人精子特異性轉移因子口服製劑及其製備工藝的製作方法
2023-05-29 19:04:26 4
專利名稱：人精子特異性轉移因子口服製劑及其製備工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是涉及人精子特異性轉移因子口服製劑及其製備工藝。
背景技術：
隨著人口的不斷增長，許多國家都制定和頒布了適合本國國情的計劃生育政策以控制人口的增長速度，在此背景下，節育或避孕成為人們研究的熱點課題之一。傳統的措施由於存在許多弊端而受到人們的排斥和反對，如避孕環由於容易脫落、結紮造成人體損傷、避孕藥具有副作用、保險套影響感覺等。於是，研究一種無損傷、可復性的避孕產品成為當代人迫切的需要，免疫避孕的理念隨之產生，並迅速成為生殖與避孕領域的研究熱點。目前，研究者根據存在於生殖系統的多種抗原，已經研製出許多避孕疫苗。SP-10是一種特異性表達於睪丸組織的蛋白，定位於精子頂體內膜和赤道區域，可能參與頂體反應和精卵結合。Kurth等利用重組SP-10蛋白抗原免疫雌性狒狒、短尾猴，結果發現其生殖道和血清中均產生高滴度的特異性抗體，體外實驗顯示該抗體可特異性的與精子頂體的SP-10結合，幹擾精卵融合。人精子上有一種與精卵融合有關的免疫球蛋白超家族蛋白(Izumo),Naz等將抗人Izumo抗體與倉鼠精子共孵育，再將孵育後的精子與鼠卵融合，結果發生精卵融合障礙，接種Izumo蛋白的雌鼠生殖道和血清中也會產生高滴度的抗體，使得其生育力下降。Eppin蛋白是近年來新發現的一種可由睪丸和附睪分泌的特異性蛋白，可通過特異性位點結合於精子表面，參與調控精液液化和精子運動。體外實驗表明抗Eppin抗體會干擾PSA對精囊凝固蛋白的水解，導致精液固化異常，影響精子前向運動和結合卵細胞，故可作為避孕的候選疫苗。除此之外，還有針對P18、LDH-C4、SPRASA, rSMP_B、CABYR、E_3、TSA-I等抗原的避孕疫苗，但無論哪種疫苗，綜歸起來具有一個明顯的缺點，即免疫原性較弱，持續時間短，需要不斷注射方可維持抗體濃度。因此，研究一種可用於增強機體對避孕疫苗免疫應答的佐劑成為必要。特異性轉移因子(specific transfer factor, STF)是採用某種特定病原免疫動物後，取其脾臟或外周血淋巴細胞製備的具有針對該抗原特異活性的小分子物質，其主要成分是核苷酸、多肽，並含有18種游離胺基酸，包括人體必需的8種胺基酸，以及6種微量元素。STF最突出的特點是無免疫原性，無種屬特異性，即由某一種屬動物製備的STF，可轉移免疫活性給另一種屬的動物而不會發生超敏反應。
發明內容
本發明的目的在於，克服現有技術的不足之處，提供一種涉及人精子特異性轉移因子口服製劑的研製工藝，為人類避孕節育提供一種有效的免疫佐劑。本發明所述的人精子特異性轉移因子口服製劑及其製備工藝，採用以下技術方案
I.免疫原的製備
取健康人的精子，以無菌生理鹽水洗滌3次後，配製成濃度為4. OX 106/ml的混懸液，在_4°C以超聲細胞粉碎儀破碎完全，儲存於_20°C冰箱，備用。
2.免疫動物
(I)免疫前觀察及檢測
免疫前3d，5隻白兔均精神好、進食正常、無腹瀉；抽取靜脈血，以試管凝集法檢測布氏桿菌抗體，效價均小於I :80。(2)免疫白兔
以配製好的人精子抗原懸液免疫白兔，每周一次，免疫方式為背部、腹部、頸部及腋下多點皮下注射。第一次免疫劑量為免疫原Iml+弗氏完全佐劑0. 5ml+弗氏不完全佐劑
0.5ml ;第二次和第三次僅注射2ml精子抗原懸液；第四次、第五次也是僅注射4ml精子抗原懸液。(3)—般情況觀察
每天觀察免疫後白兔的精神、進食、有無腹瀉等狀況，以及注射局部有無潰瘍、壞死。(4)抗體效價檢測
