反義寡核苷酸的製作方法

2023-06-04 19:05:26 1

專利名稱:反義寡核苷酸的製作方法
本發明涉及反義寡核苷酸及其在抑制I型原膠原表達中的用途。
膠原是一個密切相關蛋白的家族，具有三股螺旋蛋白結構。已經鑑定了許多膠原型(＞10)，其中I型原膠原(包括兩條α1鏈和一條α2鏈)是骨、皮膚和鍵的主要成分。
多年來已經認識到許多病理狀態是由於在瘢痕形成過程中產生過多膠原和過量的纖維組織造成的。例如，肝硬化包括兩個步驟，其中正常肝組織首先被一種病毒或被乙醇或其它毒素破壞，接著在正常肝細胞再生前，過量的膠原纖維代替了被破壞細胞。特發性肺纖維化是一種正常肺組織逐漸被過量的膠原纖維代替的致命情況。進行性系統硬化症(硬皮病)是一種常常致命的疾病，皮膚和許多內臟器官由於過量的膠原纖維沉積而變為皮革樣。在很多個體中，皮膚傷口或手術切口在肥大瘢痕和瘢痕疙瘩形成中伴隨過量的膠原沉積，出現了美容問題，有時還有更嚴重的後果。而且，過量的瘢痕形成常常在正常個體外傷和手術操作後發生。在這些和相關的情況下，一種特異性抑制膠原合成的方法和組合物將非常有益。
PCT專利申請公開號WO94/11494公開了一種DNA或RNA寡核苷酸，包括5到200個核苷酸，它與突變型膠原核苷酸序列或正常野生型膠原核苷酸序列基本互補，能夠抑制膠原基因表達。據稱優選的寡核苷酸是反義寡核苷酸。WO94/11494的實施例描述了一系列DNA寡核苷酸，其中一些是反義的，這一系列寡核苷酸是根據人I型原膠原基因(COL1A1)的proα1鏈的外顯子1的3』末端區域(從核苷酸198到222)和內含子1的起始兩個核苷酸首先合成的。發現合成的寡核苷酸對人源內部缺失突變型COL1A1基因表達的抑制能力變化很大。然而沒有證明該寡核苷酸抑制人野生型COL1A1基因表達的效力。由於人突變型和野生型COL1A1基因的RNA轉錄物的結構和構象很可能不同，不能必然認為能有效抑制突變型COL1A1基因表達的寡核苷酸也會是野生型COL1A1基因表達的有效抑制劑。
期望鑑定出能夠抑制一種野生型COL1A1基因表達的反義DNA寡核苷酸。
因此根據本發明，提供了一種反義DNA寡核苷酸，包括18到25個核苷酸，它與SEQ ID NO1中750位到3900位包括750位和3900位的核苷酸序列互補，其中SEQ ID NO1包括編碼包含根據SEQ ID NO2的胺基酸序列的多肽的核苷酸序列，該寡核苷酸能夠抑制該多肽在表達該多肽的細胞中的表達。
SEQ ID NO1與EMBL註冊號Z74615註冊的核苷酸序列等同。SEQID NO2是核苷酸序列SEQ ID NO1編碼的多肽的胺基酸序列。SEQ IDNO1編碼的多肽是野生型I型原膠原的proα1鏈的前體(「前原-α1(I)膠原」)。
根據本發明的反義DNA寡核苷酸包括18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸，優選長度為20個核苷酸。
優選反義DNA寡核苷酸與SEQ ID NO1的下列區域之一的核苷酸序列互補，區域1-750位到900位，包括750位和900位，區域2-1200位到1300位，包括1200位和1300位，區域3-1400位到1500位，包括1400位和1500位，區域4-1450位到1550位，包括1450位和1550位，區域5-1850位到2000位，包括1850位和2000位，區域6-2500位到2600位，包括2500位和2600位，區域7-2850位到2950位，包括2850位和2950位，區域8-3800位到3900位，包括3800位和3900位。
特別優選的反義DNA寡核苷酸是與SEQ ID NO1的區域2、4、6和8的核苷酸序列互補的寡核苷酸。
本發明的寡核苷酸可以通過任何本領域已知的合適方法製備。通過化學合成方法能非常方便地製備該寡核苷酸，例如，Tetrahedron Lett.，1991，32，30005-30008中描述的亞磷醯胺化學過程，用二硫化四乙基秋蘭姆對乙腈進行硫化。
本發明的寡核苷酸具有優越性，因為它們抑制野生型COL1A1基因的表達。因此它們在治療或預防由膠原纖維產生過多而引起的狀態/紊亂中有用，如，肝硬化、腎、肝和心臟纖維化、硬皮病、肥大瘢痕和瘢痕疙瘩。
因此，本發明提供了一種根據本發明用於治療的反義DNA寡核苷酸。
在另一個方面，本發明提供了根據本發明的反義DNA寡核苷酸在製備用於治療的藥物中的應用。
在本發明的說明書中，術語「治療」也包括「預防」，除非有特別的相反指示。術語「治療的」和「治療地」應據此解釋。
本發明進一步提供了一種治療患有膠原紊亂或存在膠原紊亂風險患者的膠原紊亂，或降低膠原紊亂風險的方法，包括給患者施與治療有效量的根據本發明的反義DNA寡核苷酸。
當然，對於上面提及的治療用途中使用的劑量將根據所使用的寡核苷酸、給藥方式、期望的治療和紊亂指徵而發生變化。有效的劑量是能夠將細胞中產生的膠原蛋白量抑制在可消除或減少膠原蛋白產生伴發的症狀或情況的水平。
根據本發明的寡核苷酸通常以藥物組合物的形式給予，其中寡核苷酸與一種藥學上可接受佐劑、稀釋液或載體配製而成。
因而，本發明也提供了一種藥物組合物，包括根據本發明的反義DNA寡核苷酸聯合一種藥學上可接受佐劑、稀釋液或載體。
本發明進一步提供了一種本發明藥物組合物的製備方法，包括將反義DNA寡核苷酸與一種藥學上可接受佐劑、稀釋液或載體混合。
本發明的藥物組合物可以局部給予，如，以乳劑、洗劑或軟膏的形式；或全身給予，如以藥片、膠囊、糖漿、粉劑或粒劑的形式口服給藥，或以無菌溶液或懸液的形式腸胃外途徑給藥。
現在將參考下列例證實施例來進一步解釋本發明。
