胞磷膽鹼的製備方法

2023-05-30 06:42:56

專利名稱：胞磷膽鹼的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種胞磷膽鹼的製備方法，具體涉及發酵法製備胞磷膽鹼，屬於生物製藥技術領域。
背景技術：
胞磷膽鹼(CDPC)是磷脂類磷脂醯膽鹼的前體物質，是卵磷脂合成必須的輔酶。胞磷膽鹼臨床上廣泛用於腦缺血、腦損傷、阿爾茨海默病、帕金森病和老年性痴呆等疾病的治療。胞磷膽鹼又名胞二磷膽鹼，胞苷二磷酸膽鹼。胞磷膽鹼已知的製備方法有化學合成法、 使用酵母等微生物菌體的酶法、利用基因重組微生物進行轉化的酶法等。這些製備方法中的共同點是作為原料使用了價格昂貴的胞苷一磷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、胞嘧啶等嘧啶系核苷酸及其前體乳清酸、尿嘧啶等，使得胞磷膽鹼的製備成本較高。使用酵母等微生物菌體的酶法製造胞磷膽鹼，是以胞苷酸和磷酸膽鹼作為原料， 利用微生物提供反應所需磷酸膽鹼轉胞苷醯酶(CCT)等一系列酶，一步催化完成胞磷膽鹼的製備。
胞苷酸十葡萄糖十磷酸膽鹼十無機鹽一胞磷膽鹼此過程中的起始物胞苷酸的價格是非常昂貴的，使得製備成本居高不下。CN1074938公開了胞苷二磷酸膽鹼的製備方法，該方法是以微生物提供反應所需胞苷三磷酸合成酶、磷酸膽鹼轉胞苷醯酶(CCT)等一系列酶，一步催化完成胞磷膽鹼的製備。CN1653188公開了胞苷5』- 二磷酸膽鹼的製備方法，該方法採用膽鹼、磷酸膽鹼或它們的鹽以及尿嘧啶在水溶性介質中與生物催化劑接觸，蓄積生成⑶P-膽鹼。CN102199643A 公開了一種胞二磷膽鹼的製備方法，使用單一的基因工程菌的培養物或者其處理物作為酶源，催化包括氯化銨、乳清酸和磷酸膽鹼的底物進行反應，使得反應液中生成和積蓄胞二磷膽鹼，從所述反應液中提取所述胞二磷膽鹼。CN101538598A提供一種胞二磷膽鹼的製備方法，其特徵是以氯化膽鹼、磷酸根離子和胞苷一磷酸或其前體為底物，以葡萄糖、果糖、蔗糖或麥芽糖為能量供體，加入小分子化學效應物質，利用有透性的酵母細胞全細胞催化製備胞二磷膽鹼；其中，所述的胞苷一磷酸前體為乳清酸或胞苷；所述的小分子化學效應物質為鎂離子、鉀離子中的任意一種或兩種，與甘露醇、半胱氨酸和精胺中的任意一種或幾種的組合物。以上方法的起始原料乳清酸或尿嘧啶或胞苷酸等價格都比較昂貴，成本也較高。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種以嘧啶從頭合成為基礎反應的微生物發酵法製備胞磷膽鹼的方法。發明概述
本發明的方法不使用嘧啶系核苷酸或其前體如乳清酸、尿嘧啶等價格昂貴的原料，而使用工業上易於得到的、廉價的、可提供膽鹼的原料(如氯化膽鹼、磷酸膽鹼等)經過微生物發酵，製備胞磷膽鹼。本發明的方法以嘧啶從頭合成為基礎反應，由簡單的起始原料碳、氮源開始，利用一些特定微生物體內合成代謝途徑，合成磷酸核糖、胺基酸以及一碳單位與二氧化碳等簡單物質，繼而合成製備胞磷膽鹼的前體胞嘧啶系核苷酸，在含有可提供膽鹼的原料如磷酸膽鹼或氯化膽鹼等的培養液中，由微生物提供的磷酸膽鹼轉胞苷醯酶的參與下累積生成胞磷膽鹼。嘧啶核苷酸的從頭合成途徑的原料是天冬氨酸、穀氨醯胺、CO2等，這些胺基酸來自生物體內的胺基酸合成代謝。