針對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的單域抗體的製作方法

2023-06-04 06:55:06

專利名稱：針對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的單域抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及單域抗體技術(又稱為納米抗體技術)，以及基因工程抗體技術，特別 是涉及針對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DeoXynivalenol，D0N)的單域抗體或多肽。
背景技術：
單域抗體是指僅由普通抗體可變區(VH或VL)組成的基因工程抗體。單 域重鏈抗體(又稱為納米抗體，VHH抗體，variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody)是指僅由重鏈抗體(Heavy-chain antibodies)可變區(Variable region)組成的基因工程抗體，其中，重鏈抗體(Heavy-chain antibodies)是一種存在於 駱駝、鯊魚等動物中天然缺失輕鏈的抗體。單域抗體和單域重鏈抗體都具有分子量小、滲透 性好等特點，目前已廣泛用於基礎研究、醫學診斷和檢測、抗體藥物開發等領域。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又名嘔吐毒素(vomitoxin，VT)，屬 於單端孢黴烯族真菌毒素，主要是由某些鐮刀菌產生。該毒素常出現於穀物及其加工產品 中，許多國家和地區都檢測到了 DON的汙染。DON會引起動物增重下降、食慾減退、營養吸收 率降低，並影響免疫功能。大部分國家對食品、穀物、飼料中的DON含量都做了嚴格規定。目前，已有針對DON的多克隆抗體、單克隆抗體的公開報導。與單域重鏈抗體相 比，這些抗體存在生產成本相對較高，製備過程繁瑣等缺點。單域抗體具備分子量小、滲透 性好等性質，顯示出廣闊的應用前景。

發明內容
本發明的目的是提供針對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的單域抗體(包括含有所述單域 抗體全部或部分功能區域的蛋白質或多肽)及其胺基酸序列，可以被用於製備檢測或抑制 DON汙染的試劑和工具。本發明提供一種針對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的單域抗體，具有SEQ ID NO. :1所示的 胺基酸序列，其胺基酸序列的IMGT編號和結構域的劃分如圖1所示。本發明所提供的單域抗體包括4個框架區(Framework region,FR)和三個互補決 定區(Complementarity-determining region，CDR)，其中，框架區(FR1-FR4)分別選自 SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. :3，SEQ ID NO. :4 禾P SEQ ID NO. :5，互補決定區(CDR1-CDR3)分別 選自SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. :7和SEQ ID NO. :8。互補決定區主要負責抗原的識別，框 架區結構相對穩定，主要起著支撐維持蛋白質結構的作用。本發明提供一種蛋白質或多肽，其特徵是包含SEQ ID N0. :2，SEQ ID N0. :3， SEQID NO. :4和SEQ ID NO. :5中的一個或者兩個以上的胺基酸序列，且至少與一個胺基酸 序列具有90%同源性。本發明提供一種蛋白質或多肽，其特徵是包含SEQ ID N0. :6，SEQ ID NO. :7和 SEQ ID NO. :8中的一個或者兩個以上的胺基酸序列，且至少與一個胺基酸序列具有80%同 源性。
本發明還提供了一種核酸分子，其特徵是編碼SEQ ID NO. :1，SEQ ID NO. :2， SEQID NO. 3, SEQ ID NO. :4，SEQ ID NO. :5，SEQ ID NO. :6，SEQ ID NO. :7 禾口 SEQ IDN0. 8，通過遺傳密碼子可以隨時獲得該核酸分子的具體序列。本發明所提供的核苷酸序列或至少部分序列可以通過合適的表達系統進行表達 以得到相應的蛋白質或多肽。這些表達系統包括細菌，酵母菌，絲狀真菌，動物細胞，昆蟲細 胞，植物細胞，或無細胞表達系統。本發明還提供一種載體，包含所述核酸序列。由於遺傳密碼子具有簡併性，該核酸 序列可以根據不同的應用目的而不同。本發明還提供一種宿主細胞，包含所述蛋白質或多肽的表達載體。本發明還提供了一種淨化或檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的方法，其特徵是含有上述 蛋白質或多肽。基於本發明提供的蛋白質或多肽與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇特異性結合的能 力，建立脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的淨化或檢測方法。其中，優選的方法包括酶聯免疫吸附法 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)，焚光免疫法(Fluoroimmunoassay, FIA)， 免疫晶片法和親和層析法。本發明所提供的胺基酸序列可以作為前體，通過隨機或定點突變技術進行改造， 能夠獲得性質(水溶性、穩定性、親和力以及特異性等)更好的突變體，用來發展進一步用 於醫藥、工業、農業的蛋白質或多肽。例如將FR2中的V42、G49、P50和W52分別替換為F42、 E49、R50和G52，可得到具有更好的溶解性和穩定性的重鏈抗體化突變體。本發明中所敘述的一些術語具有如下含義同源性描述兩個或更多胺基酸序列的相似程度，第一個胺基酸序列和第二個氨 基酸序列之間同源性的百分比可以通過第一胺基酸序列中與第二胺基酸序列中相應位置 處的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的數量除以第一個胺基酸序列中胺基酸總數再乘以100%來計算，其中第二胺基酸序列中的某個胺基酸的缺失、插入、替換或添加(與第一 胺基酸相比)被認為是有差別。備選地，同源性百分比也可以利用已知的用於序列匹配的 計算機運算程序如NCBI Blast獲得。結構域蛋白質三級結構的基本結構單位，通常具有一定的功能。IMGT Ι :IMGT(The International ImMunoGeneTics Database) ψ ^ 一種已經標準化的抗體胺基酸序列編號方法。具體編號方法可以參考文獻(Ehrenmarm， F. , Q. Kaas, et al. (2010). 「 IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign :a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF. 「 Nucleic Acids Res 38 (Database issue) :D301-307. Lefranc, M. P.， C. Pommie, et al. (2003). " IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-Iike domains. " Dev Comp Immunol 27(1) :55-77.)中的描述。密碼子(codon)又稱為三聯體密碼(triplet code)，指對應於某種胺基酸的核 苷酸三聯體。在轉譯過程中決定該種胺基酸插入生長中多肽鏈的位置。