實施例實施例1寡核苷酸的合成在PE生物系統394 DNA合成儀上，用TETD/乙腈硫化試劑採用亞磷醯胺化學過程進行1μm規模的硫代磷酸寡核苷酸合成。Poly-Pak TM II柱(Glen Research)純化寡核苷酸，NAPTM 10柱(Amersham PharmaciaBiotech AB)除去鹽分並用Dowex 50WX8-100離子交換樹脂(Aldrich)進行離子交換。製備的12個反義DNA寡核苷酸(ASOs)具有下列序列(5』→3』)1.GGACGACCAGGTTTTCCAGC(SEQ ID NO3)2.GCAGCACCAGCAGGGCCAGG(SEQ ID NO4)3.GCCAGGAGCACCAGGTTCAC(SEQ ID NO5)4.CTTCCTCTCCAGCAGGGCCA(SEQ ID NO6)5.GCCTTGCCGGGCTCTCCAGC(SEQ ID NO7)6.CGGGAACACCTCGCTCTCCA(SEQ ID NO8)7.GCAGGACCGACAGCGCCAGG(SEQ ID NO9)8.TCCATCTTTGCCAGCAGGAC(SEQ ID NO10)9.GGTCCCTGAGCTCCAGCCTC(SEQ ID NO11)10.TTGGCCGTCAGCACCAGGG(SEQ ID NO12)11.TTTCTCGCCAGCAGGGCCAG(SEQ ID NO13)12.CTCGATCTGCTGGCTCAGGC(SEQ ID NO14)實施例2細胞處理人細胞系WI-26在含有10％胎牛血清的Dulbecco′s改良Eagle′s培養基(DMEM)中生長。將細胞鋪在48-孔或6-孔平板(Costar，ComingInc.)上達到70-80％融合。24小時後，用預熱的DMEM洗滌細胞2次，每孔加入含有5μg/ml脂轉染試劑(Gibco BRL)或2.5μg/ml細胞轉染試劑GSV(Glen Research Ltd)的0.35ml(對於48-孔試驗)或1ml(6-孔試驗)DMEM和200nM的寡核苷酸。37℃培養4-5小時後，用預熱的DMEM洗滌細胞2次，0.35ml(48-孔平板)或1ml(6-孔平板)DMEM與20μg/ml抗壞血酸一起加入。細胞培養20小時後分析膠原水平。
實施例3蛋白分析試驗最後，去除150μl培養基，用ELISA試劑盒(Amersham PharmaciaLtd)測定分泌的I型原膠原，結果以培養基中原膠原的納克數/10,000細胞表示。為了校正細胞數量，用預熱PBS洗滌平板，胰蛋白酶處理細胞，用Coulter自動計數器計算細胞數量。對於6-孔試驗，細胞計數，用1mlTRI試劑(SIGMA Ltd)處理細胞，根據廠商說明提取蛋白和RNA。蛋白團在含蛋白酶抑制劑的1％SDS中重懸。100℃加熱30-100μg細胞蛋白5分鐘，接著在4-12％SDS聚丙烯醯胺凝膠中電泳。蛋白電轉移至硝酸纖維素膜上，並與抗人I型膠原proα1(I)鏈(從Dr Larry Fisher，NIH，美國獲得)相應合成肽的抗體雜交。用偶合HRP(Biorad Ltd)的抗-兔二抗檢測proα1(I)帶，ECL(Pierce Ltd)顯影。用GAPDH的抗體(AdvancedImmunochemicals)處理膜，測定蛋白加樣。用光密度測定法將蛋白加樣標準化至GAPDH水平。
實施例4RNA分析用TRI試劑提取RNA，0.5％SDS中重懸最終的顆粒團。根據標準步驟(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989)Molecular CloningALaboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，冷泉港，美國)，總RNA的1到3μg在甲醛變性膠中電泳。RNA轉移至Hybond-N膜(Amersham)上，使用T7聚合酶試劑盒(Amersham Pharmacia)與α1(I)cDNA放射性標記探針雜交24小時。洗滌後，濾光片曝光為X-線膠片，4-24小時後膠片顯影。用光密度測定分析法分析α1(I)轉錄物(4.8kb5.8kb)的放射自顯影圖象，用GAPDH轉錄物強度或作為內對照的28SrRNA的強度來校正RNA加樣。
結果下表I顯示有關培養基中膠原水平或膠原mRNA水平的膠原抑制平均百分比(％)。在所使用的處理細胞試驗中，培養基中測定的膠原抑制百分比與細胞內膠原mRNA水平的抑制百分比之間有很好的相關性。
表I
序列表序列表110阿斯特拉曾尼卡有限公司(AstraZeneca AB)120反義寡核苷酸130Z7061114014116014170PatentIn Ver.2.121012116728212DNA213人(Homo sapiens)220221CDS222(120)..(4511)220221信號肽222(120)..(185)300308EMBL/Z746153091996-07-014001agcagacggg agtttctcct cggggtcgga gcaggaggca cgcggagtgt gaggccacgc 60atgagcggac gctaaccccc tccccagcca caaagagtct acatgtctag ggtctagac 119atg ttc agc ttt gtg gac ctc cgg ctc ctg ctc ctc tta gcg gcc acc 167Met Phe Ser Phe Val Asp Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Thr1 5 10 15gcc ctc ctg acg cac ggc caa gag gaa ggc caa gtc gag ggc caa gac 215Ala Leu Leu Thr His Gly Gln Glu Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp20 