反應過程中的關鍵酶在不同生物體內有所不同，在細菌中， 嘧啶核苷酸的生物合成，受到終產物反饋控制的點有三個合成途徑的第一個調節酶是氨基甲醯磷酸合成酶，它受尿嘧啶核苷酸(UMP)的反饋抑制；另兩個調節酶是天冬氨酸氨甲醯轉移酶和胞苷三磷酸(CTP)合成酶，它們都受胞苷三磷酸(CTP)的反饋抑制。前者被抑制將影響尿苷酸和胞苷酸的合成，後者被抑制只影響胞苷酸的合成。很多微生物發酵能夠產生胞嘧啶系核苷酸，如果解除UMP、CTP的反饋抑制作用， 截止嘧啶合成途徑中的起始胺基酸天冬氨酸的分支代謝途徑，並選擇產胞嘧啶系核苷酸活躍時期的菌體或培養物作為產胞嘧啶系核苷酸的酶源，能夠較快速的代謝生成胞嘧啶系核苷酸，在該微生物或其它微生物提供的磷酸膽鹼轉胞苷醯酶的參與下，累積生成胞磷膽鹼。 從而避免使用價格昂貴的嘧啶系核苷酸為前體物，進一步降低製備成本。本發明以此為出發點，選擇了適宜該方法的菌株，通過微生物發酵製備胞磷膽鹼。發明詳述本發明的技術方案如下一種胞磷膽鹼的製備方法，以嘧啶從頭合成為基礎反應，該方法包括在有微生物 A的培養液存在的情況下，或者還有微生物B的培養液或處理物存在的情況下，將膽鹼原料在反應溫度20 38°C反應10 72小時，控制pH 5 7. 5，累積生成胞磷膽鹼。所述的膽鹼原料選自膽鹼、氯化膽鹼、磷酸膽鹼、碘化膽鹼或溴化膽鹼。所述微生物A選自屬於棒桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬 (Brevibacterium)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Rseudomonas)、釀酒酵母屬 (Saccharomyces cerevisiae)中的一個或2個以上屬的菌株。所用菌株具備以下特徵(I)能夠代謝產生胞嘧啶系核苷產物；(2)具有嘧啶繫結構類似物抗性，能夠解除UMP、CTP產物的反饋抑制作用；(3)代謝酶系統中的胞苷脫氨酶缺失，阻斷所合成的胞嘧啶系核苷酸脫氨恢復轉化為尿嘧啶系核苷酸；(4)能夠截止高絲氨酸脫氫酶作用途徑，積累嘧啶從頭合成的前體物天冬氨酸；(5)具有磷酸膽鹼轉胞苷醯酶活性，能夠將所合成的胞苷酸系產物如胞苷酸、胞苷三磷酸等轉化為胞磷膽鹼，該酶可以來自天然微生物或者是轉導子編碼磷酸膽鹼轉胞苷醯酶的DNA而得到的轉化體。所述微生物B選自①啤酒發酵的工業啤酒酵母菌體，或者②含有磷酸膽鹼轉胞苷醯酶的大腸桿菌、穀氨酸棒桿菌之一，或者是③含有磷酸膽鹼轉胞苷醯酶的大腸桿菌、穀氨
5酸棒桿菌的轉化體、培養液或提取物。根據本發明優選的，微生物A為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)QL28001 保藏號CGMCC No. 5849，穀氨酸棒狀桿菌保藏號ATCC No. 13032，洋蔥假單胞菌保藏號 ATCCNo. 25416，檸檬節桿菌保藏號ATCC No. 11624，釀酒酵母保藏號ATCC No. 40075之一。本發明最優選的微生物A為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) QL28001，是本發明首次由菌種保藏號為ATCC No. 6051的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)選育而來，於 2012年3月6日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所)保藏，保藏號為CGMCC No. 5849。本發明所述的由菌種保藏號為ATCC No. 6051的枯草芽孢桿菌選育得到的枯草芽孢桿菌QL28001保藏號CGMCC No. 5849含有合成胞嘧啶系核苷酸的所有酶系，並能解除 UMP、CTP的反饋抑制作用，截止了嘧啶合成途徑中的起始胺基酸天冬氨酸的分支代謝途徑。 其細菌學特徵如下I. I形態學