末次免疫後一周，抽取白兔靜脈血，以試管凝集試驗檢測血清中的精子抗體效價，達到I 1280為免疫成功。3.製備人精子特異性轉移因子
(I)取材、勻漿末次免疫後第10天處死白兔，取脾臟及淋巴結置於_20°C冰箱備用。取免疫的白兔脾臟，剪去筋膜和大血管，用無菌生理鹽水衝洗，以12000r/min低溫勻漿2次，每次lmin，製備勻漿液。(2)破碎、凍融、透析將勻漿液置於滅菌塑料離心管中，用超聲細胞破碎儀破碎，取破碎液計數殘存細胞，鏡檢確定破碎完全後，則將其置於冰箱冷凍4 6h，然後取出置於37°C水浴，完全融解後再冷凍，連續6次，最後裝入IOKD透析袋中，以兩倍量的無菌雙蒸水透析48小時，24小時換液一次，期間振動透析袋6次，收集透析液，以0. 22 y m濾器過濾除菌。(3 )檢定和分裝多肽含量測定(改良Lowry法)後,按lmg/ml多肽為I個單位,每小瓶分裝2ml。儲存於-20°C冰箱備用。本發明所述人精子特異性轉移因子口服製劑及其製備工藝具有以下特點
(1)以健康人精子無菌洗滌後配製成一定濃度作為免疫原免疫白兔，使白兔免疫系統受到人精子多種抗原的刺激，並產生相應抗體；
(2)以白兔作為免疫動物，建立抗人精子抗體的動物模型，白兔來源豐富，價格便宜也易於免疫；
(3)免疫動物的精子免疫原濃度適宜、多點皮下免疫、免疫時間適當，保證了最佳的免疫效果；
(4)製備的人精子特異性轉移因子具有轉移對人精子特異性應答信息的活性，能夠增強人免疫系統對精子抗原的特異性免疫應答能力，沒有種屬特異性，不會引起超敏反應；
(5)製備的人精子特異性轉移因子製劑通過口服途徑使用，方便、有效。本發明所述的人精子特異性轉移因子口服製劑及其製備工藝，包括製備免疫原、動物體內免疫、製備人精子特異性轉移因子等步驟。本口服製劑具有轉移細胞免疫信息、介導細胞免疫反應、特異性地抑制和殺傷人精子的功能，並且能增強非特異性免疫功能；該口服製劑服用無過敏反應，實用安全，效果明顯，使用後不會產生抗藥性；本產品採用口服給藥途徑，服用不受條件的限制，既方便，又不影響有效成分本身的生物學活性，是一種安全、有效的製劑，具有潛在的社會價值和市場應用前景。
具體實施例方式本發明所述的人精子特異性轉移因子口服製劑及其製備工藝，具體實施例如下
I.免疫原的製備
取健康人的精子，以無菌生理鹽水洗滌3次後，配製成濃度為4. OX 109/ml的混懸液，在_4°C以超聲細胞粉碎儀破碎完全，儲存於_20°C冰箱，備用。2.免疫動物
(I)免疫前觀察及檢測
免疫前3天，5隻白兔均精神好、進食正常、無腹瀉；抽取靜脈血，以試管凝集法檢測布氏桿菌抗體，效價均小於I :80。(2)免疫白兔
以配製好的人精子抗原懸液免疫白兔，每周一次，免疫方式為背部、腹部、頸部及腋下多點皮下注射。第一次免疫劑量為免疫原Iml+弗氏完全佐劑0.5ml+弗氏不完全佐劑0. 5ml ;第二次和第三次僅注射2ml精子抗原懸液；第四次、第五次也是僅注射精子抗原懸液，劑量為4ml。(3)—般情況觀察
每天觀察免疫後白兔的精神、進食、有無腹瀉等狀況，以及注射局部有無潰瘍、壞死。(4)抗體效價檢測
末次免疫後一周，抽取白兔靜脈血，以試管凝集試驗檢測血清中的精子抗體效價，達到I 1280為免疫成功。3.製備人精子特異性轉移因子
(I)取材、勻漿末次免疫後第10天處死白兔，取脾臟及淋巴結置於_20°C冰箱備用。取免疫的白兔脾臟，剪去筋膜和大血管，用無菌生理鹽水衝洗，以12000r/min低溫勻漿2次，每次lmin，製備勻漿液。(2)破碎、凍融、透析將勻漿液置於滅菌塑料離心管中，用超聲細胞破碎儀破碎，取破碎液計數殘存細胞，鏡檢確定破碎完全後，則將其置於冰箱冷凍4 6h，然後取出置於37°C水浴，完全融解後再冷凍，連續6次，最後裝入IOKD透析袋中，以兩倍量的無菌雙蒸水透析48小時，24小時換液一次，期間振動透析袋6次，收集透析液，以0. 22 y m濾器過濾除菌。(3)檢定和分裝多肽含量測定(改良Lowry法)後,按lmg/ml多肽為I個單位,每小瓶分裝2ml。儲存於-20°C冰箱備用。本發明產品的檢定