25 30gaa gac atc cca cca atc acc tgc gta cag aac ggc ctc agg tac cat 263Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His35 40 45gac cga gac gtg tgg aaa ccc gag ccc tgc cgg atc tgc gtc tgc gac 311Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp50 55 60aac ggc aag gtg ttg tgc gat gac gtg atc tgt gac gag acc aag aac 359Asn Gly Lys Val Leu Cys Asp Asp Val Ile 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690 695 700Asn Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser705 710 715 720Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala725 730 735Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly740 745 750Ala Asp Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro755 760 765Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser770 775 780Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly785 790 795 800Asp Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro805 810 815Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala820 825 830Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly835 840 845Pro Pro Gly Pro Ile Gly Asn Val Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala850 855 860Arg Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala865 870 875 880Gly Arg Val Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly885 890 895Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly Glu900 905 910Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro915 920 925Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly930 935 940Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val945 950 955 960Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro965 970 975Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly980 985 990Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro995 1000 1005Pro Gly Glu Ser Gly Arg Glu Gly Ala Pro Ala Ala Glu Gly Ser Pro1010 1015 1020Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly025 1030 1035 1040Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro1045 1050 1055Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala1060 1065 1070Gly Pro Ala Gly Pro Val Gly Pro Val Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly1075 1080 1085Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly Asp1090 1095 1100Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly Pro Pro105 1110 1115 1120Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly1125 1130 1135Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Lys1140 