I. I. I形狀和大小短芽孢桿菌(O. 7-0. 8X2. 5-3微米)
I. I. 2多形態單型，雙型稀有
I. I. 3運動性無
I. I. 4芽孢形成有
I. I. 5孢子形狀卵圓形
I. I. 6孢子部位靠近中央
I. I. 7革蘭氏染色陽性
I. 2生長狀態
I. 2. I肉浸汁瓊脂平板培養不規則和擴散形，表面粗糙而扁平，不透明，淺棕色。
I. 2. 2石蕊牛奶腖化，色素減少
I. 2. 3肉浸汁液體培養表面形成菌膜，不渾濁
I. 3生理特性
1.3. I硝酸鹽還原+
1.3.2澱粉水解
I. 3. 3v-p試驗陽性+
I. 3. 4丙酸的利用_
I. 3. 5朽1檬酸的利用+
I. 3. 6銨鹽的利用+
I. 3. 7脲酶微弱的
I. 3. 8過氧化氫酶存在
1.3. 9對氧的要求好氧
I. 3. 10抗酸性ph5. 7時能生長
1.3. 11抗氯化鈉性濃度7%時能生長
I. 3. 12抗嘧啶類似物0. 5ug/ml的5-氟尿嘧啶可生長
1.3. 13胞苷脫氨酶活性低於O. 01單位/mg蛋白
按照上述的胞磷膽鹼的製備方法，優選方案之一，步驟如下
(I)將枯草芽孢桿菌QL28001接種於含有O. 1_5%葡萄糖、O. 5_5%牛肉膏、1_10% 蛋白腖、O. 5-5%酵母粉、O. 5-1%氯化鈉成分的培養液中，32°C培養至糖耗盡時，得微生物A 的培養物。按5wt%的接種量將微生物A的培養物接種於培養液中，所述培養液是含有碳源、 氮源和微量元素的水溶液，該培養液碳源濃度為8-20wt%、氮源濃度為3-6wt%、微量元素濃度為O. 2-5wt%，並添加O. 1-3%的磷酸鹽，30 35°C培養5 25h ;得含有微生物A的培養液，或者將培養液離心收集菌體；(2)向步驟(I)的含有微生物A的培養液中加入膽鹼原料，膽鹼原料加量為培養液重量的O. 5-3wt%，在反應溫度20 38°C，反應10 72小時，控制pH 5 7. 5條件下反應累積生成胞磷膽鹼。或者，將步驟(I)的含有微生物A的培養液按照5_30wt%的接種量接種於含有碳源、氮源、微量元素、膽鹼原料和微生物B的培養液中，在反應溫度20 38°C，反應10 72小時， 控制pH 5 7. 5，在此培養液中反應累積生成胞磷膽鹼。該培養液中碳源濃度為8-20Wt%， 氮源濃度為3-6wt %，微量元素濃度為O. 2-5wt %，微生物B濃度為5-30wt %，膽鹼原料加量為培養液重量的O. 5-3wt%,30 35°C培養5 25h。進一步優選的，上述步驟(2)的培養液中還添加有O. 005-0. 05wt%的表面活性劑。按照上述的胞磷膽鹼的製備方法，優選方案之二，步驟如下I)將微生物A接種於含有O. 5%葡萄糖、O. 5%牛肉膏、1%蛋白腖、O. 5%酵母粉、 O. 5%氯化鈉成分的培養液中，32°C培養至糖耗盡時，分離菌體得微生物A的培養物。