高爾基體蛋白gp73定量測定試劑盒及其檢測方法

2023-05-30 09:24:26

高爾基體蛋白gp73定量測定試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種高爾基體蛋白GP73定量測定試劑盒及其檢測方法，包括磁分離試劑的製備、酶反應物的製備、反應增強劑的配製、校準品稀釋液的配製、校準品和質控品的配製、清洗濃縮液的配製和底物溶液的配製七個步驟。本發明高爾基體蛋白GP73定量測定試劑盒及其檢測方法具有較高的靈敏度和特異性，更短的獲得檢測結果的時間和更簡便的操作方式，對肝癌的早期診斷具有重要意義。
【專利說明】高爾基體蛋白GP73定量測定試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高爾基體蛋白GP73定量測定試劑盒及其檢測方法，用於體外定 量測定樣品血清中的高爾基體蛋白GP73含量。
【背景技術】
[0002]肝癌發病率在全世界是位列第四位、中國位列第二的惡性腫瘤，且在世界範圍內 呈逐年上升趨勢，現總發病率已超過56萬。肝癌發病之初較為隱匿，臨床難以檢出，臨床診 斷檢出一般多為晚期，治療效果差，如若早期發現肝癌並且及時治療可以提高患者的5年 存活率，因此肝癌的早期發現具有重要的臨床意義。
[0003]目前肝癌的檢測手段包括肝超聲影像分析和血清學標誌物檢測，其中最常使用 的血清學標誌物是甲胎蛋白(AFP)，但是AFP在早期肝癌診斷中靈敏度不高，只有50%? 60%的肝癌患者AFP呈陽性，並且慢性肝炎、肝硬化患者等肝癌高危人群也可引起甲胎蛋 白的升高。因此，臨床需要一種更好地用於肝癌監測的標誌物。
[0004]近年來，隨著基因組學、蛋白質組學、腫瘤免疫等相關研究的飛速發展，研究者篩 選出一些潛在的新的腫瘤標誌物，而高爾基體不但參與蛋白加工，還參與細胞分化及細胞 間信號的轉導，並在細胞凋亡中扮演重要角色，其功能障礙可能與腫瘤的發生密切相關，其 中，高爾基體糖蛋白73 (GP73)是最值得期待的血清標誌物之一。已經有多個研究組驗證 了 GP73是一種新的肝癌標誌物。在以往的研究中多使用免疫印跡方法，這種方法不僅靈敏 度低、特異性弱，在操作上也比較複雜，無法在臨床上普及應用。經專利檢索，GP73的檢測 方法有多種包括ELISA、基因診斷等多種形式，但尚未見有將板式磁顆粒化學發光免疫分析 技術應用到高爾基體蛋白GP73的檢測中。

【發明內容】

[0005]本發明目的在於提供一種靈敏度高、特異性強、操作簡單的高爾基體蛋白GP73板 式磁顆粒化學發光免疫分析測定試劑盒以及製備方法。
[0006]本發明的目的是這樣實現的:
一種高爾基體蛋白GP73板式磁顆粒化學發光免疫分析測定試劑盒，包括盒體和盒體 上方的盒蓋，所述盒體內設有微孔板和位於盒體底部的支撐板，其中微孔板由48或96個微 孔組成，支撐板上開有多個孔，所述孔內共放置有八個試劑瓶，所述八個試劑瓶內分別含有 磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑、校準品、質控品、清洗濃縮液、稀釋液以及底物溶液，其 中磁分離試劑含有高爾基體蛋白GP73單克隆抗體包被的磁顆粒。
[0007]本發明高爾基體蛋白GP73定量測定檢測方法，所述檢測方法包括試劑準備過程 和檢測步驟，所述試劑準備過程如下:
步驟一、磁分離試劑的製備
一、磁珠緩衝液配製
(I)、稱取 TRIS 4.58g 和 NaC16.81g 於 IL 容器中，然後稱取 0.96g TWEEN-20 於 20ml容器中加適量水使其完全溶解後，再倒入上述IL容器中；
(2)、用移液器將Proclin-300量取0.2ml於IOml純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上 述IL容器中，然後在上述IL容器中加入800ml純化水，充分攪拌；
(3)、調節PH計測量其PH值，控制PH在7.95-8.05之間；
(4)、稱取BSA3g倒入上述IL容器中；
(5)、最後IL容器定容至1000ml,用0.2um濾器過濾；過濾完後貼好標籤於2_8°C冷庫 貯存；
二、磁分離試劑的製備
