微量游離mRNA提取和富集方法
2023-06-22 09:56:31 2
專利名稱：微量游離mRNA提取和富集方法
技術領域：
本發明涉及一種醫學提取方法，特別涉及微量游離mRNA提取和富集方法。
背景技術：
近年研究發現，腫瘤患者血漿中的游離mRNA (cell-free mRNA)蘊含豐富的腫瘤信息，如CK19mRNA若在血清/血漿中檢出，可提示血中存在腫瘤細胞或已經發生了臨床影像學難以發現的微轉移；結腸癌患者腫瘤組織與血漿hTERT-AT mRNA表達水平呈顯著相關，且均能夠反映病情進展的程度，提示游離mRNA能夠客觀反映腫瘤信息；乳腺癌患者血漿游離CyclinDl和TS mRNA表達水平與乳腺癌患者預後及藥物治療療效相關。血漿游離核酸的發現與檢測為腫瘤的早期診斷、實時監控及實時個體化藥物治療提供了新的檢測來源。
但是，由於血漿中大量RNA酶的存在，血漿游離mRNA非常容易發生降解，且由於血液的稀釋作用，因此，每毫升血漿游離mRNA的量非常少(< lug)。在本發明之前，基於以上兩個主要原因，血漿游離mRNA的檢測存在檢出率很低，標本量需求大，重複性差等問題。因而，急需建立具備實際應用價值的敏感性高、特異性高、重複性好的微量游離mRNA抽提、富集與定量檢測技術，來達到對血液或其他液體中所含的微量游離mRNA的檢測，以滿足實際應用的需要。
發明內容
本發明的目的就在於解決上述問題，研製一種微量游離mRNA提取和富集方法。本發明的技術方案是微量游離mRNA提取和富集方法，其主要技術步驟在於(I)抽取含微量游離mRNA的液體，兩次離心，獲取上清；(2)取上清加入到Trizol LS溶液中，室溫震蕩；(3)向其中加入氯仿，劇烈震蕩；(4)離心，吸取水相層至新管；(5)加入70%乙醇，混勻；將含有乙醇和RNA的液體轉移到帶有濾網的收集管中，離心；(6)洗滌濾網和濾網上的RNA ；(7)離心，乾燥濾網和RNA ;(8)加無RNA酶水溶解RNA，離心；⑶加入DNA酶；(10)終止DNA酶反應，離心，獲得最終富集並純化的RNA,以其為模板，反轉錄為cDNA, -20°C保存。本發明的優點和效果在於發明了一種從少量液體(750ul)中抽提和富集微量(< lug)游離mRNA的方法，實時定量螢光PCR擴增證實相關目的基因的表達，並且顯著提高了微量游離mRNA的檢出率。本發明可從少量(750ul)血漿標本中擴增腫瘤相關基因，可從少量(750ul)血漿標本中擴增化療相關基因，操作方便，靈敏度高，特異性強，可重複性強。具體而言I.突破了傳統上從腫瘤組織或者腫瘤細胞中提取RNA的方法，開創性地成功從少量液體中抽提、富集並定量檢測了微量游離mRNA ；2.可從少量(750ul)血漿標本中擴增腫瘤特異性表達基因；3.可從少量(750ul)血漿標本中擴增相關腫瘤標記物,如CEA，CA199, CA125等；4.可從少量(750ul)血漿標本中擴增化療相關基因(如BRCA1、ERCCU hENTl、RRM1、TS、Topol、APTX 等)； 5.與目前已報導的游離mRNA檢測方法相比(目前文獻所報導的mRNA提取方法大多基於RNA沉澱技術或者是磁珠富集技術)，本方法檢出率高，靈敏度高，重複性強，特異性強，成本低，操作簡便，省時省力；6.與從腫瘤組織相關基因的mRNA定量檢測方法相比，本方法具有「實時」的巨大優點，且該方法靈敏度高，操作簡便，省時省力；7.與循環腫瘤細胞中相關基因的mRNA定量檢測方法相比，本方法無需繁瑣而複雜的循環腫瘤細胞的分離、富集、裂解等步驟，且檢出率高，靈敏度高，重複性強，操作簡便，省時省力。