2)將步驟I)微生物A的培養物按照5-20wt%的接種量接種於含有碳源、氮源、微量元素的培養液中，在反應溫度20 38°C，反應10 30小時分離菌體；所述培養液中碳源濃度為8-20wt%，氮源濃度為3-6wt%，微量元素濃度為O. 2-5wt% ；3)將步驟2)菌體按照5-30wt%加入含有碳源、氮源、微量元素、膽鹼原料、表面活性劑和微生物B的培養液中，在反應溫度20 38°C，反應20 72小時，控制pH 5 7. 5， 在此培養液中反應生成累積胞磷膽鹼。所述培養液中碳源濃度為8-20wt%，氮源濃度為
3-6wt%,微量元素濃度為O. 2-5wt%,微生物B濃度為5-30wt%，膽鹼原料加量為培養液重量的0.5-3wt%。或者，將步驟2)的菌體按照5-30wt%加入含有碳源、氮源、微量元素、膽鹼原料的培養液中，在反應溫度20 38°C，反應20 72小時，控制pH 5 7. 5，在此培養液中反應生成累積胞磷膽鹼。所述培養液中碳源濃度為8-20wt%，氮源濃度為3-6wt%，微量元素濃度為
O.2-5wt%，膽鹼原料加量為培養液重量的O. 5-3wt%。進一步優選的，上述步驟3)的培養液中還添加有O. 005-0. 05被％的表面活性劑。進一步優選的，上述步驟2)、3)的培養液中還添加有O. 1-3%的磷酸鹽。根據本發明所述的胞磷膽鹼的製備方法，從以上所得的累積胞磷膽鹼反應液中進一步提取所述胞磷膽鹼。按現有技術即可。在上述胞磷膽鹼的製備方法中，所述碳源選自以下三類之一a、糖類，具體選自葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、山梨糖、葡萄糖酸、糖蜜、甘油或澱粉水解物。b、有機酸，具體選自丙酮酸、乳酸、檸檬酸或丙酮酸。C、天然有機碳源，具體選自玉米漿或甘蔗渣。上述胞磷膽鹼的的製備方法，所述氮源選自玉米漿、酵母粉、酵母浸膏、硫酸銨、氨水、氨氣、醋酸銨、穀氨醯胺、尿素之一或組合；上述胞磷膽鹼的的製備方法，所述的微量元素選自鎂鹽、錳鹽、鈷鹽、銅鹽、鉀鹽、 D-生物素中的一種或組合，進一步優選硫酸鎂、磷酸二氫鉀、D-生物素中的一種或組合。上述胞磷膽鹼的的製備方法，優選的反應條件為pH 6 7，反應溫度30 35°C， 反應時間控制在30 48小時。本發明所述的製備方法，為了能夠促進胞磷膽鹼的合成，反應體系中也可加入合適的表面活性劑，優選的，表面活性劑為吐溫-80。本發明所述的製備方法中未詳細列舉的按現有技術即可。採用以上所列條件製備胞磷膽鹼的方法，採用了廉價的磷酸膽鹼、氯化膽鹼等為原料，使得製備成本大大降低。通過該方法胞二磷膽鹼的製備水平可達到11. 2g/L反應液。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明，這些實施例不應作為本發明的限制。如無特別說明，實施例中各成分的用量均為質量百分比。實施例中微生物來源如下工業啤酒酵母溼菌體購自濟南啤酒廠。D-生物素購自上海生工生物工程有限公司。穀氨酸棒狀桿菌保藏號ATCC No. 13032、洋蔥假單胞菌保藏號ATCC No. 25416、 檸檬節桿菌保藏號ATCC No. 11624、穀氨酸棒桿菌保藏號ATCC No. 13287、大腸桿菌保藏號ATCCNo. 21148等購自美國標準生物品收藏中心。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) QL28001,由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，菌種保藏編號CGMCC No.5849。所述微生物的培養物、處理物除有特別說明的外均按現有技術獲得。實施例I、A、將枯草芽孢桿菌QL28001接種於含有O. 5%葡萄糖、O. 5%牛肉膏、1%蛋白腖、