1145 1150Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg1155 1160 1165Gly Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly1170 1175 1180Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe185 1190 1195 1200Leu Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr1205 1210 1215Arg Ala Asp Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp1220 1225 1230Thr Thr Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro1235 1240 1245Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met1250 1255 1260Cys His Ser Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln265 1270 1275 1280Gly Cys Asn Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly1285 1290 1295Glu Thr Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp1300 1305 1310Tyr Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu1315 1320 1325Ser Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp1330 1335 1340Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr345 1350 1355 1360Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr1365 1370 1375Met Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Lys Gly1380 1385 1390Ser Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr
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權利要求
1一種反義DNA寡核苷酸，包括18到25個核苷酸，它與SEQ IDNO1中750位到3900位包括750位和3900位的核苷酸序列互補，其中SEQ ID NO1包括編碼包含根據SEQ ID NO2的胺基酸序列的多肽的核苷酸序列，該寡核苷酸能夠抑制該多肽在表達該多肽的細胞中的表達。
2.根據權利要求
1的寡核苷酸，它與SEQ ID NO1中750位到900位包括750位和900位的核苷酸序列互補。
3.根據權利要求
1的寡核苷酸，它與SEQ ID NO1中1200位到1300位包括1200位和1300位的核苷酸序列互補。
4.根據權利要求
1的寡核苷酸，它與SEQ ID NO1中1400位到1500位包括1400位和1500位的核苷酸序列互補。
5.根據權利要求
1的寡核苷酸，它與SEQ ID NO1中1450位到1550位包括1450位和1550位的核苷酸序列互補。
6.根據權利要求
1的寡核苷酸，它與SEQ ID NO1中1850位到2000位包括1850位和2000位的核苷酸序列互補。
7.根據權利要求
1的寡核苷酸，它與SEQ ID NO1中2500位到2600位包括2500位和2600位的核苷酸序列互補。
8.根據權利要求
1的寡核苷酸，它與SEQ ID NO1中2850位到2950位包括2850位和2950位的核苷酸序列互補。
9.根據權利要求
1的寡核苷酸，它與SEQ ID NO1中3800位到3900位包括3800位和3900位的核苷酸序列互補。
10.根據權利要求
1的寡核苷酸，它選自SEQ ID NO3、SEQ IDNO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13和SEQ ID NO14。
11.一種藥物組合物，包括權利要求
1至10任一項限定的寡核苷酸與藥學上可接受的佐劑、稀釋液或載體。
12.一種權利要求
11的藥物組合物的製備方法，包括將權利要求
1至10任一項限定的寡核苷酸與藥學上可接受的佐劑、稀釋液或載體混合。
13.根據權利要求
1至10任一項的寡核苷酸用於治療。
14.根據權利要求
1至10任一項的寡核苷酸在製備用於治療的藥物中的應用。
15.一種治療患有膠原紊亂或存在膠原紊亂風險患者的膠原紊亂，或降低膠原紊亂風險的方法，包括給患者施與治療有效量的權利要求
1至10任一項限定的寡核苷酸或權利要求
11限定的藥物組合物。
專利摘要
本發明提供了能有效抑制野生型COL1A1基因表達的反義DNA寡核苷酸。
文檔編號C12N15/09GKCN1423695SQ00817282
公開日2003年6月11日 申請日期2000年12月12日
發明者R·貝裡 申請人:阿斯特拉曾尼卡有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan