一種t4dna聚合酶活性測定方法
2023-05-28 12:55:16 3
一種t4 dna聚合酶活性測定方法
【專利摘要】本發明公開了一種T4 DNA聚合酶活性測定方法，所述方法包括：在無dNTP存在的情況下，在以雙鏈線性DNA模板為底物的反應體系中加入T4 DNA聚合酶，反應完成後檢測雙鏈DNA的相對量，由此測出T4 DNA聚合酶的外切酶活性，並使T4 DNA聚合酶的外切酶活性與聚合酶活性相關，得到T4 DNA聚合酶的聚合酶活性程度。本發明通過便利地測量外切酶活性，利用T4 DNA聚合酶的外切酶活性與聚合酶活性的相關性測量聚合酶活性。與現有技術的方法相比，無放射性汙染，操作簡單快速，並且克服了外切酶活性對聚合酶活性測定的幹擾，得到的結果因此更準確。
【專利說明】-種T4 DNA聚合酶活性測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生化【技術領域】，具體來說涉及一種Τ4 DNA聚合酶活性測定方法。
【背景技術】
[0002] Τ4 DNA聚合酶由Τ4噬菌體聚合酶I基因編碼，具有5'_3'聚合酶活性以及3'_5' 外切酶活性。T4 DNA聚合酶是基因工程技術中一種重要的工具酶，可用於雙鏈DNA末端的 平滑化。在高通量測序（next generation sequencing)文庫構建的過程中，片段化的DNA 末端首先需要用T4 DNA聚合酶平滑化，再經過T4多聚核苷酸激酶加磷酸後，才能與雙鏈 DNA接頭進行連接。
[0003] 標準的T4 DNA聚合酶測活方法採用放射性同位素法。T4 DNA聚合酶可以催化將 32P標記的dNTP摻入到小牛胸腺DNA中。經過TCA沉澱、whatman濾紙過濾，通過測定酸不 溶性物質中放射性的含量，計算聚合酶活性。這種方法易產生放射性汙染，且步驟多、周期 長，難以實現高通量、自動化。
[0004] Seville 等（Biotechniques· 1996 Oct ;21 (4) : 664)建立了一種基於突光的 DNA 聚合酶活性測定方法，其原理如圖1所示。
[0005] DNA聚合酶可以M13單鏈環狀DNA為模板催化聚合反應，生成M13雙鏈環狀DNA。 雙鏈環狀DNA產物可以被雙鏈DNA特異性的picogreen染料結合，產生螢光，從而測定DNA 聚合酶活性。
[0006] 但是本發明人發現，這種方式不適用於T4 DNA聚合酶的活性測定。因為T4 DNA 聚合酶具有很強的3' -5'外切酶活性，在該測活體系中，3' -5'外切酶活性會在很大程度上 抵消聚合酶活性，造成聚合酶活性難以測定。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在於建立一種非放射性、簡便、快速的外切酶活性測定方法，其原理 如圖2所示。
[0008] 具體來說，本發明採用的是以下技術方案： 一種T4 DNA聚合酶活性測定方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟：在無 dNTP存 在的情況下，在以雙鏈線性DNA模板為底物的反應體系中加入T4 DNA聚合酶，反應完成後 檢測雙鏈DNA的相對量，由此測出T4 DNA聚合酶的外切酶活性，並使T4 DNA聚合酶的外切 酶活性與聚合酶活性相關，得到T4 DNA聚合酶的聚合酶活性程度。
[0009] 優選地，雙鏈DNA的相對量是利用螢光染料，例如僅與雙鏈DNA或僅與單鏈DNA結 合的螢光染料，通過螢光法測得的，並且雙鏈DNA的相對量是以螢光強度表示的。
[0010] 更優選，所採用的螢光染料是雙鏈DNA特異性螢光染料，更優選為市售的成熟商 用突光染料，例如picogreen染料。
[0011] 在一個實施方案中，本發明方法中所採用的雙鏈線性DNA模板是以λ DNA為底物， 在正向和反向引物的存在下通過PCR擴增獲得的線性雙鏈DNA，以便建立一種標準的測量 方法。
[0012] 在一個進一步的實施方案中，所用正向引物為5' -aataacgtcggcaactttgg-3'，反 向引物為 5' -gttacgccaccagtcatcct-3'。
[0013] 本發明的優點： 1. 無放射性汙染； 2. 操作步驟簡單快速，無需TCA沉澱、洗滌、乾燥、洗脫步驟；可實現高通量、自動化的 活性測定。
[0014] 3.建立了 T4 DNA聚合酶的外切酶活性和聚合酶活性的定量關係，通過方便的測 定外切酶活性，克服了外切酶活性對聚合酶活性測定的幹擾，測量結果更準確。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖1是現有技術中測定DNA聚合酶活性的技術原理圖。
[0016] 圖2是本發明的測定T4 DNA聚合酶活性的技術原理圖。
[0017] 圖3是現有技術的螢光法測定大腸桿菌pol I和T4 DNA聚合酶獲得的螢光酶活 曲線圖。
[0018] 圖4是利用本發明的方法測定T4 DNA聚合酶獲得的螢光酶活曲線圖。
[0019] 圖5是不同來源的T4 DNA聚合酶的螢光酶活曲線圖。
【具體實施方式】
[0020] 在dNTP缺失的情況下，T4 DNA聚合酶失去聚合活性，但保留強的3' -5'外切酶活 性，可從雙鏈DNA的兩個3'末端向內進行降解，表現出單純的核酸外切酶的活性。因為T4 DNA聚合酶的聚合酶活性和外切酶活性分屬不同結構域，（MICHELLE et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90，ρρ· 2579-2583，April 1993)，本發明人假設，其聚合酶活性和 外切酶活性的比例是一個恆定的值，可以通過測定其外切酶活性來推算出其聚合酶活性。 本發明首先建立了一種非放射性、簡便、快速的外切酶活性測定方法，其原理如圖2所示。
[0021] 如圖所示，在無 dNTP存在的情況下，T4 DNA聚合酶可以從雙鏈DNA的3'端開始 降解，從而降低雙鏈DNA的量。通過雙鏈特異性的picogreen染料就可以測定T4 DNA聚合 酶的外切酶活性。
[0022] 本發明人進一步證明了上述假設，從而建立了非放射性、簡便、快速的T4 DNA聚合 酶測定方法。
[0023] 下面將結合具體實施例來具體說明本發明。
[0024] 實施例1.螢光法測定T4 DNA聚合酶的聚合酶活性 M13模板/引物複合物的製備： M13 單鏈 DNA :M13mpl8 單鏈 DNA (NEB); 引物：M13 引物 5，-aagccatccgcaaaaatgacctct-3，； M13模板/引物複合物：將M13mpl8單鏈DNA同M13引物按摩爾比1:1混合，在退火緩 衝液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM NaCl)中，70°C加熱5分鐘後，緩慢降至室溫，使模 板引物退火。
[0025] 2.聚合酶反應
【權利要求】
1. 一種T4 DNA聚合酶活性測定方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟：在無dNTP 存在的情況下，在以雙鏈線性DNA模板為底物的反應體系中加入T4 DNA聚合酶，反應完成 後檢測雙鏈DNA的相對量，由此測出T4 DNA聚合酶的外切酶活性，並使T4 DNA聚合酶的外 切酶活性與聚合酶活性相關，得到T4 DNA聚合酶的聚合酶活性程度。
2. 如權利要求1所述的T4 DNA聚合酶活性測定方法，其特徵在於，雙鏈DNA的相對量 是利用螢光染料，通過螢光法測得的，並且雙鏈DNA的相對量是以螢光強度表示的。
3. 如權利要求2所述的T4 DNA聚合酶活性測定方法，其特徵在於，所採用的螢光染料 是雙鏈DNA特異性螢光染料。
4. 如權利要求3所述的T4 DNA聚合酶活性測定方法，其特徵在於，所採用的染料是 picogreen 染料。
5. 如權利要求1所述的T4 DNA聚合酶活性測定方法，其特徵在於，所採用的雙鏈線 性DNA模板是以入DNA為底物，在正向和反向引物的存在下通過PCR擴增獲得的線性雙鏈 DNA。
6. 如權利要求5所述的T4 DNA聚合酶活性測定方法，其特徵在於，所用正向引物為 5，-aataacgtcggcaactttgg-3，，反向弓I物為 5，-gttacgccaccagtcatcct-3，。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313132SQ201410502171
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月28日 優先權日:2014年9月28日
【發明者】徐曉昱, 劉來花, 王靜 申請人:南京諾唯贊生物科技有限公司