O.5%酵母粉、O. 5%氯化鈉成分的培養液中，32°C培養至糖耗盡時，得枯草芽孢桿菌的培養物；B、按5%的接種量，將所得枯草芽孢桿菌QL28001的培養物接種於含有20%葡萄糖、5%酵母粉、O. 5%硫酸鎂、1%磷酸二氫鉀成分的培養液中，32°C培養6h ;得枯草芽孢桿菌QL28001的培養液；C、所得枯草芽孢桿菌QL28001的培養液連續流加I %的磷酸膽鹼，繼續反應30h， 過程中用濃氨水調節pH在6. 8，獲得的培養液中含胞磷膽鹼5. 7g/L。實施例2、按實施例I的步驟A製得枯草芽孢桿菌的培養物；按5%的接種量，將枯草芽孢桿菌的培養物接種於含有8%葡萄糖、2%酵母粉、1%尿素、O. 5%硫酸鎂、1%磷酸二氫鉀、O. 01% D-生物素的培養液中，35°C培養約20小時至糖耗盡。
將所得培養液按照30%的接種量接種於含有12%葡萄糖、1%硫酸鎂、1%磷酸二氫鉀、I %磷酸膽鹼、O. 01%吐溫-80、10%工業啤酒酵母溼菌體的培養液中，繼續反應30h， 過程中用濃氨水調節PH保持在6. 8，獲得的培養液中含胞磷膽鹼7. 6g/L。實施例3、按實施例I的步驟A製得枯草芽孢桿菌的培養物；按5%的接種量，將枯草芽孢桿菌的培養物接種於含有8%葡萄糖、2%酵母粉、1%尿素、O. 5%硫酸鎂、1%磷酸二氫鉀、O. 01 % D-生物素的培養液中，35°C培養至24小時，離心收集菌體，按照溼菌體10%的接種量接種於含有12 %葡萄糖、I %硫酸鎂、I %磷酸二氫鉀、I %磷酸膽鹼、O. 01 %吐溫-80 的培養液中，反應30h，過程中用濃氨水調節pH保持在6. 8，獲得的培養液中含胞磷膽鹼 8.2g/L。實施例4、按實施例I的步驟A製得枯草芽孢桿菌的培養物；按5 %的接種量，將枯草芽孢桿菌的培養物接種於含有12 %葡萄糖、2%酵母粉、I %尿素、2%玉米漿、O. 5%硫酸鎂、I %磷酸二氫鉀、O. 01% D-生物素的培養液中，35°C培養至24小時，離心收集菌體， 按照溼菌體10%的接種量接種於含有10%葡萄糖、1%硫酸鎂、4%磷酸二氫鉀、1%磷酸膽鹼、O. OI %吐溫-80、10 %工業啤酒酵母溼菌體的培養液中，24 °C反應46h，過程中用濃氨水調節PH保持在6. 5，獲得的培養液中含胞磷膽鹼11. 2g/L。實施例5、按實施例I的步驟A製得枯草芽孢桿菌的培養物；按5%的接種量，將枯草芽孢桿菌的培養物接種於含有13%葡萄糖、2%酵母粉、1%尿素、O. 5%硫酸鎂、1%磷酸二氫鉀、O. 01% D-生物素、10%凍融的工業啤酒酵母溼菌體、2%磷酸膽鹼的培養液中， 30°C培養48小時，過程中用濃氨水調節pH保持在6. 5，獲得的培養液中含胞磷膽鹼8. 7g/ L0實施例6、按實施例I的步驟A製得枯草芽孢桿菌的培養物；按5%的接種量，將培養物接種於含有10%葡萄糖、2%酵母粉、2%尿素、O. 8%硫酸鎂、I %磷酸二氫鉀、O. 01% D-生物素的培養液中，30°C培養24小時後，添加15%工業啤酒酵母溼菌體和I. 5%的磷酸膽鹼，繼續培養48h，過程中用濃氨水調節pH保持在6. 