(1)、將1.0mg辛二酸二琥珀醯亞胺酯溶於50ulDMS0中，取2mg抗GP73單克隆抗體溶 於PH 9.5的0.lmol/L的PB緩衝液中至總體積為Iml ；
(2)、確定辛二酸二琥珀醯亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀醯亞胺酯加入 到上述GP73單克隆抗體溶液中，置室溫90min ；
(3)、然後將抗體溶液加入到Centricon-1O濃縮管中，放入到高速冷凍離心機中在 3000g下濃縮30min至體積為0.5ml ；
(4)、取0.5ml磁珠加入5ml反應杯中，放入專用試管架，經磁鐵吸附2分鐘後吸取上
清；
(5)、每次加入1.5ml PH9.5的0.lmol/L的PB緩衝液，混勻30秒，上架，去上清，重複 操作3次；將獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻後室溫反應4小時；
(6)、加入0.3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分鐘；
(7)、每次加入1.5ml PH7.2的0.lmol/L的PB緩衝液清洗已經標記的磁珠，混勻30秒， 上架，去上清，重複操作3次；
(8)、用IOOml磁珠保存液將磁珠轉入125ml玻璃瓶，即為0.05%的GP73磁分離試劑； 磁珠保存液配方為0.1% BSA，0.05%吐溫-20，0.02% NaN3，20%乙醇，4°C保存；
(9)、將獲得的磁分離試劑用磁珠緩衝液按照1:1的比例混勻，即得磁分離試劑； 步驟二、酶反應物的製備
步驟三、反應增強劑的配製
(1)、稱取TRIS1.56g和NaCl 4.23g於IL容器中；用移液器將Proclin-300量取0.2ml 於IOml純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL容器中；
(2)、用量筒量取800ml純化水於上述IL容器中，充分攪拌直至完全溶解，然後調PH 值，控制PH在7.35-7.45之間；
(3)、稱取Mak330.9g於上述IL容器中；最後定容至IOOOml,完全溶解後,用0.2um濾 器過濾；
步驟四、校準品稀釋液的配製 步驟五、校準品和質控品的配製 步驟六、清洗濃縮液的配製
(1)、稱取KCl4g、NaC140g、蔗糖IOg於IL容器中；
(2)、稱取0.225g Tween-20於IOOml容器中加15ml水使其完全溶解後，倒入上述IL
容器中；
(3)、用移液器將Proclin-300量取0.225ml於盛有15ml純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL容器中；
(4)、用量筒量取800ml純化水於上述IL容器中，充分攪拌直至完全溶解；
(5)、調PH，控制其範圍在7.35-7.45之間；
(6)、最後定容至1000ml,完全溶解後用0.2um濾器過濾即得；
步驟七、底物溶液的配製
所述高爾基體蛋白GP73的檢測步驟如下:
(1)、加50iU高爾基體蛋白GP73校準品、質控品、待測標本至對應微孔底部；
(2)、加50ii I酶反應物至每一微孔中；
(3)、加50Ul反應增強劑至每一微孔中；
(4)、加50ii I磁分離試劑至每一微孔中；
(5)、用塑料薄膜覆蓋微孔，多管混勻器輕輕振蕩微孔板30s後，置37°C水浴30分鐘；
(6)、微孔板放至磁分離器上，確保每個微孔都與分離器表面接觸，沉澱2分鐘；緩慢的 倒轉分離器倒出上清液，把倒轉的微孔板連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底 部以除去粘在微孔上的所有液滴；
(7)、清洗濃縮液用純化水稀釋20倍後，加200u I稀釋後的清洗液至每一微孔中，置多 管混勻器上輕輕振蕩混勻30s ;加樣時應避免加樣力度過大而導致磁珠濺出，且混勻要徹 底；
(8)、重複步驟(6)、(7)、(6)—遍；
(9)、加IOOiU底物溶液至微孔中混勻3秒，迅速用準備好的發光檢測儀進行檢測；
