黃熱病毒螢光定量pcr檢測新方法及黃熱病毒檢測pcr體系的製作方法
2023-06-13 02:02:46
專利名稱：黃熱病毒螢光定量pcr檢測新方法及黃熱病毒檢測pcr體系的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物檢測領域，具體涉及黃熱病毒的快速定性和定量檢測方法及黃熱病毒檢測PCR體系，提供一對特異性引物和探針。
背景技術：
黃熱病是一種急劇性病毒病，是出血症的重要起因。每年全世界至少有20萬黃熱病病例，造成3萬人死亡。由於黃熱病的死亡率高及傳染性強，已納入世界衛生組織規定之檢疫傳染病之一。一些國家法律規定，到有地方病的地區的旅行者必須接種疫苗。只有少數幾種疾病有此「殊榮」，黃熱病是其一。黃熱病毒屬蟲媒病毒B組，為RNA病毒、呈球形、約 20-60納米。目前用於黃熱病毒的檢測方法已經有微孔雜交、晶片檢測、套式PCR等，這些方法各有千秋，但如果能用螢光定量PCR核酸檢測方法進行檢測，也不失為一種更加直觀、準確、快速的，適合早期診斷的檢測手段。
發明內容
本發明的目的在於提供一種黃熱病毒螢光定量PCR檢測新方法及黃熱病毒檢測 PCR體系，該方法能夠快速定性和定量檢測黃熱病毒，包括一對特異性更高、靈敏度高、重複性好的引物和探針。為實現上述目的，本發明黃熱病毒螢光定量PCR檢測新方法，該方法中設計採用的引物探針為
權利要求
1.黃熱病毒螢光定量PCR檢測新方法，其特徵在於，該方法中設計採用的引物探針為
2.如權利要求1所述的黃熱病毒螢光定量PCR檢測新方法，其特徵在於，該方法具體為1)設計引物探針；2)根據儀器選擇螢光素；3)合成引物和探針；4)製備陽性質粒標準品；5)運行PCR；6)數據分析；7)提取病毒RNA進行體系驗證。
3.如權利要求2所述的黃熱病毒螢光定量PCR檢測新方法，其特徵在於，所述步驟2) 中螢光素的供選擇的螢光發射基團有6-FAM、TET、HEX、J0E、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red，螢光淬滅基團有 BHQ-I、BHQ-2、Lowa Black RQ、Lowa Black FQ、Dabcyl。
4.如權利要求2所述的黃熱病毒螢光定量PCR檢測新方法，其特徵在於，所述步驟4) 中採取基因合成方式製作陽性質粒CBG2^-3作為陽性樣品將引物設計過程中篩選出的高保守區域bpll9-bp238前後分別延長30 50bp進行基因合成，然後將其克隆至pMD19_T 載體中，即為所述陽性質粒樣品，編號CBG2^-3。
5.如權利要求2所述的黃熱病毒螢光定量PCR檢測新方法，其特徵在於，所述步驟5) 中螢光定量PCR反應適用於所有螢光定量PCR反應儀。
6.權利要求2中所述的黃熱病毒螢光定量PCR檢測新方法，其特徵在於，所述螢光定量 PCR反應儀包括SmartCyclerII、ABI實時PCR系統、BioRad實時PCR檢測系統、Stratagene 定量多聚酶鏈反應儀。
7.如權利要求1所述的黃熱病毒螢光定量PCR檢測新方法，其特徵在於，所述步驟5) 中最佳擴增條件為95°C 60s950C 5s η56°C 30s } 45 循環。
8.一種黃熱病毒檢測PCR體系，其特徵在於，該體系包括引物或者其他能與黃熱全長序列特異性結合併擴增的等同引物，其相似同源性不能超過90%，引物序列如下
9. 一種黃熱病毒檢測PCR體系，其特徵在於，該體系包括引物及能與黃熱全長序列特異性探針，探針序列如下
全文摘要
本發明公布了一種黃熱病毒螢光定量PCR檢測新方法及黃熱病毒檢測PCR體系，由引物和探針、Premix Ex Taq反應液、滅菌Tris水組成，該引物和探針檢測特異性好，靈敏度高，非常適用於登革熱病毒，與黃熱病毒、乙型腦炎病毒無交叉反應。
文檔編號C12Q1/70GK102277446SQ20101060547
公開日2011年12月14日 申請日期2010年12月24日 優先權日2010年12月24日
發明者張曉龍, 楊宇, 王靜, 白琳, 胡孔新 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院