8，獲得的培養液中含胞磷膽鹼 7. 2g/L。實施例7將穀氨酸棒狀桿菌保藏號ATCC No. 13032接種於含有O. 5%葡萄糖、O. 5%牛肉膏、1%蛋白腖、O. 5%酵母粉、O. 5%氯化鈉成分的培養液中，31°C培養至糖耗盡，得穀氨酸棒狀桿菌ATCC 13032的培養物。按5 %的接種量，將所得培養物接種於含有8 %葡萄糖、2 % 酵母粉、I %尿素、O. 5%硫酸鎂、I %磷酸二氫鉀、O. 01% D-生物素的培養液中，37°C培養至糖耗盡時，將培養液按照30%的接種量接種於含有13%葡萄糖、O. 6%硫酸鎂、I. 5%磷酸二氫鉀、I. 5 %磷酸膽鹼、O. 01 %吐溫-80、10 %工業啤酒酵母溼菌體的培養液中，繼續反應 27h，過程中用濃氨水調節pH保持在6. 8，獲得的培養液中含胞磷膽鹼4. 8g/L。實施例8將洋蔥假單胞菌保藏號ATCC No.25416接種於含有1%葡萄糖、0.5%蛋白腖、 酵母膏O. I %、磷酸氫二鈉O. 05%成分的培養液中，28°C培養19h，得洋蔥假單胞菌ATCC 25416的培養物。按5%的接種量，將所得培養物接種於在含有5%葡萄糖、I. 5%玉米漿、 1%豆柏水解液、麥芽糖2%、0. 5%硫酸鎂、1%磷酸二氫鉀成分的培養液養基中，26°C培養 IOh後，連續流加I %的磷酸膽鹼，繼續反應40h，過程中用濃氨水調節pH在6. 8，獲得的培養液中含胞磷膽鹼4. 7g/L。實施例9將檸檬節桿菌保藏號ATCC No. 11624接種於含有I %葡萄糖、O. 5%酵母膏、I %蛋白腖、O. I %磷酸氫二鈉成分的培養液中，25°C培養至糖耗盡，得檸檬節桿菌ATCC 11624的培養物。按5 %的接種量，將培養物接種於含有8 %葡萄糖、I %玉米眾、I %豆柏水解液、麥芽糖2 %、O. 5 %硫酸鎂、I %磷酸二氫鉀、O. OI % D-生物素的培養液中，25 °C培養至36小時， 離心收集菌體，按照溼菌體10%的接種量接種於含有12%葡萄糖、1%硫酸鎂、1%磷酸二氫鉀、I %磷酸膽鹼、O. 01%吐溫-80的培養液中，反應30h,過程中用濃氨水調節pH保持在
6.8，獲得的培養液中含胞磷膽鹼3. 4g/L。實施例10將釀酒酵母保藏號ATCC No. 40075接種於含有O. 5%葡萄糖、O. 5%牛肉膏、I % 蛋白腖、O. 5%酵母粉、O. 5%氯化鈉成分的培養液中，32°C培養至糖耗盡，得釀酒酵母ATCC 40075的培養物。按5%的接種量，將培養物接種於含有12%葡萄糖、2%酵母粉、I %尿素、 2%玉米漿、O. 5%硫酸鎂、I %磷酸二氫鉀、O. 01% D-生物素的培養液中，35 °C培養至24小時，離心收集菌體，按照溼菌體10%的接種量接種於含有10%葡萄糖、I %硫酸鎂、4%磷酸二氫鉀、I %磷酸膽鹼、O. 01%吐溫-80、25%大腸桿菌ATCC 21148幹菌體的培養液中，24°C 反應40h，過程中用濃氨水調節pH保持在6. 7，獲得的培養液中含胞磷膽鹼4. 2g/L。實施例11、按實施例I的步驟A製得枯草芽孢桿菌的培養物；按5%的接種量，將培養物接種於含有12%葡萄糖、2%酵母粉、1%尿素、2%玉米漿、O. 5%硫酸鎂、1%磷酸二氫鉀、O. 01% D-生物素的培養液中，35°C培養至24小時，離心收集菌體，按照溼菌體10% 的接種量接種於含有10 %葡萄糖、I %硫酸鎂、4 %磷酸二氫鉀、I %磷酸膽鹼、O. 01 %吐溫_80、9%穀氨酸棒桿菌保藏號ATCC No. 13287幹菌體的培養液中，24°C反應40h，過程中用濃氨水調節PH保持在6. 7，獲得的培養液中含胞磷膽鹼6. 9g/L。
