包含雙呋脒腙的促進多能幹細胞分化成心肌細胞的組合物的製作方法
2023-05-30 06:01:06
專利名稱：包含雙呋脒腙的促進多能幹細胞分化成心肌細胞的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及促進多能幹細胞分化成心肌細胞的組合物，誘導多能幹細胞分化成心肌細胞的方法，以及由多能幹細胞製備心肌細胞的方法。
背景技術：
對於再生醫學的實現，誘導多能幹細胞分化成所需細胞的技術是必不可少的。此夕卜，同樣預期分化自多能幹細胞的細胞對於體外藥物篩選研究和藥物安全評估是有價值 的。尤其，非常需要的是開發用於再生醫學和心臟病藥物評估的誘導多能幹細胞分化成心肌細胞的方法，原因在於目前在日本心臟病是第二位的死因。存在多種藥物，其誘導嚴重的副作用，包括心臟停搏和心律不齊，因此導致增加的對提供同質心肌細胞(其可用於心臟毒性研究)的需要。目前，已有報導，通過將人ES細胞和小鼠飼養細胞、END2細胞共培養來誘導人ES細胞分化為心肌細胞(非專利文獻I)。然而，此方法的分化效率不令人滿意並且它難以獲得純的人心肌細胞，因為所得的人心肌細胞通常被小鼠END2細胞汙染。還有報導，可以通過由ES細胞製備胚胎體並向胚胎體中加入若干細胞因子(成纖維生長因子(bFGF)、骨形態發生蛋白4(BMP4)、血管內皮細胞生長因子(VEGF) ,Dickkopf-I (DKKl)、活化素A)來誘導心肌細胞分化(非專利文獻2和3)。然而，此方法需要大量的細胞因子並且成本太高，同時其分化效率不足。現有技術文獻非專利文獻專矛1J 文獻 I Mummery, C.，等，Differentiation of human embryonic stemcells to cardiomyocytes role of coculture with visceral endoderm-like cells(A胚胎細胞分化成心肌細胞與內臟內胚層樣細胞共培養的作用).Circulation (循環)· 107(21)，2733-40 (2003)。非專利文獻 2 :Yang, L.,等，Human cardiovascular progenitor cells developfrom a KDR+embryonic-stem-cell-derived population (人心血管先祖細胞發育自 KDR+胚胎幹細胞源的種群)· Nature (自然).453 (7194)，524-8 (2008)。非專利文獻3 :Leschik, J.,等，Cardiac commitment of primate embryonic stemcells (靈長類胚胎幹細胞的心臟定向)· Nat Protoc. 3 (9)，1381-7 (2008)。這些文獻通過弓丨用結合於此。發明概述本發明要解決的問題本發明的目的是提供以高效率低成本製備同質心肌細胞的方法。解決問題的方式本發明的發明人對9，600種庫化合物的促進猴ES細胞分化成心肌細胞的活性進行了檢驗。結果，發現與常規的心肌細胞分化促進劑相比，雙呋脒腙(其是一種已知作為抗生素和生長促進劑用於家畜的低分子量化合物)高效促進心肌細胞分化。因而，本發明已經得以實現。本發明提供促進多能幹細胞分化成心肌細胞的組合物，其包含雙呋脒腙(nitrovin)。此外，本發明提供誘導多能幹細胞分化成心肌細胞的方法，該方法包括在包含雙呋脒腙的培養基中培養多能幹細胞。
此外，本發明提供由多能幹細胞製備心肌細胞的方法，該方法包括在包含雙呋脒腙的培養基中培養多能幹細胞。本發明的效果根據本發明，已經可能誘導多能幹細胞分化成心肌細胞而不使用飼養細胞以及之後獲得純的心肌細胞。此外，根據本發明，已經可能高效低成本地誘導心肌細胞分化以製備心肌細胞。本發明尤其適用於評估QT延長，這對於以高通量形式評估藥物安全、大規模製備用於心臟病藥物評估的同質且成熟的人心肌細胞以及生產用於移植以治療心臟疾病的心肌細胞是重要的。附圖
簡述圖I.對促進心肌細胞分化的物質的篩選策略。圖2.篩選系統及對雙呋脒腙的檢測。圖3-1.在猴ES細胞中施用雙呋脒腙(終濃度I μ M，5 μ M，20 μ M)後GFP的表達。圖3-2.在猴ES細胞中雙呋脒腙誘導的GFP螢光強度和心肌細胞搏動集群(beating colonies)數目的增加。橫軸表示雙呋脒腙的濃度。在左圖中，縱軸表示施用雙呋脒腙後的GFP螢光強度，其表示為與對照(二甲亞碸，DMS0)相比的百分比(100%)。在右圖中，縱軸表示搏動集群的數目/孔。圖4-1.施用雙呋脒腙後人ES細胞中的GFP表達(終濃度5 μ M)。圖4-2.人ES細胞中雙呋脒腙(終濃度5 μ Μ)誘導的GFP螢光強度的增加。縱軸表示施用雙呋脒腙後GFP的螢光強度，其表達為與對照(DMSO)相比的百分比(100% )。圖5-1.在猴ES細胞中在施用雙呋脒腙(終濃度5 μ Μ)、細胞因子(bFGF、BMP4、VEGF、DKKI 和活化素 A)(終濃度分別為5ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、150ng/ml 和 3ng/ml)或雙呋脒腙(終濃度5 μ M)與上述細胞因子的組合後GFP的表達。圖5-2.在猴ES細胞中由雙呋脒腙誘導的GFP螢光強度和心肌細胞搏動集群數目的增加。左圖中，縱軸表示在施用雙呋脒腙和/或細胞因子後GFP的螢光強度，其表達為與對照(DMSO)相比的百分比(100%)。右圖中，縱軸表示搏動集群的數目/孔。圖5-3.在猴ES細胞中，由雙呋脒腙誘導的GFP和肌鈣蛋白T表達的增加。縱軸表示施用雙呋脒腙和/或細胞因子後的表達水平，其表達為與對照(DMSO)相比的百分比(100% )。實施方案描述本發明提供促進多能幹細胞分化成心肌細胞的組合物，其包含雙呋脒腙。雙呋脒腙是具有下式(C14H12N6O6)的低分子量化合物[式I]
權利要求
1.一種促進多能幹細胞分化成心肌細胞的組合物，其包含雙呋脒腙。
2.根據權利要求I的組合物，其中所述多能幹細胞是哺乳動物細胞。
3.根據權利要求2的組合物，其中所述多能幹細胞是靈長類細胞。
4.根據權利要求3的組合物，其中所述多能幹細胞是人細胞。
5.誘導多能幹細胞分化成心肌細胞的方法，所述方法包括在包含雙呋脒腙的培養基中培養多能幹細胞。
6.由多能幹細胞製備心肌細胞的方法，所述方法包括在包含雙呋脒腙的培養基中培養多能幹細胞。
7.通過權利要求6的方法製備的心肌細胞。
全文摘要
本發明提供用於促進多能幹細胞分化成心肌細胞的包含雙呋脒腙的組合物，通過使用雙呋脒腙誘導多能幹細胞分化成心肌細胞的方法和通過使用雙呋脒腙製備心肌細胞的方法。
文檔編號C12N5/071GK102648274SQ201080055309
公開日2012年8月22日 申請日期2010年12月9日 優先權日2009年12月9日
發明者上杉志成, 中辻憲夫, 南一成, 尾辻智美 申請人:國立大學法人京都大學