一種淫羊藿苷化學對照品的分離製備方法

2023-06-29 21:41:31 4

專利名稱：一種淫羊藿苷化學對照品的分離製備方法
技術領域：
本發明涉及一種從淫羊藿提取物中分離獲得純度大於98%的淫羊藿苷化學對照 品的製備方法，主要包括初步柱分離或醇沉除雜脫色以及快速的高效液相製備方法規模化 製備。
背景技術：
淫羊藿(Herba Epimedii)是我國使用最為悠久的中藥之一，具有補腎陽、強筋骨、 祛風溼的功效。現代研究表明，淫羊藿具有抗骨質疏鬆、增強性功能、增加心腦血管血流量、 促進造血功能、增強免疫、抗衰老、抗炎、抗腫瘤等多方面藥理作用。淫羊藿苷是淫羊藿的主 要活性成分，也是我國2005版國家藥典中淫羊藿藥材的含量測定成分，並規定其在藥材中 的含量應達0.5%以上。淫羊藿苷的結構式如下
OH OH 淫羊藿苷的分離製備方法主要有胡云峰等(中國專利CN200510061251. 1， 2007年公開)採用浸提、脫雜、萃取、樹脂吸附、乾燥五大工序獲取不同含量的淫羊藿苷 (5% -50% );田景振等(山東中醫藥大學學報.2004，28(6) :456-458)用大孔吸附樹脂 法可獲得60. 30%含量的淫羊藿苷；梁冉等(西北農業學報2005， 14(2) :141 14)採用 30%乙醇超聲波輔助提取、聚醯胺柱及乙酸乙酯萃取的工藝可獲得60%含量的淫羊藿苷， 進一步重結晶可獲得90. 94%含量的淫羊藿苷。文獻(Liu Renmin， et al. Journal of Chromatography A， 1064， 2005， 53-57)還報導了高速逆流色譜法製備98%含量的淫羊藿 苷，但僅僅是實驗室規模且使用特殊的設備和昂貴有毒的流動相。目前，高效液相製備色譜 用於大規模(克級以上)製備98%含量的淫羊藿苷的工作還未見報導。

發明內容
本發明在整合各種淫羊藿苷製備方法基礎上，通過樣品預處理研究、高效液相色 譜填料的選擇、快速色譜條件的開發、進樣體積及濃度的優化，以及檢測波長的選擇等多方 面研究，發明了一種低成本、快速的高效液相製備色譜方法，製備規模可達20g/月並且保證純度(>98%)及產品色澤。本發明的目的是開發出一種可以獲得十克級規模並且純度
在98%以上的淫羊藿苷化學對照品的製備新方法。 為實現上述目的，本發明採用的技術方案 —種淫羊藿苷化學對照品的分離製備方法，以質量含量^ 20%，優選50%以上淫 羊藿苷提取物為原料，經初步柱分離或醇沉除雜脫色，以製備型高效液相色譜為分離手段， 以一定比例的含乙腈水溶液為洗脫體系，獲得月產20g規模且純度大於98%的淫羊藿苷化 學對照品；具體步驟為
1)初步柱分離或醇沉除雜脫色 柱分離除雜脫色淫羊藿苷提取物用水或體積濃度40-80%乙醇水溶液溶解，上 樹脂柱或聚醯胺柱分離，以乙醇_水溶液梯度洗脫，其中乙醇的體積濃度從0% _70%變化， 收集體積濃度50-70%乙醇洗脫物，濃縮乾燥得黃色粉末； 或醇沉除雜脫色將淫羊藿苷提取物用40-80%乙醇水溶液溶解，離心得沉澱物、 或靜置^ 4小時過濾沉澱物，沉澱物烘乾後可得黃色粉末；
2)高效液相製備 黃色粉末用體積濃度40-80%的乙醇水溶液溶解，配置成濃度為50 150mg/ml的 供試品溶液，經0. 45 ii m微孔濾膜過濾；採用柱長為10-50cm、直徑為l-10cm的高效液相制 備色譜柱進行分離，六通閥或泵進樣，進樣體積為l-50ml，以體積濃度為15-55%的乙腈水 溶液為洗脫體系，流速控制在10-400ml/min，在線紫外檢測，收集純度大於98%的淫羊藿 苷流份； 3)淫羊藿苷化學對照品的獲得 上述流份直接濃縮至幹、或用甲醇或乙醇重結晶即可得到純度大於98%的黃白色 淫羊藿苷對照品。 上述方法中，初步柱分離用樹脂以非極性大孔吸附樹脂較好。高效液相製備過程 採用的流動相中乙腈的體積濃度為20-30% ;高效液相製備柱的填料為C6、 C8或C18鍵合 相填料，其粒徑為5 20 ii m，紫外檢測波長優選270nm、318nm或349nm，具體檢測波長根據 樣品中淫羊藿苷信號的超載情況而定。 以本發明從淫羊藿提取物中分離淫羊藿苷化學對照品具有如下優點和進步
