於，包括權利要求I所述的檢測引物組、10 XPCR buffer、dNTP、MgCl2、Taq DNA聚合酶、陽性質控品、陰性質控品。
4.根據權利要求3所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述陽性質控品為含有gyrB基因序列(GenBank登錄號JQ319030)的T載體克隆和含有hlyA基因序列(GenBank登錄號JX996182)的T載體克隆；陰性質控品為無菌ddH20。
5.一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測方法，包括以下步驟 1)從待檢鱧的組織器官分離細菌； 2)以分離菌株為模板，使用分別根據舒伯特氣單胞菌的促旋酶的B亞單位基因(gyrB)、溶血素基因(hlyA)基因序列設計合成的兩對引物，在同一反應體系中進行雙重PCR擴增，得到擴增產物，其中引物序列如下 gyrB引物對 上遊引物TCAACTCCGCTGTCTCTAACCTG (SEQ ID NO. I), 下遊引物GCACCCTTACGGCAAGTCATC (SEQ ID NO. 2)； hlyA引物對 上遊引物CAGGCTTCCAGCACTGAATACT (SEQ ID NO. 3), 下遊引物CCAGTCCCACCACTTCACCT (SEQ ID NO. 4)； 3)擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，然後根據電泳結果進行判定，其中gyrB擴增產物長601 bp，hlyA 擴增產物長 375 bp。
6.根據權利要求5所述的致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測方法，其特徵在於所述雙重PCR反應體系為待檢菌液模板或陽性質控品或陰性質控品2 μ I, IOXbuffer2.5 μ I, Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L) O. 125 μ L，MgCl2 (250 mmol/L) I. 5μ L, gyrB 上下遊引物(20ymol/L)各 O. 4μ L，hlyA 上下遊引物(20 μ mol/L)各 0· 5 μ L，dNTP (2. 5mmol/L)2μ L, ddH20 補齊至 25 μ I0
7.根據權利要求5所述的致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測方法，其特徵在於所述雙重 PCR 反應條件為95°C 5min ；94°C 30s，55_58°C 30s, 72°C 30s，反應 30-35次循環；72°C IOmin。
8.根據權利要求7所述的致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測方法，其特徵在於退火溫度為56°C。
9.根據權利要求7所述的致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測方法，其特徵在於反應循環數為 30次 。
全文摘要
本發明公開了一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測引物組、試劑盒及方法，通過設計的兩對特異性引物和優選的反應體系、反應條件，可快速、準確檢測致病性鱧源舒伯特氣單胞菌，為實驗室進一步研究該菌及其致病機理奠定了基礎。本發明突出的優點是建立的多重PCR反應，敏感性強、特異性高，可以快速、準確地檢測出樣品中的致病性鱧源舒伯特氣單胞菌，同時避免了反覆培養、冗長的一系列生化反應，節約時間、勞動能力和成本。
文檔編號C12N15/11GK102965438SQ201210467910
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月16日 優先權日2012年11月16日
發明者劉春 , 李凱彬, 王慶, 吳淑勤, 王芳, 常藕琴, 梁慧麗, 曾偉偉, 王英英 申請人:中國水產科學研究院珠江水產研究所