一種檢測類風溼關節炎的膠體金免疫層析試劑盒及其製備方法與流程
2023-06-07 08:52:26
本發明涉及骨科疾病檢測技術領域，具體涉及一種檢測類風溼關節炎的膠體金免疫層析試劑盒。
背景技術：
類風溼關節炎的病因至今並不十分明了，目前大多認為其是人體自身免疫性疾病，亦可視為一種慢性的症候群，表現為外周關節的非特異性炎症，此時患病關節及其周圍組織呈現進行性破壞，並致使受損關節發生功能障礙。類風溼關節炎的發病率女性高於男性，女性是男性的2～3倍，歐美國家的發病率明顯高於國人。其臨床症狀和體徵特點有：疼痛、僵硬、腫脹、畸形、皮下結節、體溫升高等。本病早期即有關節局部痛感，尤其是在活動期，並伴有觸痛及壓痛，此為最早出現、也是患者最敏感的體徵；在晨起時會有受累關節僵硬症狀，且受累關節周圍軟組織呈瀰漫性腫脹，表面溫度略高於正常關節；後期病例一般均出現掌指關節屈曲及尺偏畸形；30％～40％的患者可出現皮下結節，此有助於對本病的診斷；急性期的某些患者可出現發熱，多為38℃以下的低熱。本病早期可通過藥物療法和物理理療進行治療，後期嚴重患者需進行手術治療，故對本病進行早期診斷，有利於其積極有效的治療。
目前，具有與類風溼關節炎相類似症狀及體徵的疾病很多，如骨性關節炎、痛風、銀屑病性關節炎等。類風溼性關節炎目前的檢查方法包括實驗室檢查，X線檢查等，也有免疫球蛋白(IgM，IgG)檢查，具有一定的診查效果，但準確率不高。抗RA33是一種分子量33KD的核酸結合蛋白，在早期類風溼關節炎病人血清中出現；抗角蛋白抗體(AKA)在研究中發現其陽性患者幾乎均發展成類風溼關節炎，故可作為類風溼關節炎的早期診斷指標；免疫球蛋白IgG在一些病程長，病情重的患者血清中有很明顯高比例，對類風溼關節炎病程及病情的診斷具有很好的參考價值，故研究一種更加準確的免疫檢測類風溼關節炎的方法，就是本發明要研究的問題。
技術實現要素：
本發明解決的技術問題就是提供一種檢測類風溼關節炎的膠體金免疫層析試劑盒。
本發明的技術方案為：一種檢測類風溼關節炎的膠體金免疫層析試劑盒，包括試紙條、微孔條、微孔試劑和微孔塞，所述試紙條由樣品吸收墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、PVC底板相互粘貼製成；所述硝酸纖維素膜上包被有檢測線1、檢測線2、檢測線3和一條質控線，所述檢測線1包被有抗RA33特異性抗體，所述檢測線2包被有抗角蛋白特異性抗體(AKA)，所述檢測線3包被有抗免疫球蛋白IgG抗體，所述質控線包被有羊抗鼠IgM單克隆抗體；所述微孔試劑為凍幹的納米金標記的抗RA33特異性抗體、納米金標記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和納米金標記的抗免疫球蛋白IgG抗體。
進一步的，所述微孔條底部含有凍幹的納米金標記的抗RA33特異性抗體、納米金標記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和納米金標記的抗免疫球蛋白IgG抗體的微孔試劑，所述微孔條上具有微孔塞，所述微孔塞能夠緊密地塞在微孔條中。
進一步的，所述抗RA33特異性抗體為來自HeLa細胞的單克隆抗體，所述抗角蛋白特異性抗體(AKA)為角蛋白與載體蛋白偶聯物為免疫原製備的單克隆抗體，所述抗免疫球蛋白IgG抗體為抗免疫球蛋白的單克隆抗體。
進一步的，述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或人血清白蛋白。
進一步的，所述樣品吸收墊經處理液處理，所述處理液是由1.5g牛血清蛋白(BSA)和1.2g氯化鈉，1g的海藻糖用0.01mol/LPBS定容至100mL。
進一步的，所述的膠體金標記抗體的製備方法為：
a.所述膠體金溶液的製備方法為：將質量濃度為0.01％的氯金酸溶液200ml，加熱至沸騰後迅速加入2ml濃度為1％的檸檬酸三鈉水溶液，加熱煮沸10min，冷卻後以蒸餾水恢復到原體積，得到膠體金溶液；
b.將製備好的膠體金溶液取出10mL的量共3份，取抗RA33特異性抗體、抗角蛋白特異性抗體(AKA)和抗免疫球蛋白IgG抗體各40μg分別加入上述所取的三份膠體金溶液中，攪拌，再分別加入質量濃度為5％的胎牛血清，其加入量為使總溶液最終濃度為0.9％，先以350r/min的轉速低速離心8min，再以2000r/min的轉速高速離心15min，取上清液，4℃下保存，即得到純化的膠體金標記的抗RA33特異性抗體、膠體金標記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和抗膠體金標記的免疫球蛋白IgG抗體。