(10)、以校準品濃度的Log值為橫坐標，RLU的Log值為縱坐標繪製出標準曲線(雙對 數曲線)，以各待測血清RLU值在標準曲線上查出該血清的GP73的濃度，其中縱坐標為發光 強度，橫坐標為GP73濃度(單位為ng/ml)。
[0008]本發明高爾基體蛋白GP73定量測定檢測方法，所述底物溶液的製備包括以下步 驟:
一、底物溶液A的配製步驟
(1)、稱取硼砂5.721g、硼酸2.474g、魯米諾1.0g和對碘苯酚0.1mg於IL燒杯中；
(2)、用量筒量取400ml純化水於IL燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調PH，控制其範圍 在 7.95-8.05 之間；
(3)、用0.2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至500ml，混勻後即得；
二、底物溶液B的配製
(I)、稱取硼砂5.721g、硼酸2.474g、過氧化脲0.1g和PC300 250ul於IL燒杯中；
(2 )、用量筒量取400ml純化水於IL燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調PH控制其範圍 在 7.95-8.05 之間；
(3)、用0.2um濾器過濾收集濾液,用純化水定容至500ml,混勻後即得。
[0009]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
本發明高爾基體蛋白GP73定量測定試劑盒及其檢測方法具有較高的靈敏度和特異 性，更短的獲得檢測結果的時間和更簡便的操作方式，對肝癌的早期診斷具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】為本發明高爾基體蛋白GP73定量測定試劑盒及其檢測方法的結構示意圖。 為圖1去掉盒蓋和微孔板後的俯視圖。
為圖1中微孔板的結構示意圖。
[0010]圖1
[0011]圖2
[0012]圖3
[0013]其中:
盒體I 盒蓋2 支撐板3 孔4
試劑瓶5 微孔板6 微孔7。
【具體實施方式】
[0014]參見圖1-圖3，本發明高爾基體蛋白GP73定量測定試劑盒，包括盒體I和盒體上 方的盒蓋2，所述盒體I內設有微孔板6和位於盒體I底部的由泡沫塑料製成的支撐板3， 其中微孔板6由48或96個微孔7組成，支撐板3上開有多個孔4，所述孔4內共放置有八 個試劑瓶5，所述八個試劑瓶5內分別含有磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑、校準品、質 控品、清洗濃縮液、稀釋液以及底物溶液，其中磁分離試劑含有高爾基體蛋白GP73單克隆 抗體包被的磁顆粒。
[0015]製備方法
步驟一、磁分離試劑的製備 一、磁珠緩衝液配製
1、稱取TRIS 4.58g 和 NaC16.81g 於 IL 容器中，然後稱取 0.96g TWEEN-20 於 20ml 容 器中加適量水使其完全溶解後，再倒入上述IL容器中；
2、用移液器將Proclin-300量取0.2ml於IOml純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述 IL容器中，然後在上述IL容器中加入800ml純化水，充分攪拌；
3、調節PH計測量其PH值，控制PH在7.95-8.05之間；
4、稱取BSA3g倒入上述IL容器中；
5、最後IL容器定容至1000ml，用0.2um濾器過濾；過濾完後貼好標籤於2_8°C冷庫貯存。
[0016]二、磁分離試劑的製備
1、將1.0mg辛二酸二琥珀醯亞胺酯溶於50ulDMS0中，取2mg抗GP73單克隆抗體溶於 PH 9.5的0.lmol/L的PB緩衝液中至總體積為Iml ；
2、確定辛二酸二琥珀醯亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀醯亞胺酯加入到 上述GP73單克隆抗體溶液中，置室溫90min ；
3、然後將抗體溶液加入到Centricon-1O濃縮管中，放入到高速冷凍離心機中在3000g 下濃縮30min至體積為0.5ml ；
4、取0.5ml磁珠加入5ml反應杯中，放入專用試管架，經磁鐵吸附2分鐘後吸取上清；
