一種具有降血糖活性和透皮能力的重組融合蛋白、編碼基因及其應用的製作方法
2023-05-29 17:38:22
本發明涉及一種具有透皮吸收作用和降血糖作用的融合蛋白及其編碼基因與應用，屬於生物技術領域。
背景技術：
糖尿病是一類以高血糖為特徵的代謝性疾病，多發於40歲以上的中老年人群。世界衛生組織數據顯示全世界目前現有3.47億糖尿病患者，預測到2030年，糖尿病將成為全球第七大死亡原因。我國是全球糖尿病第一大國，目前有超過9200萬的糖尿病患，另外還有1億5000人將成為患者。無論是糖尿病的傳統治療藥物胰島素，還是新型藥物如艾塞那肽都需要每天兩到三次注射給藥，患者順應性差。改變肽類降糖藥物給藥方式，提高患者順應性，成為目前糖尿病治療領域的研究熱點，具有廣闊的市場前景。
透皮給藥系統，即經皮治療系統，是藥物通過皮膚吸收的一種給藥方法，是近年來國內外藥劑學研究的熱點。經皮給藥是一種理想的給藥方式，具有許多顯著的優勢。有學者利用離子導入、超聲技術等方法對胰島素透皮吸收進行了研究，在一定程度上促進了蛋白質透皮吸收的研究。但是物理方法促滲一般需要較大的配套儀器，而目前用於小分子促滲的化學促滲劑又具有一定細胞毒性，限制這兩種方法在上的臨床上的使用。細胞穿膜肽具有安全，有效且簡單易行等優點，成為了近些年來透皮給藥系統的研究熱點。
艾塞那肽(Exendin-4)又稱促胰島素分泌肽，是從生長在美國兩部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥唾液中發現的一種胰高血糖素素樣肽(GLP-1)類似物，由39個胺基酸組成，與GLP-1有53％的同源性，屬於小分子多肽類激素。其作用方式與GLP-1類似，在進食後可以促進胰島素分泌及激活胰島素前體基因轉錄，具有穩定性好、半衰期長的優點，在糖尿病等治療方面具有廣闊的前景。Exendin-4於2005經美國FDA批准上市，2009年在中國獲批上市。豐富的臨床使用經驗證實Exendin-4能達到與胰島素治療相似的血糖控制效果；而且與甘精胰島素和雙時相門冬胰島素相比，艾塞那肽能更嚴格地控制餐後血糖，低血糖反應少且有減輕體重的優勢。
人類免疫缺陷病毒HIV-I的轉錄活化因子TAT(HIV trans-activator of transcription)是目前研究最成熟的細胞穿膜肽，1988年美國兩個獨立的課題研究組同時報導了這種多肽，其獨特的細胞穿膜能力引起起了科學界對於TAT功能研究的熱潮。至今為止TAT穿膜肽已經被用於多種蛋白、脂質體、納米顆粒傳遞、基因治療、反義寡核苷酸等多個領域的研究。作為細胞穿膜肽的典型代表，TAT穿膜肽提供了一種無毒且高效的通過皮膚屏障的方法，對於大分子藥物透皮給藥系統具有一定的實際應用價值。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種具有透皮吸收作用和降血糖作用的融合蛋白及其編碼基因與應用。
一種融合蛋白，為如下(1)(2)(3)所示：
(1)SEQ ID No.5所示蛋白；
(2)SEQ ID No.5所示蛋白的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的胺基酸序列；
(3)SEQ ID No.5所示蛋白，其特徵在於，所示融合蛋白是通過linker將艾塞那肽和TAT穿膜肽連接。
上述蛋白的編碼基因也屬於本發明保護範圍
上述編碼基因中，所述編碼基因應為如下至少一種：
(1)SEQ ID No.4所示的DNA序列；
(2)與(1)限定的DNA序列具有90％以上同一性且編碼權利1所述蛋白的DNA序列。
(3)在嚴格條件下與(1)或(2)限定的DNA序列分子雜交且編碼權利要求書1所述蛋白質的DNA序列。
含上述任一所述編碼基因的的重組表達載體、轉基因細胞系、表達盒或重組菌也在保護範圍內。