I.理化性質檢定 (I)外觀微黃色、清晰透明的液體。(2) PH值經奧力龍-818 PH計測定，PH為6. 8 7. 2。(3)最大吸收波長258±6 nm。
(4)蛋白質試驗20%磺基水楊酸法檢測，結果為陰性。(5)無菌試驗合格。(6)熱原質試驗合格。(7)安全試驗合格。(8)核糖含量苔黑酚顯色法測得含量為0. 717±0. 043 mg/ml。(9)多肽含量改良Lorry法檢測多肽含量為2. 34±0. 31 mg/ml。(10)胺基酸含量採用色譜分析法，以胺基酸儀測得人精子特異性轉移 因子含有17種胺基酸，各胺基酸含量不盡相同，其中以甘氨酸含量最高，半胱氨酸含量最低(如表I所示)。表I 人精子特異性轉移因子的胺基酸含量(Pg/ml)
mm 含量 sm 含量 mm 含量 Sm 含量 mm 含量 精氨酸 11.4 絲氨酸 8.8 苯丙氨酸 11.6糹顏氨酸 13.7 甘氨酸 38.8 賴氨酸 33.1 脯氨酸 9.9 穀氨酸 36.3 組氨酸 7.9 甲硫氨酸3.4 丙氨酸 22.7 異亮氨酸8.4 天冬氨酸7.9 絡氨酸 13.1 半胱氨酸2.2 蘇氨酸 3.6 亮氨酸 ld5
2.免疫學活性檢定
抽取健康成人人靜脈血10 ml，常規方法分離淋巴細胞，分別配製3X 106/ml、5X106/ml的淋巴細胞懸液。(I)淋巴細胞增殖試驗
取濃度為3 X 106/ml的100 W淋巴細胞懸液，加入96孔板的7孔中，前6孔再加入50W PHA, 50 W適宜濃度的人精子抗原混懸液和50耵人精子特異性轉移因子，第七孔加入100耵細胞懸液，然後以含20%小牛血清的RPMI 1640細胞培養液補足至300 W，每孔同時作2個復孔，在37°C，5% C02條件下培養68 h,再加入20 MTT和200 DMSO, 20分鐘後以雙波長(450nm和630nm)測定每孔的光密度(optical density, OD值),根據以下公式計算刺激指數(stimulation index, SI) SI = OD實驗/OD對照。結果與對照相比，人精子特異性轉移因子能夠顯著促進淋巴細胞的增殖，且刺激活性具有劑量依賴性的特點，在多肽含量為0. 63 mg/ml時，刺激指數最大(SI=L 84)，隨著濃度的增高，活性反而降低。(2)白細胞粘附抑制試驗
取濃度為5X 106/ml的100 W淋巴細胞懸液，加入到96孔板的9孔中，前6孔均再加入多肽濃度為0. 63 mg/ml的人精子特異性轉移因子50 W，後3孔加入10%小牛血清的RPMI 1640細胞培養液50 W，在37°C，5% C02條件下培養2h，前3孔加入50耵適宜濃度的人精子抗原混懸液和50 W PHA,後6孔則加入50 W PHA和10%小牛血清的RPMI 1640細胞培養液50耵，繼續培養2h，然後吸取上清液，加入180 W不含小牛血清的RPMI-1640培養液和20 m MTT,孵育4h，再加入20 DMSO，20min後以雙波長(450nm和630nm)測OD值，根據以下公式計算粘附抑制率(leukocyte adhesion inhibition rate ，LAIR) LAIR=[(OD 對照-OD 實驗)/OD 對照]X 100%。結果經與人精子特異性轉移因子共孵育後，白細胞粘附抑制率為37. 7%，顯著高於僅用人精子抗原或PHA刺激的粘附抑制率，且差異具有統計學意義(P〈0. 05)。