權利要求
1.一種胞磷膽鹼的製備方法，以11密唳從頭合成為基礎反應，該方法包括在有微生物A 的培養液存在的情況下，或者還有微生物B的培養液或處理物存在的情況下，將膽鹼原料在反應溫度20 38°C反應10 72小時，控制pH 5 7. 5，累積生成胞磷膽鹼；所述的膽鹼原料選自膽鹼、氯化膽鹼、磷酸膽鹼、碘化膽鹼或溴化膽鹼；所述微生物A選自屬於棒桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、 芽抱桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Rseudomonas)、釀酒酵母屬(Saccharomyces cerevisiae)中的一個或2個以上屬的菌株。所述微生物B選自①啤酒發酵的工業啤酒酵母菌體，或者②含有磷酸膽鹼轉胞苷醯酶的大腸桿菌、穀氨酸棒桿菌之一，或者是③含有磷酸膽鹼轉胞苷醯酶的大腸桿菌、穀氨酸棒桿菌的轉化體、培養液或提取物。
2.如權利要求I所述的胞磷膽鹼的製備方法，其特徵在於所述微生物A為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)QL28001保藏號CGMCC No. 5849，穀氨酸棒狀桿菌保藏號ATCC No. 13032，洋蔥假單胞菌保藏號ATCC No. 25416，檸檬節桿菌保藏號ATCC No. 11624，釀酒酵母保藏號ATCC No. 40075之一。
3.如權利要求I所述的胞磷膽鹼的製備方法，其特徵在於步驟如下(1)將枯草芽孢桿菌QL28001接種於含有0.1-5%葡萄糖、0. 5_5%牛肉膏、1-10%蛋白腖、0. 5-5%酵母粉、0. 5-1%氯化鈉成分的培養液中，32°C培養至糖耗盡時，得微生物A的培養物；按5wt%的接種量將微生物A的培養物接種於培養液中，所述培養液是含有碳源、氮源和微量元素的水溶液，該培養液碳源濃度為8-20wt%、氮源濃度為3-6wt%、微量元素濃度為0. 2-5wt%，並添加0. 1-3%的磷酸鹽，30 35°C培養5 25h ;得含有微生物A的培養液，或者將培養液離心收集菌體；(2)向步驟(I)的含有微生物A的培養液中加入膽鹼原料，膽鹼原料加量為培養液重量的0. 5-3wt%，在反應溫度20 38°C，反應10 72小時，控制pH 57. 5條件下反應累積生成胞磷膽鹼；或者，將步驟(I)的含有微生物A的培養液按照5-30wt%的接種量接種於含有碳源、氮源、 微量元素、膽鹼原料和微生物B的培養液中，在反應溫度20 38°C，反應10 72小時，控制pH 5 7. 5，在此培養液中反應累積生成胞磷膽鹼。該培養液中碳源濃度為8-20Wt%， 氮源濃度為3-6wt %，微量元素濃度為0. 2-5wt %，微生物B濃度為5-30wt %，膽鹼原料加量為培養液重量的0. 5-3wt%,30 35°C培養5 25h。
4.如權利要求3所述的胞磷膽鹼的製備方法，其特徵在於所述步驟(2)的培養液中還添加有0. 005-0. 05wt%的表面活性劑；優選的，表面活性劑為吐溫-80。
5.如權利要求I所述的胞磷膽鹼的製備方法，其特徵在於步驟如下1)將微生物A接種於含有0.5%葡萄糖、0. 5%牛肉膏、1%蛋白腖、0. 5%酵母粉、0. 5% 氯化鈉成分的培養液中，32°C培養至糖耗盡時，分離菌體得微生物A的培養物；2)將步驟I)微生物A的培養物按照5-20wt%的接種量接種於含有碳源、氮源、微量元素的培養液中，在反應溫度20 38°C，反應10 30小時分離菌體；所述培養液中碳源濃度為8-20wt%，氮源濃度為3-6wt%，微量元素濃度為0. 2-5wt% ；3)將步驟2)菌體按照5-30wt%加入含有碳源、氮源、微量元素、膽鹼原料、表面活性劑和微生物B的培養液中，在反應溫度20 38°C，反應20 72小時，控制pH 5 7. ·5， 在此培養液中反應生成累積胞磷膽鹼。所述培養液中碳源濃度為8-20wt%，氮源濃度為 3-6wt%,微量元素濃度為0. 2-5wt%,微生物B濃度為5-30wt%，膽鹼原料加量為培養液重量的0. 5-3wt% ;或者，將步驟2)的菌體按照5-30wt%加入含有碳源、氮源、微量元素、膽鹼原料的培養液中，在反應溫度20 38°C，反應20 72小時，控制pH 5 7. 5，在此培養液中反應生成累積胞磷膽鹼；所述培養液中碳源濃度為8-20wt%，氮源濃度為3-6wt%，微量元素濃度為·0.2-5wt%，膽鹼原料加量為培養液重量的0. 5-3wt%。
6.如權利要求5所述的胞磷膽鹼的製備方法，其特徵在於步驟3)的培養液中還添加有0.005-0. 05wt%的表面活性劑，或/和步驟2)、3)的培養液中還添加有0. 1_3%的磷酸鹽； 優選的，表面活性劑為吐溫-80。
7.如權利要求3或5所述的胞磷膽鹼的製備方法，其特徵在於，所述碳源選自以下之a、葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、山梨糖、葡萄糖酸、糖蜜、甘油或澱粉水解物，b、丙酮酸、乳酸、檸檬酸或丙酮酸，C、玉米漿或甘蔗渣。
8.如權利要求3或5所述的胞磷膽鹼的製備方法，其特徵在於所述氮源選自玉米漿、酵母粉、酵母浸膏、硫酸銨、氨水、氨氣、醋酸銨、穀氨醯胺、尿素之一或組合。
9.如權利要求3或5所述的胞磷膽鹼的製備方法，其特徵在於所述的微量元素選自鎂鹽、錳鹽、鈷鹽、銅鹽、鉀鹽、D-生物素中的一種或組合；優選硫酸鎂、磷酸二氫鉀、D-生物素之一或組合。
10.如權利要求I所述的胞磷膽鹼的製備方法，其特徵在於反應條件為pH6 7，反應溫度30 35°C，反應時間控制在30 48小時。
全文摘要
本發明涉及一種胞磷膽鹼的製備方法，是以嘧啶從頭合成為基礎反應，在有微生物A的培養液存在的情況下或者還有微生物B的培養液或處理物存在的情況下，將膽鹼原料在反應溫度20～38℃反應10～72小時，控制pH 5～7.5，累積生成胞磷膽鹼；利用簡單的起始原料碳、氮源，在含有膽鹼原料的培養液中，利用代謝過程合成胞磷膽鹼的前體胞嘧啶系核苷酸，在此反應溶液中反應累積生成胞磷膽鹼；該方法避免使用價格昂貴的嘧啶系核苷酸或其前體原料，使得胞磷膽鹼的製備成本大大降低。
文檔編號C12P19/30GK102586383SQ20121006660
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月15日 優先權日2012年3月15日
發明者孫英俠, 畢曉峰, 潘懷明, 王晶翼, 薛永玲 申請人:齊魯製藥有限公司