1.本發明以製備型高效液相為分離手段，使淫羊藿苷得到高效分離，可以獲得純 度在98%以上的淫羊藿苷化學對照品。 2.本發明發展的高效液相製備方法為快速製備方法，單針分離時間在10-20分鐘 之間，非常適合大批量化學對照品的製備；同時加上製備溶劑的回收再利用，可實現批量制 備的低成本。 3.本發明採用紫外檢測器在線檢測，淫羊藿苷的分離情況可以直接檢測，可直接 選擇性收集高純度流份，從而實現純度保證下的高回收率。 4.本發明在製備高效液相之前增加了除雜脫色步驟，一方面可有效延長色譜柱的 使用壽命，另一方面保證了產品具有好的色澤度。 總之，本發明工藝步驟簡單、周期短、純度高、色澤好，並且可大規模生產。


圖1為重結晶前淫羊藿苷的HPLC分析圖譜(270nm)，其積分報告如下
NameRetentionTimeArea% Area
11. 661150900. 05
22. 52219090. 01
32. 722103340. 03
43. 39087830. 03
54. 709533380. 17
68. 354110700. 04
79. 097597910. 19
8淫羊藿苷11. 2613083234699. 48 圖2為重結晶後淫羊藿苷的HPLC分析圖譜(270nm)，其積分報告如下
NameRetentionTimeArea% Area
11. 666121130. 03
22. 635772820. 21
33. 39649580. 01
44. 38547950. 01
54. 613121920. 03
68. 931664480. 18
7淫羊藿苷11. 1193690802899. 5具體實施例方式
現結合實施例和附圖對本發明做進一步詳細說明，實施例僅限於說明本發明，而非對本發明的限定。
實施例1 : 本實施例中，以50%的淫羊藿苷提取物為原料，以10iimC18鍵合相填料為吸附 劑，以含有乙腈-水(30 : 70，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下
1)脫色 提取物用70%乙醇水溶液溶解，靜置12小時，過濾，沉澱物烘乾後得黃色粉末。
2)高效液相製備 上述黃色粉末用70 %乙醇水溶液溶解，配置成濃度為50mg/ml的供試品溶液，經 0. 45 ii m微孔濾膜過濾；製備型高效液相柱填料品牌為ChromatorexC18鍵合相填料，粒徑 為10 ii m ;柱長19cm，直徑7. 5cm ;六通閥進樣，進樣體積為10ml ;以30%乙腈-水溶液為洗 脫體系，流速控制在160ml/min，在線紫外檢測，收集含有淫羊藿苷的高純度流份；
3)淫羊藿苷化學對照品的獲得 上述流份直接濃縮至幹即可得到純度為99.48%的淫羊藿苷對照品(黃白色粉 末)(圖l);黃白色粉末用甲醇重結晶得到純度為99.52%的淫羊藿苷對照品(黃白色結 晶)(圖2)。
實施例2 本實施例中，以50%淫羊藿苷提取物為原料，以5iim的C18鍵合相填料為吸附劑， 以含有乙腈-水(25 : 75，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下
1)脫色 提取物用70%乙醇水溶液溶解，離心，過濾，沉澱物烘乾後得黃色粉末。
2)高效液相製備 上述黃色粉末用60 %乙醇水溶液溶解，配置成濃度為80mg/ml的供試品溶液，經 0. 45 ii m微孔濾膜過濾；製備型高效液相柱填料品牌為McirosorbC18鍵合相填料，粒徑為 5 ii m ;柱長17cm，直徑5cm ;六通閥進樣，進樣體積為2ml ;以25 %乙腈-水溶液為洗脫體 系，流速控制在60ml/min，在線紫外檢測，優選檢測波長270nm，收集含有淫羊藿苷的高純 流份； 3)淫羊藿苷化學對照品的獲得 上述流份直接濃縮至幹即可得到純度為98.84%的淫羊藿苷對照品(黃白色粉 末)；黃白色粉末用甲醇重結晶得到純度為99.45%的淫羊藿苷對照品(黃白色結晶)。
實施例3 : 本實施例中，以20%的淫羊藿苷提取物為原料，以10iim C18鍵合相填料為吸附 劑，以含有乙腈-水(30 : 70，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下
1)脫色 提取物用40 %乙醇水溶液溶解，上HPD樹脂柱(I. D. 6 X 68)，乙醇-水梯度洗脫， 收集50%乙醇洗脫物，濃縮乾燥得黃色粉末。
2)高效液相製備 黃色粉末用70%乙醇水溶液溶解，配置成濃度為100mg/ml的供試品溶液，經 0. 45 ii m微孔濾膜過濾；製備型高效液相柱填料品牌為ChromatorexC18鍵合相填料，粒徑 為10 ii m，柱長22cm，直徑7. 5cm ;泵進樣，進樣體積為20ml ;以30%乙腈-水溶液為洗脫體系，流速控制在160ml/min，在線紫外檢測，優選檢測波長318nm或349nm，收集含有淫羊藿 苷的高純流份； 3)淫羊藿苷化學對照品的獲得 上述流份直接濃縮至幹即可得到純度為98. 16%的淫羊藿苷對照品(黃白色粉 末)。黃白色粉末用甲醇重結晶得到純度為99. 10%的淫羊藿苷對照品(黃白色結晶)。
實施例4 本實施例中，以33%的淫羊藿苷提取物為原料，以5 ii m的C18鍵合相填料為吸附 劑，以含有乙腈-水(28 : 72，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下
1)脫色 提取物用60%乙醇水溶液溶解，離心，過濾，沉澱物烘乾後得黃色粉末。
2)高效液相製備 黃色粉末用70%乙醇水溶液溶解，配置成濃度為60mg/ml的供試品溶液，經 0. 45 ii m微孔濾膜過濾；製備型高效液相柱填料品牌為Mcirosorb C18鍵合相填料；粒徑為 5 ii m ;柱長17cm，直徑5cm ;六通閥進樣，進樣體積為5ml ;以28%乙腈-水溶液為洗脫體系， 流速控制在60ml/min，在線紫外檢測，收集含有淫羊藿苷的高純流份；
3)淫羊藿苷化學對照品的獲得 上述流份直接濃縮至幹即可得到純度為98.84%的淫羊藿苷對照品(黃白色粉 末)；黃白色粉末用甲醇重結晶得到純度為99.45%的淫羊藿苷對照品(黃白色結晶)。
權利要求
一種淫羊藿苷化學對照品的分離製備方法，其特徵在於以質量含量≥20％的淫羊藿苷提取物為原料，經初步柱分離或醇沉除雜脫色，以製備型高效液相色譜為分離手段，以一定比例的含乙腈水溶液為洗脫體系，獲得純度大於98％的淫羊藿苷化學對照品；具體步驟為1)初步柱分離或醇沉除雜脫色柱分離除雜脫色淫羊藿苷提取物用水或體積濃度為40-80％的乙醇水溶液溶解，上樹脂柱或聚醯胺柱分離，以乙醇-水溶液梯度洗脫，其中乙醇的體積濃度從0％-70％變化，收集體積濃度為50-70％的乙醇洗脫物，濃縮乾燥得黃色粉末；或醇沉除雜脫色將淫羊藿苷提取物用40-80％乙醇水溶液溶解，離心得沉澱物、或靜置≥4小時過濾得沉澱物，沉澱物烘乾後可得黃色粉末；2)高效液相製備黃色粉末用體積濃度40-80％的乙醇水溶液溶解，配置成濃度為50～150mg/ml的供試品溶液，經0.45μm微孔濾膜過濾；採用柱長為10-50cm、直徑為1-10cm的高效液相製備色譜柱進行分離，六通閥或泵進樣，進樣體積為1-50ml，以體積濃度為15-55％的乙腈水溶液為洗脫體系，流速控制在10-400ml/min，在線紫外檢測，收集純度大於98％的淫羊藿苷流份；3)淫羊藿苷化學對照品的獲得上述流份直接濃縮至幹、或用甲醇或乙醇重結晶即可得到純度大於98％的黃白色淫羊藿苷對照品。
2. 根據權利要求1所述的分離製備方法，其特徵在於柱分離過程採用的樹脂柱為非 極性樹脂柱。
3. 根據權利要求1所述的分離製備方法，其特徵在於高效液相製備過程採用的製備 柱的填料為C6、 C8、或C18鍵合相填料，粒徑為5-20 y m。
4. 根據權利要求1所述的分離製備方法，其特徵在於高效液相製備過程採用的流動 相中乙腈的體積濃度為20-30%。
5. 根據權利要求1所述的分離製備方法，其特徵在於高效液相製備過程採用在線紫 外檢測，其檢測波長優選270nm、318nm或349nm。
6. 根據權利要求1所述的分離製備方法，其特徵在於以質量含量^ 50%淫羊藿苷提 取物為原料。
全文摘要
本發明涉及一種淫羊藿苷化學對照品的分離製備方法。以含量不低於20％的淫羊藿苷提取物為原料，經初步柱分離或醇沉除雜脫色，以製備型高效液相色譜為分離手段，以一定比例的含乙腈水溶液為洗脫體系，提取液直接減壓濃縮至幹即可獲得純度大於98％的淫羊藿苷化學對照品。相比已報導淫羊藿苷的分離製備方法，本發明工藝步驟簡單、周期短、純度高、色澤好，並且可大規模生產。
文檔編號C07H17/00GK101747391SQ20081022988
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月17日 優先權日2008年12月17日
發明者王莉, 肖紅斌, 高明哲 申請人:中國科學院大連化學物理研究所