圖I-部分血漿標本游離 BRCAl、ERCCl、hENTl、RRMl、TS、Topol 和 APTXmRNA 的
擴增示意圖。圖 2-BRCAI, ERCCI, hENTK RRMU TS, Topo I 和 APTX mRNA 在血漿的表達水平及
檢出率對比示意圖。
具體實施例方式本發明的技術步驟如下(I)所有物品均經去RNA酶處理；(2)將2ml血液加入O. 5ml 3. 8%枸櫞酸鈉溶液的無RNA酶管中；(3)3000g，4°C離心10分鐘，將上清轉移至新管；(4) 12000g,再次4°C離心10分鐘，吸取上清至新管；(5)取750ul上清，加入2250ul Trizol LS,室溫充分震蕩10分鐘，以到達充分降解核蛋白的作用；(6)每3ml血漿-Trizol LS混合物加入氯仿600ul，劇烈震蕩後室溫放置5分鐘；(7) 14000g，4°C離心15分鐘，吸取水相層至新管，該水相層中即為初步抽提的RNA ；(8)加入與水相層等體積的70%乙醇，並混勻；(9)將含有乙醇和RNA的液體轉移到帶有濾網的收集管①中(Ambion產品，貨號12183-018A)，700ul —次，12000g，室溫離心I. 5分鐘，棄去離心所得液體，然後反覆將剩餘的乙醇和RNA混合液體轉移到帶有濾網的收集管①中，直至所有混合液體均離心完畢。該步驟的目的是把所有RNA富集到濾網上；
(10)棄去收集管①，保留濾網，並將濾網放入另一乾淨的收集管②中，加入700ul洗滌劑wash buffer I (Ambion產品，貨號12183-018A)，12000g，室溫離心I. 5分鐘，以去除
殘留的乙醇。(11)棄去收集管②及管內液體，保留濾網，並將濾網放入另一新收集管③中，加入500ul 洗滌劑 wash buffer2 (Ambion 產品，貨號 12183-018A)，12000g，室溫離心 I. 5 分鐘，以去除殘留的洗漆劑wash bufferl ；(12)重複步驟(12);(13)棄去收集管③和其中殘餘液體，並將濾網放入另一乾淨的新收集管④中，14000g,室溫離心2. 5分鐘,達到乾燥濾網和濾網上RNA的目的；(14)棄去收集管④及管內液體，保留濾網，將濾網插入另一乾淨的新收集管⑤中，在濾網上加入33ul無RNA酶水，室溫孵育I分鐘，達到充分溶解濾網上RNA的目的；(15) 14000g，室溫離心3分鐘，此時濾網上的RNA全部離心至收集管⑤底部，得到抽提並富集的RNA ；(16)收集管⑤中加入10XDNA酶緩衝液6ul和I. 5ul DNA酶，混勻，37°C孵育30分鐘，達到去除潛在的微量DNA的目的，充分純化RNA ；(17)加入6ul DNA酶滅活劑，室溫放置後，11000g，4°C離心I分鐘，以滅活DNA酶；(18)吸取上清及為最終提取、富集並純化的RNA，以其為模板，按InvitrogenM-MLV反轉錄試劑盒說明操作反轉錄為cDNA, -20°C保存。採用Taqman-MGB探針技術實時螢光定量PCR檢測血漿微量游離BRCA1、ERCCUhENTl、RRMl、TS、Topol和APTX mRNA的表達(以β-actin為內參);所用探針及引物均為ABI產品(引物跨內含子設計，在擴增中避免了 DNA汙染的可能性)，相關基因的擴增證實了血漿微量游離mRNA的成功提取與富集(圖I)。圖I中橫坐標為PCR循環數，縱坐標為螢光強度。