進一步的，所述硝酸纖維素膜的包被方法為：在硝酸纖維素膜特定位置上劃出檢測線1，檢測線2，檢測線3和質控線的位置，檢測線1上噴塗包被有膠體金標記的抗RA33單克隆抗體，其包被量為30-40μg，檢測線2上噴塗包被有膠體金標記的抗角蛋白單克隆抗體，其包被量為30-40μg，檢測線3上噴塗包被有膠體金標記的抗免疫球蛋白IgG單克隆抗體，其包被量為25-35μg，質控線上噴塗包被有羊抗鼠IgM單克隆抗體，其包被量為25-35μg。
一種檢測類風溼關節炎的膠體金免疫層析試劑盒的製備方法為：
(1)分別製備凍幹有納米金標記的抗RA33特異性抗體、納米金標記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和納米金標記的抗免疫球蛋白IgG抗體的微孔試劑，包括以下方法：a.所述膠體金溶液的製備方法為：將質量濃度為0.01％的氯金酸溶液200ml，加熱至沸騰後迅速加入2ml濃度為1％的檸檬酸三鈉水溶液，加熱煮沸10min，冷卻後以蒸餾水恢復到原體積，得到膠體金溶液；b.將製備好的膠體金溶液取出10mL的量共3份，取抗RA33特異性抗體、抗角蛋白特異性抗體(AKA)和抗免疫球蛋白IgG抗體各40μg分別加入上述所取的三份膠體金溶液中，攪拌，再分別加入質量濃度為5％的胎牛血清，其加入量為使總溶液最終濃度為0.9％，先以350r/min的轉速低速離心8min，再以2000r/min的轉速高速離心15min，取上清液，4℃下保存，即得到純化的膠體金標記的抗RA33特異性抗體、膠體金標記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和抗膠體金標記的免疫球蛋白IgG抗體，對其進行凍幹處理即得；
(2)樣品吸收墊的製備方法：樣品吸收墊經處理液處理，所述處理液是由1.5g牛血清蛋白(BSA)和1.2g氯化鈉，1g的海藻糖用0.01mol/LPBS定容至100mL；
(3)所述硝酸纖維素膜的包被方法為：在硝酸纖維素膜特定位置上劃出檢測線1，檢測線2，檢測線3和質控線的位置，檢測線1上噴塗包被有膠體金標記的抗RA33單克隆抗體，其包被量為30-40μg，檢測線2上噴塗包被有膠體金標記的抗角蛋白單克隆抗體，其包被量為30-40μg，檢測線3上噴塗包被有膠體金標記的抗免疫球蛋白IgG單克隆抗體，其包被量為25-35μg，質控線上噴塗包被有羊抗鼠IgM單克隆抗體，其包被量為25-35μg；
(4)試紙條製備：將樣品吸收墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、PVC底板相互粘貼製成試紙條，乾燥處理即得；
(5)將微孔試劑、微孔條、微孔塞和試紙條組裝成試劑盒。
本發明的試劑盒使用方法：取血後分離得到血清，將待測血清滴加於微孔試劑中，將其混勻，靜置4min，將標有MAX標記線的一端插入上述微孔試劑中，5-10分鐘判斷結果：如果檢測線1，檢測線2和質控線均有明顯紅色顯示則判定為陽性，且為類風溼關節炎初期；如果檢測線1，檢測線2，檢測線3和質控線均有紅色顯示則判定為陽性，且為中晚期；如果質控線未見顯色反應，則判斷檢測無效。
本發明的有益效果體現在：本發明通過抗RA33特異性抗體、抗角蛋白特異性抗體(AKA)、抗免疫球蛋白IgG抗體作為三重指標來檢測類風溼關節炎，抗RA33特異性抗體和抗角蛋白特異性抗體(AKA)在早期類風溼關節炎患者血清中出現，且其消長與病情和用藥無關，為類風溼關節炎的早期診斷標準，免疫球蛋白IgG在中晚期，病程長，病情重的患者中明顯升高，不僅可以對類風溼關節炎進行診斷，而且為其病情輕重，病程長短提供重要參考依據，操作簡單，靈敏度高，可用於臨床推廣。
具體實施方式
實施例：一種檢測類風溼關節炎的膠體金免疫層析試劑盒，包括試紙條、微孔條、微孔試劑和微孔塞，所述試紙條由樣品吸收墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、PVC底板相互粘貼製成；所述硝酸纖維素膜上包被有檢測線1、檢測線2、檢測線3和一條質控線，所述檢測線1包被有抗RA33特異性抗體，所述檢測線2包被有抗角蛋白特異性抗體(AKA)，所述檢測線3包被有抗免疫球蛋白IgG抗體，所述質控線包被有羊抗鼠IgM單克隆抗體；所述微孔試劑為凍幹的納米金標記的抗RA33特異性抗體、納米金標記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和納米金標記的抗免疫球蛋白IgG抗體。
