拮抗赤黴病菌和菌核病菌的水稻內生固氮菌及其用途的製作方法

2023-05-27 21:32:56 1

專利名稱：拮抗赤黴病菌和菌核病菌的水稻內生固氮菌及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及拮 抗赤黴病菌和菌核病菌的水稻內生固氮菌及其用途。
背景技術：
氮肥是農業生產中最重要的生產資料之一。生產化學氮肥消耗大量能源，佔生產總成本的70% 80%。近年來能源日趨緊張，我國化肥生產用煤價格飈升導致化學氮肥價格上漲，農民難以承受，反響強烈。此外，化學氮肥在提高作物產量、保障我國糧食安全方面發揮了巨大作用，但是不合理施氮已經形成了嚴重的面源汙染，造成一系列的嚴重危害，如太湖藍藻事件令人觸目驚心。城市地下水硝酸鹽汙染已經對飲用水安全造成了威脅。大氣中含有78%的氮素，但其存在形式是分子態氮氣，動植物不能直接利用，自然界只有某些原核微生物具有直接利用大氣中氮氣的能力，將其還原成氨，這就是生物固氮作用。選用高效固氮微生物菌種工廠化生產製成菌劑，或進一步與其它富含植物營養的物料複合加工成生物製品，應用於農業生產，可以提供作物氮素營養，改善作物根際生態環境，提高土壤生物肥力性狀，這就是通常所說的固氮微生物菌劑或固氮微生物肥料。生物氮肥具有多種優勢①生物氮肥由可再生的生化製劑和活體微生物組成，可以再生，不存在資源枯竭問題，是可持續發展農資產品。②生物氮肥是環境友好型肥料，其生產和使用過程均不產生三廢等汙染性物質，而且能改善土壤理化性質，提高土壤肥力，是生態農業農資產品。③生物氮肥生產耗能少、成本低，其成本僅為等效化學氮肥的20% 40%，可以為國家節省大量的煤炭和石油等能源戰略物資。④使用生物氮肥可以顯著降低農業生產成本，提高農產品品質，提升土壤肥力，使農民受益，促進社會和諧發展。作物赤黴病的病原菌為玉米赤黴菌(Gibberella zeae)無性世代為禾穀鐮刀菌 (Fusarium graminearum)，是糧食作物的重要致病菌。我國小麥赤黴病有95%是麥類赤黴病菌引起的，是長江中下遊冬麥區和東北春麥區的重要病害，發病時經常造成20% 30% 的產量損失。此外，該菌還侵染玉米、水稻、大麥等作物，引起苗枯、莖腐、基腐、穗腐等。菌核病的病原菌是菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)，其形態特徵表現為子囊盤小， 呈小杯狀，淺肉色至褐色，單個或幾個從菌核上生出，直徑0. 5-lcm,柄褐色細長，彎曲，長 3-5cm，向下漸細，與菌核相連。菌絲體可以形成菌核，長柄的褐色子囊盤產生在菌核上。菌核形狀多樣，長3-15 μ m。子囊圓柱形，120-140 μ mX 11 μ m，孢子通常8個，單行排列，橢圓形，8-14 μ mX 4-8 μ m，側絲細長，線形，無色，頂部較粗。該菌是一種危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌，廣泛地侵染、危害十字花科、豆科、茄科、芸香科等植物，如造成油菜、大豆、向日葵、黃瓜、辣椒等經濟作物和蔬菜菌核病。目前對上述真菌病害的防治主要依靠化學農藥，然而化學防治不僅成本高、汙染環境，而且防效也不理想，同時食品的安全性也受到嚴重影響。菌種是微生物肥料生產應用的基礎。目前，限制我國微生物肥料行業發展的瓶頸就是高效菌種的選育問題。農業生產迫切需求固氮效能高、拮抗病原真菌、抗逆性強、貨架期長的微生物肥料生產用菌種。發明內容
本發明的目的是提供一株可以在水稻體內進行高效固氮，並且拮抗作物赤黴病病原菌玉米赤黴菌(Gibberella zeae)和作物菌核病病原菌核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)的細菌。本發明所提供的水稻內生固氮菌，是芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD223，該菌株已於2011年7月6日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC， 地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCC No. 5036。本發明的另一個目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為所述的芽孢桿菌 (Bacillus sp.)GDSD223 CGMCC No. 5036。該菌劑除包含作為活性成分的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD223 CGMCC No. 5036 夕卜，還可包括輔料，如草炭、動物的糞便、各類作物的秸稈、松殼、稻草、花生皮等。該菌劑可用於抑制病原真菌、防治植物真菌病害、固氮、產生固氮酶等。所述芽孢桿菌(Bacillussp. )GDSD223 CGMCC No. 5036 在製備下述 1)-4)中任一菌劑中的應用也屬於本發明的保護範圍1)用於抑制病原真菌的菌劑；2)用於防治植物真菌病害的菌劑；3)用於固氮的菌劑；4)產生固氮酶的菌劑。所述病原真菌可為通過土壤、施入土壤中的肥料、和/或種子傳播的真菌，具體可為引起赤黴病的真菌、或為引起菌核病的真菌；所述植物真菌病害可為赤黴病或菌核病。所述引起赤黴病的真菌可為玉米赤黴菌(Gibberella zeae)或禾穀鐮刀菌(Fusarium graminearum)；所述弓I起菌核病的真菌可為核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)。所述的芽孢桿菌(Bacillus sp. )GDSD223 CGMCC No. 5036或以芽孢桿菌 (Bacillus sp.)⑶SD223 CGMCC No. 5036為活性成分的菌劑在生產固氮酶中的應用以及在製備生物有機肥中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明的再一個目的是提供一種含有芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD223 CGMCC No. 5036或以芽孢桿菌(Bacillus sp. )GDSD223 CGMCC No. 5036為活性成分的菌劑的生物
有機肥。本發明的又一目的是提供一種培養芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD223 CGMCC No. 5036的方法，該方法包括將芽孢桿菌(Bacillus sp. )GDSD223 CGMCC No. 5036在培養芽
孢桿菌培養基中培養的步驟。本發明的又一目的是提供一種製備所述菌劑的方法，該方法包括如下步驟將所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD223 CGMCC No. 5036作為活性成分，得到所述菌劑。實驗證明，本發明是從土壤樣品中經過層層篩選，最終篩選出了芽孢桿菌 (Bacillus sp.)⑶SD223 CGMCC No. 5036，該菌株具有很高的固氮酶活性，能夠拮抗作物赤黴病病原菌玉米赤黴菌(Gibberella zeae)和菌核病病原菌核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)，競爭適應能力強，接種效果好，在固氮微生物菌劑和生物有機肥生產中具有廣闊的應用前景。保藏說明菌種名 稱芽孢桿菌拉丁名(Bacillus sp.)菌株編號GDSD223保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱CGMCC地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號保藏日期2011年7月6日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 503

圖 1 為芽孢桿菌(Bacillus sp. )GDSD223 CGMCC No. 5036 的固氮酶活性。圖2為芽孢桿菌(Bacillus sp. )GDSD223 CGMCC No. 5036拮抗玉米赤黴菌 (Gibberella zeae)。左側菌落為玉米赤黴菌(Gibberella zeae)，右側菌落為芽孢桿菌 (Bacillus sp.)GDSD223 CGMCC No. 5036。圖 3 為芽孢桿菌(Bacillus sp. )GDSD223 CGMCC No. 5036 拮抗菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum)。左側菌落為菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)，右側菌落為芽孢桿菌(Bacillus sp. )GDSD223 CGMCC No. 5036。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。多碳源低氮培養基(CCM)溶液I =KH2PO4 0. 2g，NaCl 0. lg, K2HPO4 0. 8g， Na2FeEDTA 28mg,鉬酸鈉25mg，酵母浸膏lOOmg，甘露醇5g，蔗糖5g，乳酸鈉0. 5mL,蒸餾水 900mL。溶液 II =MgSO4 ·7Η20 0. 2g，CaCl2 · 2Η20 0. 06g，蒸餾水 IOOmL0 將溶液 I、II 分別滅菌，冷卻至50°C左右混合，加入生物素(5 μ g/L)和維生素(10yg/L)各0. 5mL。無氮培養基蔗糖10g, NaCl 0. 12g，K2HPO4 · 3H20 0. 5g，CaCO3 lg, MgSO4 · 7H20 0. 2g，蒸餾水 lOOOmL，pH7. 2。改良固氮培養基成份蔗糖10g、K2HPO4 · 3H20 0. 5g、NaCl 0. 2g、CaCO3 lg、 MgSO4 · 7H20 0. 2g、酵母膏 0. 5g、蒸餾水 1000ml、瓊脂 1. 5% 2· 0%, pH7. 0 7· 2。圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum) ACCCl 1103 (參見「孫建光等.高效固氮芽孢桿菌篩選及其生物學特性.中國農業科學，2009，42 (6) :2043-2051」)。赤黴病菌-玉蜀黍赤黴菌(Gibberella zeae)(中國農業微生物菌種保藏管理中心，ACCC31053)。菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)(中國農業微生物菌種保藏管理中心， ACCC30046)。實施例1、水稻內生固氮菌⑶SD223的分離與鑑定一、水稻內生固氮菌⑶SD223的分離
水稻內生固氮菌的分離的具體操作如下取新鮮水稻植株(採自中國黑龍江省)，首先用自來水衝洗乾淨，然後依次用70%乙醇浸泡lmin，2%次氯酸鈉表面消毒滅菌 lOmin，無菌水衝洗3次。無菌操作條件下，準確稱取樣品10. Og，在無菌研缽內磨成糊狀，轉移、定容至100ml，繼續稀釋製成系列稀釋樣品，分別從10-4、10_5、10-6稀釋液中取0. Iml分別均勻塗布在上述CCM培養基和無氮培養基平板上，28°C倒置培養，3 4d後，挑取單菌落劃線純化，得到水稻內生固氮菌。同時，將表面消毒時最後一次洗滌水塗布在牛肉膏蛋白腖培養基上檢測確認植株樣品消毒徹底。將其中一株分離所得固氮菌命名為水稻內生固氮菌 ⑶SD223。二、水稻內生固氮菌⑶SD223的鑑定從以下幾個方面鑑定步驟一分離並純化得到的水稻內生固氮菌⑶SD223

1、形態學鑑定將處於對數生長期，且菌落大小穩定，上述步驟一分離並純化得到的固氮菌 GDSD223進行單菌落狀態描述，主要包括菌落的大小、顏色、透明度、溼潤度、菌落表面狀態 (是否平坦、突起、褶皺、凹陷等)、菌落邊緣狀態(是否整齊、不規則、放射狀等)。對於處於對數生長期的所述固氮菌⑶SD223，經塗片染色後採用光學顯微鏡觀察菌體的形態。結果表明，上述步驟一分離並純化得到的固氮菌GDSD223菌落圓形平鋪，乳白色， 有光澤，表面光滑，邊緣整齊；菌體杆狀，0. 5 X 2. 0 3. 0 μ m，有芽孢。2、生理生化特徵分析參考《常見細菌系統鑑定手冊》(東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑑定手冊.北京科學出版社，2011.)和《微生物學實驗》(沈萍，範秀容，李廣武.微生物學實驗(第三版).北京高等教育出版社，1999.)測定上述固氮菌⑶SD223的生理生化特徵。所述固氮菌⑶SD223的生理生化特徵測定結果如表1所示表1固氮菌⑶SD223的生理生化特徵
權利要求
1.芽孢桿菌(Bacillussp.)⑶SD223，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No. 5036。
2.一種菌劑，它的活性成分為權利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD223 CGMCC No. 5036。
3.根據權利要求2所述的菌劑，其特徵在於所述菌劑為下述1)-4)中任一的菌劑1)用於抑制病原真菌的菌劑；2)用於防治植物真菌病害的菌劑；3)用於固氮的菌劑；4)產生固氮酶的菌劑。
4.根據權利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillussp.)⑶SD223 CGMCC No. 5036在製備下述1)_4)中任一菌劑中的應用1)用於抑制病原真菌的菌劑；2)用於防治植物真菌病害的菌劑；3)用於固氮的菌劑；4)產生固氮酶的菌劑。
5.根據權利要求3所述的菌劑或權利要求4所述應用，其特徵在於所述病原真菌為引起赤黴病的真菌、或為引起菌核病的真菌；所述植物真菌病害為赤黴病或菌核病。
6.根據權利要求5所述的菌劑或應用，其特徵在於所述引起赤黴病的真菌為玉米赤黴菌(Gibberella zeae)或禾穀鐮刀菌(Fusarium graminearum)；所述引起菌核病的真菌為核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum。
7.權利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillussp. )GDSD223 CGMCC No. 5036或權利要求 2、3、5、或6所述菌劑在生產固氮酶中應用；或權利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillus sp. )GDSD223 CGMCC No. 5036或權利要求2、3、 5、或6所述菌劑在製備生物有機肥中應用。
8.含有權利要求1所述芽孢桿菌(Bacillussp. )GDSD223 CGMCC No. 5036或權利要求 2、3、5、或6所述菌劑的生物有機肥。
9.培養權利要求1所述芽孢桿菌(Bacillussp. )GDSD223 CGMCC No. 5036的方法，包括將芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD223 CGMCC No. 5036在用於培養芽孢桿菌的培養基中培養的步驟。
10.權利要求2、3、5或6所述菌劑的製備方法，包括如下步驟將權利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillus sp. )GDSD223 CGMCC No. 5036作為活性成分，得到所述菌劑。
全文摘要
本發明公開了拮抗赤黴病菌和菌核病菌的水稻內生固氮菌及其用途。該水稻內生固氮菌是芽孢桿菌(Bacillus sp.)GDSD223，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No.5036。本發明所提供的芽孢桿菌(Bacillus sp.)GDSD223 CGMCC No.5036具有較高的固氮活性，可以有效拮抗作物赤黴病菌(Gibberella zeae)和菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)，在固氮微生物菌劑和生物有機肥生產中具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/07GK102250810SQ201110197669
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月15日 優先權日2011年7月15日
發明者孫建光, 徐晶, 胡海燕, 高淼 申請人:中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所