對柑桔大實蠅進行親緣關係和聚類分析的分子標記方法

2023-05-28 10:59:16

對柑桔大實蠅進行親緣關係和聚類分析的分子標記方法
【專利摘要】本發明一種對柑桔大實蠅進行親緣關係和聚類分析的分子標記方法，屬於分子標記【技術領域】。本發明利用7條RAPD引物和10對SRAP引物組合對柑桔大實蠅DNA進行PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳並拍照記錄結果，統計被檢測材料的擴增帶；用遺傳分析軟體進行分析，獲得個體之間的遺傳距離，根據個體間的遺傳距離聚類結果，繪製不同地理種群柑桔大實蠅的聚類圖，區分不同的類群。本發明反應穩定、擴增片段清楚、多態性高，構建了柑桔大實蠅種群遺傳多樣性的分子反應體系，能揭示其種群間的遺傳多樣性，能快速、準確地對柑桔大實蠅進行聚類分析，區分不同的種群，對於監測及防治柑桔大實蠅有重要意義。
【專利說明】對柑桔大實蠅進行親緣關係和聚類分析的分子標記方法 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發明屬於分子標記【技術領域】，涉及一種分子標記方法，尤其涉及一種對柑桔大 實蠅進行親緣關係和聚類分析的分子標記方法。 【背景技術】
[0002] 柑桔是世界第一大水果，年產量超過1億噸，約佔世界水果總產量的四分之一。目 前柑桔業已成為中國南方廣大地區、貧困山區和三峽庫區農村經濟支柱產業之一。柑桔大 實妮Bactrocera (Tetradacus)minax (Enderlein)俗稱"柑蛆"，又名柑桔大實妮，柑桔大果 蠅，被害果稱"蛆果"、"柑蛆"，是國際國內植物檢疫性有害生物。傳統的柑桔大實蠅鑑定方 法一直是以形態學為主要依據，但該方法在幼蟲期不能準確快速的檢測與鑑定出柑桔大實 蠅。搞清楚柑桔大實蠅不同地理種群之間的遺傳關係對柑桔大實蠅的系統鑑定很有必要， 因此需要發展一種能夠快速、準確的對柑桔大實蠅進行親緣關係分析和分類的方法。
[0003] RAPD(Random Amplified poloymorphic DNA)作為顯性分子標記，具有操作簡單、 快速，成本較低，對DNA的純度要求不高等特點，在種屬特異性鑑定等方面被廣泛地應用。 而 SRAP(Sequence_Related Amplified Polymorphism)標記是基於 DNA 分子標記技術的優 缺點基礎上發展起來的新的分子標記技術，其引物設計簡單，尤其是正向引物的CCGG和反 向引物的AATT核心序列對基因的0RF進行擴增，顯著提高了擴增結果與表型/基因型的相 關性，擴增產物因不同物種、不同基因型的內含子、啟動子與間隔長度不等而產生多態性， SRAP標記在物種種群遺傳結構及親緣關係分析中得到了廣泛的應用。
【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種對柑桔大實蠅進行親緣關係和聚類分析的分子標記方 法，有助於快速、準確地辨析區域間柑桔大實蠅種群的親緣關係，對柑桔大實蠅進行聚類分 析，區分不同的種群。
[0005] 本發明解決其技術問題採用的技術方案：一種對柑桔大實蠅進行親緣關係和聚類 分析的分子標記方法，包括如下步驟：
[0006] (1)提取待測柑桔大實蠅樣品的DNA，保存備用；
[0007] (2)用7條RAPD引物對步驟1得到的DNA進行PCR擴增，所述的7條RAPD引 物名稱和序列如下：1 :ACGCCAGAGG，2 :GAGCGAGGCT，3 :CAGGGGTGGA，4 :GGTCTGGTTG，S75 : GACGGATCAG, Y06 ：AAGGCTCACC, Y18 ：GCTGAGTCAG ；