本蛋白除了通過基因工程方法(上述)來獲得之外，也可以通過芴甲氧羰基法和叔丁氧羰基法等化學法合成，或通過肽合成儀進行合成。
一種製備上述蛋白的方法也在保護範圍內，該方法是將所述的編碼基因導入原核細胞進行表達。
在上述方法中，所述編碼基因是通過重組表達載體導入的，所述的重組表達載體是將權利要求2或3所述的編碼基因插入pET22b(+)的多克隆位點得到的，具體是將權利要求2或3所述的編碼基因插入pET22b(+)的Nde I和Hind III位點間得到的。
所述原核細胞為大腸桿菌，具體為大腸桿菌BL21(DE3)。
上述所述任一方法中，所述表達之後還包括將細胞破碎、離心取上清和、將上清進行分離純化的步驟。
上述所述方法中，所述的細胞破碎為超聲破碎。
所述的上清分離純化依次進行鹽析、除鹽、陽離子交換層析、凝膠層析。
上述融合蛋白或上述任一編碼基因編碼的蛋白通過皮膚塗抹給藥在降低血糖方面的應用。
上述融合蛋白或上述任一編碼基因編碼的蛋白通過皮膚塗抹給藥在改善II型糖尿病患者的血糖控制中的應用。
上述融合蛋白或上述任一編碼基因編碼的蛋白通過皮膚塗抹給藥在用於單用二甲雙胍、磺醯脲類.以及二甲雙胍合用磺醯脲類，血糖仍控制不佳的患者的治療方面的應用。
上述融合蛋白或上述任一編碼基因編碼的蛋白通過皮膚塗抹給藥在超重II型糖尿病患者接受胰島素治療前的應用。
附圖說明
圖1：TAT-艾塞那肽融合蛋白基因瓊脂糖凝膠電泳圖。
泳道M：DNA marker，泳道1：回收168bpTAT-艾塞那肽融合蛋白基因
圖2：TAT-艾塞那肽融合蛋白表達及純化後SDS-PAGE電泳圖
泳道M：蛋白marker，泳道1：TAT-艾塞那肽融合蛋白在大腸桿菌中表達電泳圖，泳道2：TAT-艾塞那肽融合蛋白最終純化結果
圖3：不同濃度TAT-艾塞那肽融合蛋白刺激MIN6細胞分泌胰島素結果：隨著TAT-艾塞那肽融合蛋白濃度的提高，MIN6細胞分泌胰島素的量逐漸增加，且成明顯的劑量相關性。證明TAT-艾塞那肽融合蛋白具有和艾塞那肽相同的生物活性，能有效增加MIN6細胞胰島素分泌量。
圖4：TAT-艾塞那肽融合蛋白對大鼠血糖的調節作用結果
實驗組，■對照組，▲
與對照組相比，TAT-Exendin-4融合蛋白在皮膚塗抹給藥後可以達到一定的降血糖療效。後續還需對塗抹劑量進行摸索，使得獲得更加的治療效果。
具體實施方式
下述實例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料，試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
下述實例中的定量實驗，均設置三次重複，結果取平均值。
實施例1重組融合蛋白pET22b-TAT-Exendin-4載體的構建。
委託南京金斯瑞生物科技有限公司通過化學合成法合成含有TAT-Exendin-4的目的基因，並插入到PET22b質粒中。
實例2重組融合蛋白TAT-Exendin-4在大腸桿菌BL21中重組表達。
使用《分子克隆》(盧聖棟編)中所述的標準方法將連接混合物轉入大腸桿菌宿主菌BL21。
在含有AMP的抗性的LB平板上進行轉化，經過12-16小時的生長，挑取單克隆轉化菌落，在含有AMP抗性的LB液體培養基中過夜培養，進行菌落PCR初步篩選出陽性克隆，經測序確定含有TAT-Exendin-4的陽性重組質粒中的TAT-Exendin-4融合蛋白序列與理論完全一致。
將上述測序正確的BL21表達重組菌，按照1％的甘油管接種量接入含有終濃度為100μg/ml AMP抗性的LB培養基中，在37℃，220rpm搖床中培養至OD600約為1.7時，加入終濃度為0.2μM的IPTG進行TAT-Exendin-4的誘導表達，誘導6h後收集菌體，離心得到溼菌體，並以SDS-PAGE檢測。
將上述獲得的發酵液在8000rpm離心20min，收集菌體，菌體用50mM Tris-HCl(pH 8.0)緩衝液10ml洗滌兩次，8000rpm離心20min收集菌體，將獲得菌體用細胞裂解緩衝液100ml攪拌均勻，重懸。於冰箱-20℃中靜止過夜，而後在37℃水浴中迅速解凍，反覆凍融四次，在冰浴條件下進行超聲破壁或冷凍擠壓(功率60％、30min、超5s、間隙5s)。待破壁完全後，4℃條件下，12000rpm離心30min，離心後取上清液備用。
實例3重組融合蛋白TAT-Exendin-4的分離純化。
將實例2獲得的蛋白溶液，使用低溫冷凍離心機在4℃條件下、12000rpm離心30min，收集上清。在冰浴條件下向上清液中緩慢加入20％硫酸銨粉末，冰箱4℃放置過夜，低溫冷凍離心機4℃，12000rpm離心30min。將沉澱用50mM Tris-HCl(pH 8.0)緩衝液復溶，再次4℃，12000rpm離心30min，取上清液。獲得的上清液使用Sephadex G-15凝膠柱進行凝膠層析，使用50mM Tris-HCl(pH 8.0)的緩衝液進行洗脫，收集含有蛋白質的組分。將獲得目的蛋白使用Capto-MMC弱陽離子交換柱進行陽離子交換，先用50mM Tris-HCl(pH 8.0)的緩衝液衝洗，再用含0-2M NaCl的50mM Tris-HCl(pH 8.0)的緩衝液在五個柱體積內進行梯度洗脫並收集含有融合蛋白的組分。將上述收集的融合蛋白組分使用Sephadex G-50凝膠柱進行凝膠層析，使用50Mm Tris-HCl(pH 8.0)的緩衝液進行洗脫，收集含有融合蛋白的組分。使用SDS-PAGE凝膠電泳掃描和反相HPLC對蛋白純度進行檢測。
結果表明經SDS-PAGE凝膠電泳鑑定，只有單一的目的條帶，結果如圖一所示。經反相HPLC鑑定，蛋白純度達到90％以上。採用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度後，將蛋白儲存在-80℃。
實例4重組融合蛋白TAT-Exendin-4促進細胞胰島素分泌測定實驗。
將MIN6細胞培養至長滿單層，胰蛋白酶處理約1-2min，待其中90％左右的細胞形態變化後加入3mL細胞培養基，吹打細胞至勻，並轉移至離心管中，800rpm離心5min，棄去上清液，在沉澱中加入一定量細胞培養基吹打均勻。處理好的細胞接種於24孔板中，控制細胞數為每孔2×105個左右。當細胞長滿單層後換用無血清的培養基培養2h，每孔分別加入終濃度分別為0μg/ml、2μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、200μg/ml純化後的TAT-Exendin-4融合蛋白和8mM的葡萄糖溶液，每個濃度設3個復孔，繼續培養2h後，用鼠Insulin ELISE測定試劑盒檢測MIN6細胞分泌胰島素的水平。結果表明，重組融合蛋白TAT-Exendin-4刺激INS-1/MIN6後，細胞分泌胰島素水平呈現明顯的量效關係，隨著TAT-Exendin-4濃度增加，細胞分泌胰島素量明顯增加，且增加量與融合蛋白用量呈正相關。
實例5重組融合蛋白TAT-Exendin-4對大鼠血糖的調節作用結果
隨機選取12隻體重200g左右的大鼠，小劑量(50mg/kg)鏈脲佐菌素連續腹腔注射4天，誘導構建T2D模型小鼠。選擇10隻構建成功的T2D鼠模型隨機分成兩組，其中一組為實驗組，一組為對照組(n＝5)。通過皮膚處理清除2cm×2cm的毛髮，過夜斷食後，實驗組在裸露部分塗抹50ug溶於生理鹽水的純化後的融合蛋白，對照組在在裸露部分塗抹相等體積的生理鹽水，分別在加藥0h、2h、4h、6h、8h、10h後進行尾靜脈取血，取血後，使用羅氏血糖儀測定大鼠血糖水平，具體操作按羅氏血糖儀標準使用方法進行。結果表明，與對照組相比實驗組血糖水平在2h開始下降，在6時達到最低，10小時後，血糖濃度基本恢復到給藥前水平。實驗結果證明TAT-Exendin-4融合蛋白在皮膚塗抹給藥後可以達到一定的降血糖療效。