(3)免疫調節功 能檢測
取濃度為5X 106/ml的100 W淋巴細胞懸液，加入到96孔板的9孔中，前3孔作為實驗孔，加入多肽濃度為0. 63 mg/ml的人精子特異性轉移因子50 W，中間3孔和後3孔分別作為對照I和對照2，均加入10%小牛血清的RPMI 1640細胞培養液50 W，在37°C，5%C02條件下培養2h，然後向實驗孔和對照I孔加入50 W人精子抗原混懸液，對照3孔則再加入50 W10%小牛血清的RPMI 1640細胞培養液，繼續培養2h，收集上清液，以ELISA方法檢測IL-4、y-IFN.IL-21的濃度。結果在人精子特異性轉移因子作用下，淋巴細胞培養上清的Y-IFN濃度為(595± 118)pg/ml，IL-21 濃度為 403± 147 pg/ml，顯著高於兩對照組(P〈0. 05), M IL-4 水平差異無統計學意義(P>0. 05)。
權利要求
1.人精子特異性轉移因子口服製劑及其製備工藝，其特徵在於採用以下技術方案 免疫原的製備 取健康人的精子，以無菌生理鹽水洗滌3次後，配製成濃度為4. O X 106/ml的混懸液，在_4°C以超聲細胞粉碎儀破碎完全，儲存於_20°C冰箱，備用； 免疫動物 (1)免疫前觀察及檢測 免疫前3d，5隻白兔均精神好、進食正常、無腹瀉；抽取靜脈血，以試管凝集法檢測布氏桿菌抗體，效價均小於1:80; (2)免疫白兔 以配製好的人精子抗原懸液免疫白兔，每周一次，免疫方式為背部、腹部、頸部及腋下多點皮下注射，第一次免疫劑量為免疫原Iml+弗氏完全佐劑0. 5ml+弗氏不完全佐劑0.5ml ;第二次和第三次僅注射2ml精子抗原懸液；第四次、第五次也是僅注射4ml精子抗原懸液； (3)—般情況觀察 每天觀察免疫後白兔的精神、進食、有無腹瀉等狀況，以及注射局部有無潰瘍、壞死； (4)抗體效價檢測 末次免疫後一周，抽取白兔靜脈血，以試管凝集試驗檢測血清中的精子抗體效價，達到I 1280為免疫成功； 製備人精子特異性轉移因子 (1)取材、勻漿末次免疫後第10天處死白兔，取脾臟及淋巴結置於_20°C冰箱備用； 取免疫的白兔脾臟，剪去筋膜和大血管，用無菌生理鹽水衝洗，以12000r/min低溫勻漿2次，每次lmin，製備勻漿液； (2)破碎、凍融、透析將勻漿液置於滅菌塑料離心管中，用超聲細胞破碎儀破碎，取破碎液計數殘存細胞，鏡檢確定破碎完全後，則將其置於冰箱冷凍4 6h，然後取出置於37°C水浴，完全融解後再冷凍，連續6次，最後裝入IOKD透析袋中，以兩倍量的無菌雙蒸水透析48小時，24小時換液一次，期間振動透析袋6次，收集透析液，以0. 22 y m濾器過濾除菌； (3)檢定和分裝多肽含量測定(改良Lowry法)後,按lmg/ml多肽為I個單位，每小瓶分裝2ml ;儲存於_20°C冰箱備用。
全文摘要
一種人精子特異性轉移因子口服製劑及其製備工藝，該工藝主要包括製備免疫原、動物體內免疫、製備人精子特異性轉移因子等步驟。本口服製劑具有轉移細胞免疫信息、介導細胞免疫反應、特異性地抑制和殺傷人精子的功能，並且能增強非特異性免疫功能；該口服製劑服用無過敏反應，實用安全，效果明顯，使用後不會產生抗藥性；本產品採用口服給藥途徑，服用不受條件的限制，既方便，又不影響有效成分本身的生物學活性，是一種安全、有效的製劑，具有潛在的社會價值和市場應用前景。
文檔編號A61P15/18GK102626422SQ20121011227
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月17日 優先權日2012年4月17日
發明者周建偉, 孔翠 申請人:周建偉