所有目的基因均得到有效擴增並被檢測出來；每次定量檢測均設有陽性和陰性對照，陰性對照未見擴增，排除了樣本DNA汙染的可能性。值得強調的是，本發明只用了少量(750ul)血漿標本就實現了微量目的基因的有效擴增和成功檢出，且顯著提高了血漿微量游離mRNA的檢出率——我們的方法使血漿TSmRNA的檢出率提高到了 92%，遠遠高於目前其他方法已報導的檢出率55% ;我們還從血漿中成功檢出了另外6個具有重要價值的生物標誌(BRCA1、ERCCl、hENTl、RRMl、Topol和APTX)，而這些基因由於其表達水平低，至今尚未有文獻報導能夠從血漿中成功檢測出來。這些基因在血漿中的表達水平及檢出率對比如圖2所示。我們的該項技術為血漿游離mRNA進一步的實驗室及臨床應用奠定了堅實基礎。
根據本發明原理及實驗數據，本發明也可以用於其他病種和其他微量游離mRNA的定量檢測。本發明請求保護的範圍並不僅僅局限於本具體實施方式
的描述。
權利要求
1.微量游離mRNA提取和富集方法，其步驟在於 (1)抽取含微量游離mRNA的液體，兩次離心，獲取上清； (2)取上清加入到TrizolLS溶液中，室溫震蕩； (3)向其中加入氯仿，劇烈震蕩； (4)離心，吸取水相層至新管； (5)加入70%乙醇，混勻；將含有乙醇和RNA的液體轉移到帶有濾網的收集管中，離心； (6)洗滌濾網和濾網上的RNA； (7)離心，乾燥濾網和RNA； (8)加無RNA酶水溶解RNA，離心； (9)加入DNA酶； (10)終止DNA酶反應，離心，獲得最終富集並純化的RNA，以其為模板，反轉錄為cDNA, -20°C保存。
2.根據權利要求I所述的微量游離mRNA提取和富集方法，其特徵在於步驟⑴中離心機先為3000g，4°C離心10分鐘，獲得上清後12000g，4°C離心10分鐘。
3.根據權利要求I所述的微量游離mRNA提取和富集方法，其特徵在於步驟(2)中取.750ul上清，加入2250ul Trizol LS溶液中，即上清與Trizol LS的體積比為I 3，上清的起始量為750ul。
4.根據權利要求I所述的微量游離mRNA提取和富集方法，其特徵在於步驟(8)中無RNA酶水的量為33ul。
5.根據權利要求I所述的微量游離mRNA提取和富集方法，其特徵在於步驟(9)中加入IOXDNA酶緩衝液6ul和I. 5ul DNA酶，37°C孵育30分鐘。
全文摘要
本發明涉及微量游離mRNA提取和富集方法。本發明是對含微量游離mRNA的液體離心取上清，加入到Trizol LS溶液中震蕩，加入氯仿，劇烈震蕩，離心，吸取水相層加入70％乙醇，混勻，轉移到RNA pure link mini kit收集管中離心，使用wash buffer1和2洗滌濾網和濾網上的RNA，離心，乾燥濾網和RNA，加無RNA酶水溶解RNA，離心，加DNA酶，終止DNA酶反應，離心，獲得最終富集並純化的RNA。本發明解決了血漿游離mRNA的檢測存在檢出率很低，標本量需求大，重複性差等缺陷。本發明從少量液體中抽提和富集微量(＜1ug)游離mRNA的方法，實時定量螢光PCR擴增證實相關目的基因的表達，並且顯著提高了微量游離mRNA的檢出率，操作方便，靈敏度高，特異性強，可重複性強。
文檔編號C12Q1/68GK102676500SQ201210083189
公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月26日 優先權日2012年3月26日
發明者劉寶瑞, 沈潔, 魏嘉 申請人:南京大學醫學院附屬鼓樓醫院