圖1胺基酸編號及結構域示意圖。
圖2間接phage-ELISA法測定噬菌體結合活性。縱坐標表示ELISA讀數計測定 450nm處吸光度值，橫坐標表示按照表1加樣，其中1表示實驗組，2表示背景對照，3表示空 白對照a，4表示空白對照b。圖3噬菌粒pHEN-D0NIV2結構圖。圖4表達質粒pRX3-D0NIV2結構圖。圖5親和層析純化單域抗體SDS-PAGE電泳圖。泳道M為低分子量蛋白標準，泳道 1為親和層析純化前細胞破碎上清，泳道2為親和層析純化後單域抗體D0NIV2。圖6融合表達質粒pAP-D0NIV2。
具體實施例方式下面通過單域抗體(多肽)的製備、分析以及應用，對本發明作進一步說明，這些 具體實施例不應以任何方式被解釋為限制本發明的應用範圍。應用實例1 抗DON單域抗體的淘選與鑑定。採用固相淘選的方法從駝源天然抗體噬菌體展示文庫NA-PDL中淘選針對DON的 單域抗體。參照文獻(鄧舜洲，遊淑珠，許楊.脫氧雪腐鐮刀菌烯醇人工抗原的研製[J]. 食品科學，2007，28 (2) 149-152.)製備DON的人工抗原D0N-MBSA，用PBS稀釋DON-MBSA至 50 100 μ g/mL,每孔加入100 μ L，4°C包被過夜，吸出包被液，PBS洗板3次，3% BSA-PBS在 37°C封閉2h，PBS洗板3次，加入噬菌體抗體庫100 μ L(約含2X IO11CFU)，37°C孵育1. 5h， 用PBST (含0. 5% Tween-20)洗板3次(逐輪增加1次)，再用TBS洗板10次(逐輪增加5 次)。以100 μ L洗脫液(甘氨酸-鹽酸，ρΗ 2. 2)洗脫吸附在酶標孔中的噬菌體，用50 μ L Tris-HCl (lmol/L,pH 8.0)中和洗脫物，取10 μ L用於滴度測定，其餘洗脫物擴增後用於下 一輪淘選。經四輪淘選後，採用輔助噬菌體ΚΜ13對隨機挑取的單克隆進行救援，分別得到展 示抗體可變區的噬菌體顆粒，再用間接ELISA法測定噬菌體顆粒的結合活性(圖2)，實驗設 定陽性對照、陰性對照及背景對照，具體加樣步驟見表1。表1間接phage-ELISA加樣表
實驗組 背景對照 空白對照a 空白對照b 包被 DON-MBSA BSA DON-MBSA BSA
權利要求
1.一種針對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的單域抗體，其具有SEQ ID NO. :1所示的胺基酸序 列的蛋白質或多肽，由4個框架區和3個互補決定區組成，其中，4個框架區分別由SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. :3，SEQ ID NO. :4 和 SEQ ID NO. :5 組成，3 個互補決定區分別由 SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. :7 和 SEQ ID NO. :8 組成。
2.根據權利要求1所述的蛋白質或多肽，其特徵是包含SEQID NO. :2，SEQ IDN0. :3， SEQ ID NO. :4和SEQ ID NO. :5中的一個或者兩個以上的胺基酸序列，且至少與一個氨基 酸序列具有90%同源性。
3.根據權利要求1所述的蛋白質或多肽，其特徵是包含SEQID NO. :6，SEQ IDN0. :7和 SEQ ID NO. :8中的一個或者兩個以上的胺基酸序列，且至少與一個胺基酸序列具有80%同 源性。
4.權利要求1、2或3所述的蛋白質或多肽在DON淨化和檢測中的應用。
5.權利要求1、2或3所述的蛋白質或多肽在檢測和清除DON汙染中的應用。
6.根據權利要求1、2或3所述的蛋白質或多肽，其特徵是所述蛋白質或多肽是抗體、抗 體片段或融合蛋白質。
7.一種編碼權利要求1、2或3中所述蛋白質或多肽的核酸。
8.一種含有權利要求7所述核酸序列的載體。
9.一種含有權利要求7所述核酸的原核或真核宿主細胞，其特徵是能夠表達權利要求 1、2或3中所述的蛋白質或多肽。
全文摘要
一種針對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的單域抗體和多肽，其具有SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列的蛋白質或多肽，本發明所提供的胺基酸序列可以作為前體，通過隨機或定點突變技術進行改造，能夠獲得性質(水溶性、穩定性、親和力以及特異性等)更好的突變體，用來發展進一步用於醫藥、工業、農業的蛋白質或多肽。
文檔編號C07K19/00GK102060924SQ201010544358
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月15日 優先權日2010年11月15日
發明者付金衡, 何慶華, 劉夏, 塗追, 許楊, 陶勇 申請人:南昌大佳科技有限公司