5、每次加入1.5ml PH9.5的0.lmol/L的PB緩衝液，混勻30秒，上架，去上清，重複操作3次；將獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻後室溫反應4小時；
6、加入0.3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分鐘；
7、每次加入1.5ml PH7.2的0.lmol/L的PB緩衝液清洗已經標記的磁珠，混勻30秒， 上架，去上清，重複操作3次；
8、用IOOml磁珠保存液將磁珠轉入125ml玻璃瓶，即為0.05%的GP73磁分離試劑； 磁珠保存液配方為0.1% BSA，0.05%吐溫-20，0.02% NaN3，20%乙醇，4°C保存。
[0017]9、將獲得的磁分離試劑用磁珠緩衝液按照1:1的比例混勻，即得本發明試劑盒中 磁分離試劑。
[0018]步驟二、酶反應物的製備 一、酶反應物稀釋液的配製
1、取Tris4.846g、HCl 2847 於燒瓶中，然後在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌 使試劑完全溶解；
2、調PH，控制 PH 在 7.35-7.45 ；
3、稱取BSA4g倒入上述燒杯中；
4、最後燒杯定容至400ml,用0.2um濾器過濾即得。
[0019]二、辣根過氧化物酶(HRP)與GP73抗原的偶聯
1、取GP73-3-cmo-BSA抗原Img放置於Iml玻璃管中；
2、取200ulDMSO溶解抗原使抗原的終濃度到達5mg/ml，然後充分混勻；
3、按照Imol抗原加入IOmol的辛二酸二琥珀醯亞胺酯的摩爾比例加辛二酸二琥珀醯 亞胺酯到上述2溶液中，37°C恆溫箱中反應1.5小時；
4、按照3mol抗原加入Imol的(HRP)的摩爾比往上述3的溶液中添加(HRP)，然後加 A Iml的PH為7.4濃度為0.1M的PB緩衝液，置於37度恆溫箱中反應3小時；
5、將上述4的溶液用PD-10柱純化，收集純化液，按照1:3000的體積添加獲得的酶反 應物稀釋液，混合均勻即得酶反應物。
[0020]步驟三、反應增強劑的配製
1、稱取TRIS1.56g和NaCl 4.23g於IL容器中；用移液器將Proclin-300量取0.2ml 於IOml純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL容器中；
2、用量筒量取800ml純化水於上述IL容器中，充分攪拌直至完全溶解，然後調PH值， 控制PH在7.35-7.45之間；
3、稱取Mak330.9g於上述IL容器中；最後定容至1000ml,完全溶解後,用0.2um濾器 過濾。
[0021]步驟四、校準品稀釋液的配製
1、稱取Tris7.268g和Hcl 4270 y I於IL的容器中，定容至600ml ;
2、用量筒量取小牛血清300ml，加入上述溶液中，校準品稀釋液備用。
[0022]步驟五、校準品和質控品的配製
校準品濃度分別為4，8，16，32，64ng/ml ;質控品濃度分別為0.75，7.5ng/ml。
[0023]步驟六、清洗濃縮液的配製
1、稱取Kcl4g、NaC140g、蔗糖IOg於IL容器中；
2、稱取0.225g Tween-20於IOOml容器中加15ml水使其完全溶解後，倒入上述IL容器中；
3、用移液器將Proclin-300量取0.225ml於盛有15ml純化水的燒杯中完全溶解後，倒 入上述IL容器中；
4、用量筒量取800ml純化水於上述IL容器中，充分攪拌直至完全溶解；
5、調PH，控制其範圍在7.35-7.45之間；
6、最後定容至1000ml,完全溶解後用0.2um濾器過濾即得。
[0024]步驟七、底物溶液的配製 一、底物溶液A的配製步驟
1、稱取硼砂5.721g、硼酸2.474g、魯米諾1.0g和對碘苯酚0.1mg於IL燒杯中；
2、用量筒量取400ml純化水於IL燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調PH，控制其範圍在
7.95-8.05 之間；
3、用0.2um濾器過濾收集濾液,用純化水定容至500ml,混勻後即得。
[0025]二、底物溶液B的配製
1、稱取硼砂5.721g、硼酸2.474g、過氧化脲0.1g和PC300 250ul於IL燒杯中；
2、用量筒量取400ml純化水於IL燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調PH控制其範圍在
7.95-8.05 之間；
3、用0.2um濾器過濾收集濾液,用純化水定容至500ml,混勻後即得。
[0026]所得的產品分裝即為半成品，抽出三份經過特異性、精密性、靈敏度及穩定性檢定 合格才能組裝成高爾基體蛋白GP73(GP73)微孔板式磁顆粒化學發光免疫分析測定試劑盒， 組裝成試劑盒後還需抽檢合格後才能出廠。
[0027]工作原理:
本發明為雙抗體夾心法化學發光免疫分析法與磁微粒分離技術相結合的一種檢測方 法。在標本、校準品和質控品中加入定量的酶標GP73抗原、結合著磁性微粒的GP73單克隆 抗體及穩定增強劑。37°C孵育後，酶標GP73抗原與標本、校準品和質控品中GP73競爭的與 結合著磁性微粒的GP73單克隆抗體發生特異性結合。在外加磁場中直接沉澱，不需離心即 可分離。倒去上清液，清洗沉澱的複合物，然後加入酶促化學發光底物。底物在酶作用下被 催化裂解，形成不穩定的激發態中間體，當激發態中間體回到基態時便發出光子，形成發光 反應，即可使用發光儀檢測反應的發光強度。在檢測範圍內，反應的發光強度與樣本中的 GP73濃度成反比。
[0028]使用方法
(I)樣品的前處理:
使用本試劑盒進行實驗前，需先取出辣根過氧化物酶標記的GP73抗體、校準品/待測 樣品、GP73抗體磁顆粒、發光底物液和洗滌液，在室溫放置15-30min，使它們平衡到室溫; 之後，將恆溫箱或者水浴鍋調至37°C ;準備好合適的微量加樣器及對應吸頭並且檢查化學 發光儀是否工作正常。
[0029](2)操作步驟:
1、加50iilGP73校準品、質控品、待測標本至對應微孔底部；
2、加50ii I酶反應物至每一微孔中；
3、加50Ul反應增強劑至每一微孔中；4、加50μ1磁分離試劑至每一微孔中；
5、用塑料薄膜覆蓋微孔，多管混勻器輕輕振蕩微孔板30s後，置37°C水浴30分鐘；
6、微孔板放至磁分離器上，確保每個微孔都與分離器表面接觸，沉澱2分鐘；緩慢的倒轉分離器倒出上清液，把倒轉的微孔板連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在微孔上的所有液滴；
7、清洗濃縮液用純化水稀釋20倍後，加200μ 1稀釋後的清洗液至每一微孔中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s ;加樣時應避免加樣力度過大而導致磁珠濺出，且混勻要徹底；
8、重複步驟6、7、6—遍；
9、加1OOμ1底物溶液至微孔中混勻3秒，迅速用準備好的發光檢測儀進行檢測；
10、如遇到高值HOOK樣本，為了避免出現高值HOOK效應，建議臨床醫師根據其餘測試指標選擇合適的稀釋倍數對樣品進行稀釋。
[0030]以校準品濃度的Log值為橫坐標，RLU的Log值為縱坐標繪製出標準曲線(雙對數曲線)，以各待測血清RLU值在標準曲線上查出該血清的GP73的濃度，其中縱坐標為發光強度，橫坐標為GP73濃度(單位為ng/ml)。
[0031]性能指標
1)準確性:試劑盒校準品與國家校準品同時測定，兩條劑量-反應曲線不顯著偏離平行。以國家校準品為對照品，試劑盒校準品試劑盒的實際值與標示值之比應該在0.90-1.10 的範圍內
2)劑量-反應曲線的線性:用雙對數數學模型擬合，在50-500ng/ml濃度範圍內，劑量-反應曲線的相關係數(r)的絕度值不低於0.9900
3)精密性:CV≤15%;重複性:CV≤10%
4)最低檢出量≤20ng/ml
5)質控血清測定值:應在質控範圍內
6)特異性:交叉反應率應小於0.2%
7)穩定性:將試劑盒37°C放置3天，測定結果應符合上述I)飛)項要求本發明具有以下優點:
1、本發明將化學發光技術與免疫磁微粒相結合，提供了一種接近均相的反應體系，與現有技術相比，靈敏度高，特異性強，檢測範圍寬，操作簡單，無放射性汙染，試劑盒成本低， 臨床適用性強。