[0008] (3)用10對SRAP引物組合對步驟1得到的DNA分別進行PCR擴增，所述的10 對 SRAP 引物組合名稱為：3F-1R，3F-2R，9F-1R，9F-3R，9F-2R，9F-11R，4F-10R，12F-11R， 10F-3R，10F-10R;其中，所述各引物序列如下：
[0009]
【權利要求】
1. 一種對柑桔大實蠅進行親緣關係和聚類分析的分子標記方法，其特徵在於：包括如 下步驟： (1) 提取待測柑桔大實蠅樣品的DNA，保存備用； (2) 用7條RAPD引物對步驟1得到的DNA分別進行PCR擴增，所述的7條RAH)引 物名稱和序列如下：1 :ACGCCAGAGG，2 :GAGCGAGGCT，3 :CAGGGGTGGA，4 :GGTCTGGTTG，S75 : GACGGATCAG, Y06 ：AAGGCTCACC, Y18 ：GCTGAGTCAG ； (3) 用10對SRAP引物組合對步驟1得到的DNA分別進行PCR擴增，所述的10對SRAP 引物組合名稱為：3F-1R，3F-2R，9F-1R，9F-3R，9F-2R，9F-11R，4F-10R，12F-11R，10F-3R， 10F-10R ;其中，所述各引物序列如下：
(4) 將步驟2、3得到的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳並拍照記錄結果，統計被檢測材 料的擴增帶，有帶計為" 1"，無帶計為"〇"，強帶和弱帶均計為" 1"，組成"0-1"數據矩陣；用 遺傳分析軟體進行分析，獲得個體之間的遺傳距離，根據個體間的遺傳距離聚類結果，繪製 不同地理種群柑桔大實蠅的聚類圖，區分不同的類群。
2. 根據權利要求1所述的對柑桔大實蠅進行親緣關係和聚類分析的分子標記方法， 其特徵在於：所述步驟2中的PCR反應體系為：總體積為25uL的PCR反應體系含1XPCR BufTer2.0yL、1.5mmol/yL MgCl21.5yL、500ymol/L dNTPsl.5yL、0.5ymoL/L 引物 1.(^1^、川了39酶0.4 4 1^、20叩/^1^0嫩模板1.(^1^補超純水至25 4 1^。
3. 根據權利要求1所述的對柑桔大實蠅進行親緣關係和聚類分析的分子標記方法， 其特徵在於：所述步驟3中的PCR反應體系為：總體積為25uL的PCR反應體系含1XPCR Buffer2. 0 μ L> 1. 5mmol/ μ L MgCl2l. 5 μ L、500 μ mol/L dNTPsl. 5 μ L、0. 5 μ moL/L 的上下遊 引物各1.(^1、川丁&9酶0.4以1^、20叩/^1^嫩模板1.(^1^補超純水至25 4 1^
4. 根據權利要求1所述的對柑桔大實蠅進行親緣關係和聚類分析的分子標記方法， 其特徵在於：所述步驟2中的PCR擴增程序為：94°C預變性5min ;94°C 60s，38°C 60s， 72°C 90s，共 32 次循環；72°C延伸 lOmin。
5. 根據權利要求1所述的對柑桔大實蠅進行親緣關係和聚類分析的分子標記方法， 其特徵在於：所述步驟3中的PCR擴增程序為：94°C預變性3min ;94°C 40s，63°C 40s， 72°C 60s，循環15次，每次循環退火溫度降低0. 5°C ;94°C 40s，55. 5°C 40s，72°C 60s，循環 25 次；72°C延伸 lOmin。
6. 根據權利要求1所述的對柑桔大實蠅進行親緣關係和聚類分析的分子標記方法，其 特徵在於：所述步驟4中的遺傳軟體分析採用DPS軟體，按Nei的方法計算相似係數和遺傳 距離，採用非加權配對算術平均法進行聚類分析。
【文檔編號】C12Q1/68GK104087664SQ201410315887
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月3日 優先權日:2014年7月3日
【發明者】劉浩強, 冉春, 李鴻筠, 叢林, 胡軍華, 姚廷山 申請人:西南大學柑桔研究所