其中，所述微孔條底部含有凍幹的納米金標記的抗RA33特異性抗體、納米金標記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和納米金標記的抗免疫球蛋白IgG抗體的微孔試劑，所述微孔條上具有微孔塞，所述微孔塞能夠緊密地塞在微孔條中；所述抗RA33特異性抗體為來自HeLa細胞的單克隆抗體，所述抗角蛋白特異性抗體(AKA)為角蛋白與載體蛋白偶聯物為免疫原製備的單克隆抗體，所述抗免疫球蛋白IgG抗體為抗免疫球蛋白的單克隆抗體；述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或人血清白蛋白；所述樣品吸收墊經處理液處理，所述處理液是由1.5g牛血清蛋白(BSA)和1.2g氯化鈉，1g的海藻糖用0.01mol/LPBS定容至100mL；所述的膠體金標記抗體的製備方法為：a.所述膠體金溶液的製備方法為：將質量濃度為0.01％的氯金酸溶液200ml，加熱至沸騰後迅速加入2ml濃度為1％的檸檬酸三鈉水溶液，加熱煮沸10min，冷卻後以蒸餾水恢復到原體積，得到膠體金溶液；b.將製備好的膠體金溶液取出10mL的量共3份，取抗RA33特異性抗體、抗角蛋白特異性抗體(AKA)和抗免疫球蛋白IgG抗體各40μg分別加入上述所取的三份膠體金溶液中，攪拌，再分別加入質量濃度為5％的胎牛血清，其加入量為使總溶液最終濃度為0.9％，先以350r/min的轉速低速離心8min，再以2000r/min的轉速高速離心15min，取上清液，4℃下保存，即得到純化的膠體金標記的抗RA33特異性抗體、膠體金標記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和抗膠體金標記的免疫球蛋白IgG抗體；所述硝酸纖維素膜的包被方法為：在硝酸纖維素膜特定位置上劃出檢測線1，檢測線2，檢測線3和質控線的位置，檢測線1上噴塗包被有膠體金標記的抗RA33單克隆抗體，其包被量為30-40μg，檢測線2上噴塗包被有膠體金標記的抗角蛋白單克隆抗體，其包被量為30-40μg，檢測線3上噴塗包被有膠體金標記的抗免疫球蛋白IgG單克隆抗體，其包被量為25-35μg，質控線上噴塗包被有羊抗鼠IgM單克隆抗體，其包被量為25-35μg。
一種檢測類風溼關節炎的膠體金免疫層析試劑盒的製備方法為：
(1)分別製備凍幹有納米金標記的抗RA33特異性抗體、納米金標記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和納米金標記的抗免疫球蛋白IgG抗體的微孔試劑，包括以下方法：a.所述膠體金溶液的製備方法為：將質量濃度為0.01％的氯金酸溶液200ml，加熱至沸騰後迅速加入2ml濃度為1％的檸檬酸三鈉水溶液，加熱煮沸10min，冷卻後以蒸餾水恢復到原體積，得到膠體金溶液；b.將製備好的膠體金溶液取出10mL的量共3份，取抗RA33特異性抗體、抗角蛋白特異性抗體(AKA)和抗免疫球蛋白IgG抗體各40μg分別加入上述所取的三份膠體金溶液中，攪拌，再分別加入質量濃度為5％的胎牛血清，其加入量為使總溶液最終濃度為0.9％，先以350r/min的轉速低速離心8min，再以2000r/min的轉速高速離心15min，取上清液，4℃下保存，即得到純化的膠體金標記的抗RA33特異性抗體、膠體金標記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和抗膠體金標記的免疫球蛋白IgG抗體，對其進行凍幹處理即得；
(2)樣品吸收墊的製備方法：樣品吸收墊經處理液處理，所述處理液是由1.5g牛血清蛋白(BSA)和1.2g氯化鈉，1g的海藻糖用0.01mol/LPBS定容至100mL；
(3)所述硝酸纖維素膜的包被方法為：在硝酸纖維素膜特定位置上劃出檢測線1，檢測線2，檢測線3和質控線的位置，檢測線1上噴塗包被有膠體金標記的抗RA33單克隆抗體，其包被量為30-40μg，檢測線2上噴塗包被有膠體金標記的抗角蛋白單克隆抗體，其包被量為30-40μg，檢測線3上噴塗包被有膠體金標記的抗免疫球蛋白IgG單克隆抗體，其包被量為25-35μg，質控線上噴塗包被有羊抗鼠IgM單克隆抗體，其包被量為25-35μg；
(4)試紙條製備：將樣品吸收墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、PVC底板相互粘貼製成試紙條，乾燥處理即得；
(5)將微孔試劑、微孔條、微孔塞和試紙條組裝成試劑盒。
最後應說明的是：以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換；而這些修改或者替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明實施例技術方案的精神和範圍。