[0032]2、本發明對所用的原材料進行篩選實驗和質量檢定，包括包被抗體的活性，磁顆粒的吸附性能和變異大小，(HRP)的活性、化學發光底物的發光強度及發光持續時間等，對於(HRP)的標記可以有不同的方法，通過反覆探索和對比試驗最終找到了簡單、產率高、成本低、質量可靠的標記方法。
[0033]3、本發明採用一種新的專用穩定增強劑以及清洗濃縮液，使得反應過程更加穩定可靠，實驗數據靈敏有效，在提高產品性能的同時，並且大大降低了產品成本。
[0034]4、試劑盒中的磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑、校準品、質控品，清洗濃縮液、 稀釋液以及底物溶液均是該反應體系下的最優配方，給該試劑盒的使用效期及檢測性能提供了有力保障。
[0035]5、本發明採用微孔板磁顆粒整合了兩種技術，主要體現在:(1)利用磁顆粒在相同體積的情況下表面積最大的原理，能夠結合更多的抗體，從而使得反應的靈敏度更高，線 性範圍更寬；(2)可以同時批量測量，適合大批量血清篩查。
【權利要求】
1.一種高爾基體蛋白GP73定量測定試劑盒，包括盒體(1)和盒體上方的盒蓋(2)，其特徵是:所述盒體(1)內設有微孔板(6)和位於盒體(1)底部的支撐板(3)，其中微孔板(6)由 48或96個微孔(7)組成，支撐板(3)上開有多個孔(4)，所述孔(4)內共放置有八個試劑瓶 (5)，所述八個試劑瓶(5)內分別含有磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑、校準品、質控品、 清洗濃縮液、稀釋液以及底物溶液，其中磁分離試劑含有高爾基體蛋白GP73單克隆抗體包被的磁顆粒。
2.一種高爾基體蛋白GP73定量測定檢測方法，其特徵在於所述檢測方法包括試劑準備過程和檢測步驟，所述試劑準備過程如下:步驟一、磁分離試劑的製備一、磁珠緩衝液配製(1)、稱取TRIS 4.58g 和 NaC16.81g 於 IL 容器中，然後稱取 0.96g TWEEN-20 於 20ml 容器中加適量水使其完全溶解後，再倒入上述IL容器中；(2)、用移液器將Proclin-300量取0.2ml於IOml純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL容器中，然後在上述IL容器中加入800ml純化水，充分攪拌；(3)、調節PH計測量其PH值，控制PH在7.95-8.05之間；(4)、稱取BSA3g倒入上述IL容器中；(5)、最後IL容器定容至1000ml,用0.2um濾器過濾；過濾完後貼好標籤於2_8°C冷庫貯存；二、磁分離試劑的製備(1)、將1.0mg辛二酸二琥珀醯亞胺酯溶於50ulDMS0中，取2mg抗GP73單克隆抗體溶於PH 9.5的0.lmol/L的PB緩衝液中至總體積為Iml ；(2)、確定辛二酸二琥珀醯亞`胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀醯亞胺酯加入到上述GP73單克隆抗體溶液中，置室溫90min ；(3 )、然後將抗體溶液加入到Centr i con-10濃縮管中，放入到高速冷凍離心機中在 3000g下濃縮30min至體積為0.5mI ；(4)、取0.5ml磁珠加入5ml反應杯中，放入專用試管架，經磁鐵吸附2分鐘後吸取上清；(5)、每次加入1.5ml PH9.5的0.lmol/L的PB緩衝液，混勻30秒，上架，去上清，重複操作3次；將獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻後室溫反應4小時；(6)、加入0.3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分鐘；(7)、每次加入1.5ml PH7.2的0.lmol/L的PB緩衝液清洗已經標記的磁珠，混勻30秒， 上架，去上清，重複操作3次；(8)、用100ml磁珠保存液將磁珠轉入125ml玻璃瓶，即為0.05%的GP73磁分離試劑； 磁珠保存液配方為0.1% BSA，0.05%吐溫-20，0.02% NaN3，20%乙醇，4°C保存；(9)、將獲得的磁分離試劑用磁珠緩衝液按照1:1的比例混勻，即得磁分離試劑；步驟二、酶反應物的製備步驟三、反應增強劑的配製(I)、稱取TRIS1.56g和NaCl 4.23g於IL容器中；用移液器將Proclin-300量取0.2ml 於IOml純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL容器中；(2)、用量筒量取800ml純化水於上述IL容器中，充分攪拌直至完全溶解，然後調PH 值，控制PH在7.35-7.45之間；(3)、稱取Mak330.9g於上述IL容器中；最後定容至1000ml,完全溶解後,用0.2um濾器過濾；步驟四、校準品稀釋液的配製步驟五、校準品和質控品的配製步驟六、清洗濃縮液的配製(1)、稱取Kcl4g、NaC140g、蔗糖IOg於IL容器中；(2)、稱取0.225g Tween-20於100ml容器中加15ml水使其完全溶解後，倒入上述IL容器中；(3)、用移液器將Proclin-300量取0.225ml於盛有15ml純化水的燒杯中完全溶解後， 倒入上述IL容器中；(4)、用量筒量取800ml純化水於上述IL容器中，充分攪拌直至完全溶解；(5)、調PH，控制其範圍在7.35-7.45之間；(6)、最後定容至1000ml,完全溶解後用0.2um濾器過濾即得；步驟七、底物溶液的配製所述高爾基體蛋白GP73的檢測步驟如下:(1)、加50iU高爾基體蛋白GP73校準品、質控品、待測標本至對應微孔底部；(2)、加50ii I酶反應物至每一微孔中；(3)、加50Ul反應增強劑至每一微孔中；(4)、加50ii I磁分離試劑至每一微孔中；(5)、用塑料薄膜覆蓋微孔，多管混勻器輕輕振蕩微孔板30s後，置37°C水浴30分鐘；(6)、微孔板放至磁分離器上，確保每個微孔都與分離器表面接觸，沉澱2分鐘；緩慢的倒轉分離器倒出上清液，把倒轉的微孔板連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在微孔上的所有液滴；(7)、清洗濃縮液用純化水稀釋20倍後，加200u I稀釋後的清洗液至每一微孔中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s ;加樣時應避免加樣力度過大而導致磁珠濺出，且混勻要徹底；(8)、重複步驟(6)、(7)、(6)—遍；(9)、加IOOiU底物溶液至微孔中混勻3秒，迅速用準備好的發光檢測儀進行檢測；(10)、以校準品濃度的Log值為橫坐標，RLU的Log值為縱坐標繪製出標準曲線(雙對數曲線)，以各待測血清RLU值在標準曲線上查出該血清的GP73的濃度，其中縱坐標為發光強度，橫坐標為GP73濃度(單位為ng/ml )。
3.根據權利要求2所述的一種高爾基體蛋白GP73定量測定試劑盒及其檢測方法，其特徵在於所述底物溶液的製備包括以下步驟:一、底物溶液A的配製步驟(1)、稱取硼砂5.721g、硼酸2.474g、魯米諾1.0g和對碘苯酚0.1mg於IL燒杯中；(2)、用量筒量取400ml純化水於IL燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調PH，控制其範圍在 7.95-8.05 之間；(3)、用0.2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至500ml，混勻後即得；二、底物溶液B的配製(I)、稱取硼砂5.721g、硼酸2.474g、過氧化脲0.1g和PC300 250ul於IL燒杯中；(2 )、用量筒量取400ml純化水於IL燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調PH控制其範圍在 7.95-8.05 之間；(3)、用0.2um濾器過濾收集濾液,用純`化水定容至500ml,混勻後即得。
【文檔編號】G01N33/531GK103499692SQ201310444307
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月26日 優先權日:2013年9月26日
【發明者】奚偉紅, 王布強, 王京, 嚴子禾, 高淑舫, 高磊 申請人:江蘇福隆生物技術有限公司